CC BY
41
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 611.811.018:599.323.4
ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ДОРСАЛЬНОГО ОТДЕЛА ГИППОКАМПА КРЫС НА ЭТАПАХ СТАРЕНИЯ С УЧЕТОМ ЭКСПРЕССИИ
СЕРИНОВОЙ РАЦЕМАЗЫ
А. В. Смирнов1-2, Н. В. Григорьева1, М. Р. Экова1, М. В. Шмидт12, Д. С. Медников1, И. Н. Тюренков1, Д. В. Куркин1, Е. В. Волотова1
1Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра патологической анатомии, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ, 2Волгоградский медицинский научный центр
Исследование заключалось в изучении структурных изменений в дорсальном отделе гиппокампа и особенностей экспрессии сериновой рацемазы у 12- и 24-месячных крыс. У 24-месячных старых животных обнаружены наиболее выраженные изменения в нейронах пирамидного слоя СА3 дорсального отдела гиппокампа, сочетающиеся со снижением уровня экспрессии сериновой рацемазы в дендритах st. radialis СА1 и СА3. Ключевые слова: гиппокамп, старение, крыса, сериновая рацемаза.
CHARACTERISTICS OF THE STRUCTURAL CHANGES OF DORSAL HIPPOCAMPUS CONSIDERING SERINE RACEMASE EXPRESSION IN AGING RATS
A. V. Smirnov12, N. V. Grigorieva1, M. R. Ekova1, M. V. Schmidt12, D. S. Mednikov1, I. N Tyurenkov1, D. V. Kurkin1, E. V. Volotova1
1 Volgograd State Medical University, Department of Pathological Anatomy, Department of Pharmacology and Biopharmaceutics HFC,
2VolgogradMedicalResearch Center
The study set out to examine the structural changes in the dorsal hippocampus and features of serine racemase expression in 12- and 24-month-old rats. In 24-month-old rats pronounced changes in pyramidal neurons of CA3 in the dorsal hippocampus were revealed. They were associated with reduced serine racemase expression in dendrites of st. radialis CA1 and CA3. Key words: hippocampus, aging, rat, serine racemase.
Современное общество характеризуется постоянным увеличением продолжительности жизни, которая достигается за счет прогресса в медицинской сфере, гигиене и питании. Это приводит к сопутствующему увеличению связанных с возрастом когнитивных нарушений, которые, в настоящее время, представляют одну из главных социальных, экономических и медицинских проблем [11]. Обширные исследования когнитивных функций стареющего организма, выполненные на животных моделях, свидетельствуют о том, что ухудшение памяти связано с нарушением способности головного мозга, а в частности гиппокампа, управлять Са2+-зависимой пластичностью, что приводит к разрыву синаптических связей между нейронами. Эта пластичность является основным свойством нейронных се-
тей, лежащих в основе формирования памяти [6]. Воз-растзависимый дефицит синаптической пластичности, вероятно, отражает сдвиг в работе глутаматных ^ме-тил^-аспартат рецепторов [7]. Тем не менее,
важность уменьшения плотности рецепторов, как это было предложено ранее [4], оспорена в исследовании линии крыс Lou/C/Jall, представляющих модель здорового старения [3]. У этих животных не наблюдалось очевидных возрастных нарушений памяти, несмотря на значительное снижение NMDA-R [8]. Интересно отметить, что нарушение активности NMDA-R и синаптической пластичности, которые отмечаются у старых крыс других штаммов [4], снижаются за счет насыщающей дозы D-серина. D-серин представляет собой эндогенный ли-ганд стрихнин-нечувствительного глицин-связывающего
Выпуск 3 (59). 2016
13 ^^^^
сайт NMDA-R [9] и синтезируется из L-изомера в ходе прямой реакции рацемизации, катализируемой серино-вой рацемазой (СР), ферментом, локализованном не только в астроцитах, но и в нейронах [12]. Так как инактивация СР влияет не только на синтез D-серина, но и на индукцию NMDAR-зависимой синаптической пластичности, а максимальная концентрация NMDA-R у крыс представлена в СА1 зоне гиппокампа, то особенности экспрессии сериновой рацемазы в гиппокампе играют важную роль в процессе старения.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучение структурных изменений в СА1 и СА3 дорсального отдела гиппокампа у 12- и 24-месячных крыс с учетом экспрессии СР
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проводилось на 20 нелинейных белых крысах-самцах в возрасте 12 и 24 месяцев (ФГПУ Питомник лабораторных животных «Рапполово») с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Были сформированы две группы по 10 животных в каждой. 1-я группа — крысы в возрасте 12 месяцев, 2-я группа — крысы в возрасте 24 месяцев. Животные содержались в стандартных условиях вивария с естественным 12-часовым све-то-темновым циклом (ГОСТ Р 50258-92). Эвтаназию проводили с помощью гильотинного метода с использованием «Гильотины для крыс» (AE0702, производитель «Open Science»). Головной мозг фиксировали в нейтральном забуференном 10%-м формалине. Парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, тионином по методу Ниссля. Определяли степень повреждения нейронов методом подсчета удельного количества сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы. Экспрессию СР определяли иммуногис-тохимическим методом с использованием полимерной системы (Thermo Scientific, Fremont, CA). В качестве первичных антител использовали моноклональные мышиные антитела к СР (Santa Cruz, Biotechnology, Inc. 1:50). Оценку изменений уровня экспрессии СР определяли путем подсчета удельного количества иммуно-позитивных нейронов, определения относительной площади иммунопозитивного материала в СА1 и СА3 с использованием программы «Видеотест-Морфо-4» (Россия), а также интенсивности окрашивания в баллах от 0 до 3 (0 — иммунонегативная реакция; 1 — слабо выраженное окрашивание; 2—умеренно выраженное окрашивание; 3 — максимально выраженное окрашивание). Исследование микропрепаратов проводилось с помощью микроскопа «Micros» (Austria), фотодокументирование осуществляли камерой «Olympus» (Japan). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Statistica 6,0 (StatSoft, USA). Обобщенные данные представляли в виде медианы (Me) с указанием интерквартильного интервала [Q1; Q3], где Q1 — 25 процентиль, Q3 — 75 процентиль.
Различия между группами оценивали по критерию Ман-на-Уитни (Mann-Whitney, U-test) и считали статистически значимыми при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При микроскопическом исследовании СА1 дорсального отдела гиппокампа у 12-месячных крыс нейроны пирамидного слоя характеризовались округлой формой перикариона с центрально расположенным ядром, как правило, с хорошо выраженным ядрышком. В цитоплазме отмечалось равномерное распределение пылевидной и мелкоглобулярной субстанции Ниссля. Большая часть нейронов характеризовалась нормохромной цитоплазмой перикариона. Признаки гиперхроматоза обнаруживались в небольшом количестве нейронов. Удельное количество сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы у 12-месячных животных составило 3,9 [1,7; 10,9] %. У 24-месячных крыс, по сравнению с 12-месячными животными отмечалось увеличение количества сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы до 7,1 [3,7; 15,0] % (р < 0,05) (рис. 1).
*р < 0,05 и ***р < 0,001 — различия между группами статистически значимы (критерий Манна-Уитни).
Рис. 1. Динамика изменения удельного количества сморщенных нейронов пирамидного слоя с гиперхроматозом цитоплазмы в СА1 и СА3 дорсального гиппокампа 12- и 24-месячных крыс
В СА3 нейроны пирамидного слоя располагались более рыхло, имели полигональную форму с четко визуализируемым везикулярным ядром и одним ядрышком. При этом у старых (24-месячных) крыс многие нейроны характеризовались уменьшением размеров и извитой формой перикарионов, с выраженной базофилией цитоплазмы. Удельное количество сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы составило 10,0 [6,8; 14,0] % у 12-месячных крыс и 29,6 [17,0; 41,5] % — у 24-месячных животных (р < 0,001) (рис. 1). В пирамидном слое наблюдался перицеллюлярный отек, в отдельных нейронах—явления вакуолизации цитоплазмы перикариона. Отмечалось уменьшение относительной
плотности нейронов, что свидетельствует об убыли нейронов пирамидного слоя [1].
В СА3 нейроны пирамидного слоя располагались более рыхло, имели полигональную форму с четко визуализируемым везикулярным ядром и одним ядрышком. При этом у старых (24-месячных) крыс многие нейроны характеризовались уменьшением размеров и извитой формой перикарионов, с выраженной базофилией цитоплазмы. Удельное количество сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы составило 10,0 [6,8; 14,0] % у 12-месячных крыс и 29,6 [17,0; 41,5] % — у 24-месячных животных (р < 0,001) (рис. 1). В пирамидном слое наблюдался перицеллюлярный отек, в отдельных нейронах—явления вакуолизации цитоплазмы перикариона. Отмечалось уменьшение относительной плотности нейронов, что свидетельствует об убыли нейронов пирамидного слоя [1].
При иммуногистохимическом исследовании дорсального отдела гиппокампа 12-месячных крыс с использованием антител против СР в СА1 отмечается умеренно выраженная цитоплазматическая экспрессия иммунопозитивного материала (ИПМ) (2 балла) в нейронах пирамидного слоя и в дендритах радиального слоя. У старых животных (24 месяца) наблюдалась слабо выраженная экспрессия ИПМ (1 балл) лишь в единичных дендритах радиального слоя при сохранении умеренно выраженной цитоплазматической экспрессии ИПМ (2 балла) в перикарионах нейронов пирамидного слоя (рис. 2).
Статистически значимых изменений удельного количества иммунопозитивных нейронов пирамидного слоя СА1 у 12- и 24-месячных крыс не обнаружено (р > 0,05). Отмечается изменение преимущественной локализации ИПМ в СА1 при старении: снижение уровня экспрессии ИПМ у 24-месячных крыс в дендритах радиального слоя и увеличение — в перикарионах нейронов пирамидного слоя. При этом суммарно в дендритах и перикарионах нейронов при компьютерном мор-фометрическом анализе наблюдается лишь тенденция к снижению относительной площади ИПМ (р > 0,05).
При оценке результатов иммуногистохимического исследования у 12-месячных крыс в СА3 дорсального отдела гиппокампа отмечается умеренно выраженная цитоплазматическая экспрессия ИПМ (2 балла) в перикарионах нейронов пирамидного слоя и в дендритах радиального слоя, окружающий нейропиль, характеризуется слабо выраженным окрашиванием (1 балл). При этом у 24-месячных крыс ИПМ локализован преимущественно в перикарионах нейронов пирамидного слоя (2 балла), однако, наряду с иммунопозитивными нейронами (2 балла), встречаются нейроны с иммунно-негативной реакцией, которые характеризуются сморщиванием перикарионов, базофилией цитоплазмы и наличием гиперхромных ядер овальной формы. Экспрессия ИПМ в радиальном слое СА3 носила умеренно выраженный характер (2 балла) в дендритах и слабо выраженный характер (1 балл) в окружающем нейропиле радиального слоя (рис. 3). Статистически значимых различий исследуемых параметров обнаружено не было.
Обнаруженные нами признаки структурных повреждений в нейронах пирамидного слоя СА1 и СА3 дорсального отдела гиппокампа у 24-месячных крыс могут быть связаны как с эксайтотоксическим действием высокой концентрации глутамата с вовлечением эк-страсинаптических NMDA-рецепторов GluN2B и активацией сигнальных нейрональных комплексов смерти (NDC) [10], так и с нарушениями кровообращения в сосудах микроциркуляторного русла гиппокампа [2], что рассматривается нами как результат ишемии, снижения нейротрофных и нейропротекторных факторов эндотелия сосудов.
Полученные нами данные свидетельствуют о воз-растзависимом снижении уровня экспрессии сериновой рацемазы в дендритах радиального слоя СА1 и СА3 дорсального отдела гиппокампа, что может быть связано с увеличением содержания NO в гиппокампе при старении [2], поскольку D-серин, выделяемый астроци-тами, индуцирует быстрое увеличение содержания NO в постсинаптических нейронах, а NO угнетает активность сериновой рацемазы [5].
Рис. 2. Гистологическое строение СА1 вентрального отдела гиппокампа крысы в возрасте 12 месяцев (А) и крысы в возрасте 24 месяцев (Б). Иммуногистохимическое исследование, антитела против сериновой рацемазы,
докраска гематоксилином. Ув. х 400
Выпуск 3 (59). 2016
15
I^FOpIÜ ©(Ш^ТМЩ;
Рис. 3. Гистологическое строение СА3 дорсального отдела гиппокампа крыс в возрасте 12 месяцев (А) и крыс в возрасте 24 месяцев (Б). Иммуногистохимическое исследование, антитела против сериновой рацемазы,
докраска гематоксилином. Ув. х 400
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в процессе старения у 24-месячных крыс по сравнению с 12-месячными животными, наряду с атрофическими изменениями, обнаруживается увеличение количества поврежденных нейронов, преимущественно, в пирамидном слое СА3 дорсального отдела гиппокампа, что сопровождается возраст-зависимым снижением уровня экспрессии сериновой рацемазы в дендритах st. radialis СА1 и СА3 и рассматривается как признак снижения NMDA-R зависимой синаптической пластичности в гиппокампе.
ЛИТЕРАТУРА
1. Смирнов А. В., Тюренков И. Н., Шмидт М. В. и со-авт. // Вестн. ВолгГМУ. — 2013. — Т. 46 (2). — С. 14—17.
2. Экова М. Р., Смирнов А. В., Шмидт М. В. и соавт. // Успехи геронтологии. — 2016. — Т. 29 (1) — С. 59—67.
3. Alliot J., Boghossian S., Jourdan D., et al. // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. — 2002. — Vol. 57. — P. 312—320.
4. Clayton D. A., Mesches M. H., Alvarez E, et al. // J. Neurosci. — 2002. — Vol. 22. — P. 3628—3637.
5. Darra E., Ebner F. H., Shoji K., et al. // Cent. Nerv. Syst. Agents. Med. Chem. — 2009. — Vol. 9 (4) — P. 289—294.
6. Dun Y., Duplantier J., Roon P., et al. // J. Neurochem. — 2008. — Vol. 104. — P. 970—978.
7. Foster T. C. // Aging Cell. — 2007. — Vol. 6. — P. 319—325.
8. Kollen M., Stephan A., Faivre-Bauman A., et al. // Neurobiol. Aging. — 2008. — doi: 10.1016/ j.neurobiolaging.2008.03.010.
9. Mothet J.-P., Rouaud E., Sinet P.-M, et al. // Aging Cell. — 2006. — Vol. 5. — P. 267—274.
10. Tu W XuX, Peng L., et al. // Cell. — 2010. — Vol. 140. — P. 222-234.
11. Turpin F. R., Potier B., Dulong J. R., et al. // Neurobiology of Aging. — 2011. — Vol. 32. — P. 1495—1504.
12. Wolosker H. // Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics. — 2011. — Vol. 1814. — P. 1558-1566.
Контактная информация
Экова Мария Рафаэлевна — аспирант кафедры патологической анатомии, Волгоградский государственный медицинский университет, e-mail: [email protected]
