CC BY
47
УДК 616.981.452
Л.М.Куклева, Г.А.Ерошенко, А.И.Павлова, Н.Ю.Шавина, Н.С.Солодовников, В.В.Кутырев
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ РАЗНЫХ ПОДВИДОВ ПО ПРИЗНАКАМ НИТРАТРЕДУКЦИИ, ФЕРМЕНТАЦИИ ГЛИЦЕРИНА И АРАБИНОЗЫ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Изучена коллекция природных штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, выделенных в различных очагах России и за рубежом, по фенотипическому проявлению и генетической детерминированности таксономических признаков нитратредукции, ферментации глицерина и арабинозы. Показано, что изученные штаммы основного и неосновных подвидов содержат интактный ген глицеро-3-фосфат дегидрогеназы (glpD) и обладают способностью ферментировать глицерин. Штаммы неосновных подвидов, в отличие от основного подвида, не проявляют нитратредуцирующей активности, несмотря на присутствие у них структурного гена нитратредуктазы (napA). Основной и все неосновные подвиды возбудителя чумы содержат ген регуляторного белка арабинозного оперона (araC), но штаммы алтайского и гиссарского подвидов не ферментируют ара-бинозу.
Ключевые слова: основной и неосновные подвиды Yersinia pestis, таксономия, нитратредукции, ферментация глицерина и арабинозы.
В основу современного разделения возбудителя чумы на биовары положено их географическое распространение и биохимические свойства (способность к ферментации глицерина, восстановление нитратов и др). Однако эта схема не отражает филогенетических взаимосвязей внутри вида Yersinia pestis [2, 3, 4], о чем свидетельствуют, в частности, результаты изучения штаммов, циркулирующих в двух природных очагах полевочьего типа на территории Китая, которые характеризуются избирательной вирулентностью и имеют существенные генетические и биохимические особенности, поэтому выделены в новый биовар microtus [8].
Используемая зарубежными исследователями схема классификации возбудителя чумы не учитывает многообразия и специфических особенностей штаммов, циркулирующих в природных очагах России и других стран СНГ, которые в 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба классифицированы как неосновные подвиды Y. pestis (алтайский, гиссарский, кавказский и улэ-гейский).
Одним из ведущих таксономических признаков возбудителя чумы является способность клеток к ферментации глицерина, которую обеспечивает фермент глицеро-3-фосфат дегидрогеназа. Такой активностью обладают штаммы биоваров antiqua и medievalis, тогда как отличительным свойством штаммов биовара orientalis является ее отсутствие. При анализе нуклеотидной последовательности штамма чумного микроба СО92 биовара orientalis выявлен дефектный ген глицеро-3-фосфат дегидрогеназы (glpD), несущий делецию размером 93 п.н. [7], что приводит к утрате 31 аминокислоты на N-конце белка GlpD и, по-видимому, обусловливает глицериннегативный фенотип штаммов биовара orientalis [6]. Другим дифференциальным признаком чумного микроба служит способность к восстановлению нитратов через нитрит до аммиака, с последующим включением его в метаболизм возбудителя. Этот процесс катализирует периплазматиче-
ский фермент нитратредуктаза (NAP), синтез которого детерминируется структурным геном napA [7]. Установлено, что штамм KIM биовара medievalis, неспособный к нитратредукции, несет мутацию в napA-гене, связанную с заменой 205 кодона GAA на TAA [5]. Штамм 91001 (нитрат негативный), отнесенный к биовару microtus, имеет замену 341 кодона GCC на ACC [8]. Особенностью «атипичных» штаммов, выделяемых в новый биовар microtus, а также штаммов алтайского и гиссарского подвидов Y. pestis является отсутствие у них ферментативной активности в отношении арабинозы. Арабинозный оперон чумного микроба содержит 6 генов, кодирующих ферменты, необходимые для ферментации этого углевода [7], и его функционирование запускается наличием в среде арабинозы. Регулятором этого процесса является белок AraC, кодируемый структурным геном araC. Штаммы биовара microtus, неспособные к ферментации арабинозы, несут делецию в этом гене размером 122 п.н. и вставку основания G в 773 позиции [8], что, по-видимому, является причиной инактивации белка AraC.
Целью настоящей работы явилось изучение особенностей проявления таксономически значимых признаков нитратредукции, ферментации глицерина и арабинозы штаммами основного и неосновных подвидов возбудителя чумы, выделенных на территории России и за рубежом.
Материалы и методы
В работе использовано 70 штаммов Y. pestis основного, алтайского, кавказского, улэгейского, гиссарского подвидов, таласские штаммы и зарубежные изоляты, принадлежащие к биоварам antiqua, medievalis и orientalis, а также 4 штамма псевдотуберкулезного микроба I и III серовара. Штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий, где они хранились в лиофильно высушенном состоянии.
Характеристика изученных природных штаммов возбудителя чумы
Биовары и подвиды Yersinia pestis Кол-во Место выделения Ферментация глицерина Нитратредукция Ферментация арабинозы
штаммов GlpD glpD NAP 1 napA AraC 1 araC
Зарубежные штаммы
Биовар
orientalis 5 Марокко, Индия, Вьетнам, Мадагаскар - - + + + +
medievalis 3 Индия, Монголия, Марокко + + + - + +
antiqua 3 Китай, Манчжурия, Кения Штаммы из России и стран СНГ + + + + + +
Подвид
основной 12 Тяньшанский, Устюртский, Прикаспийский, Забайкальский, Сарыджасский, Тувинский, Центрально-Кавказский + + + + + +
кавказский 9 Ленинаканский, Дагестанский, Зангезуро-Карабахский, Приараксинский + + + + + +
алтайский 10 Алтайский горный, Монголия + + - + - +
удэгейский 6 Монголия + + - + + +
гиссарский 10 Г иссарский горный + + -/+ * + - +
таласские штаммы** 9 Таласский горный + + - + - +
Yersinia pseudotuberculosis 4 Дальний Восток, Северо-Запад РФ, Туркмения + + + + + +
* Из 10 изученных штаммов гиссарского подвида 8 не проявляли способность к денитрификации, тогда как 2 обладали этой активностью. ** По мнению ряда исследователей, таласские штаммы слeдуeт выделить в отдельный подвид [2].
Все штаммы перед использованием культивировали в течение 24 ч при 28 °С на 1,5 % агаре LB (pH 7,2). Культуральные и биохимические свойства испытуемых штаммов определяли в соответствии с «Руководством по профилактике чумы» [1].
Препараты тотальной ДНК получали прогреванием при 100 °С бактериальной взвеси (концентрация - 107-108 м.к./мл) в дистиллированной воде в течение 30 мин с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 12 тыс. об/мин. Реакционная смесь (25 мкл) имела состав: 10mM Tris-HCl (pH 8,0); 2,5 mM MgCl2; по 0,2 тМ каждого из нуклеотидов dATP, dCTP, dGTP, dTTP; по 0,6 цМ каждого праймера; 5 ед. Taq ДНК-полимеразы (НИИ Генетика) и 10 мкл лизата испытуемого штамма.
Амплификацию фрагментов генов в ПЦР проводили на программируемом термостате «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва) по следующей программе: (94 °С 1 мин, 60 °С 1 мин 30 с, 72 °С 2 мин) х 30 циклов, затем 10 мин при 72 °С. В качестве матрицы в ПЦР использовали препараты тотальной ДНК штаммов Y. pestis. Синтез олиго-нуклеотидных праймеров осуществляли в НПФ «Литех» (Россия) на автоматическом синтезаторе ДНК «ACM-102U». Выявление дефектов в генах glpD, napA и araC осуществляли с использованием олигонуклеотидных праймеров, описанных ранее [5, 7].
Анализ ПЦР -продуктов осуществляли в 2 % агарозном геле (Bio-Rad) и регистрировали в УФ-свете. В качестве контроля молекулярной массы использовали коммерческие маркеры [GenRulerTM 50 bp DNA Ladder (MBI Fermentas)].
Результаты и обсуждение
Проведено изучение 70 штаммов основного подвида Y. pestis, выделенных в природных очагах чумы (Тяньшанский, Устюртский, Прикаспийский,
Забайкальский, Сарыджасский, Тувинский, Центрально-Кавказский); неосновных подвидов: кавказского (Ленинаканский, Дагестанский, Зангезуро-Карабахский, Приараксинский), алтайского (Алтайский, Монголия), улэгейского (Монголия), гиссар-ского (Гиссарский); таласских (Таласский); зарубежных штаммов, выделяемых в биовары antiqua, medievalis и orientalis (Азия, Африка). В работе использованы также штаммы Y. pseudotuberculosis I и III сероваров, выделенные от грызунов и людей, больных дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой (Дальний Восток, Северо-Запад России, Туркмения). Характеристика использованных штаммов и результаты проведенных исследований представлены в таблице.
Ферментация глицерина. Тестирование выборки штаммов возбудителя чумы на наличие дефекта внутри гена glpD проводили, используя праймеры glpD-F1 и glpD-R1, фланкирующие делецию в этом гене [6]. Результаты ПЦР-анализа показали, что среди изученных штаммов основного и неосновных подвидов, выделенных в природных очагах СНГ и Монголии, не обнаружено изолятов, принадлежащих к биовару orientalis. Об этом судили по способности штаммов к ферментации глицерина и наличию интактного гена glpD (таблица). В ПЦР выявляли фрагмент размером 505 п.н., идентичный обнаруженному в штамме Y. pestis KIM биовара medievalis (рис. 1).
У 5 изученных нами штаммов биовара orienta-lis, выделенных за рубежом, обнаружена делеция в гене glpD: в ПЦР выявляли фрагмент размером 415 п.н., который был идентичен описанному для штамма Y. pestis СО92.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что по фенотипическому проявлению и генетической детерминированности признака ферментации глицерина изученные штаммы основного и неосновных подвидов близки штаммам
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
415 п.н.
21 22 23 24 25 26 27 28 29
Рис. 1. Определение присутствия гена glpD в геноме природных штаммов возбудителя чумы:
1-3 - таласские штаммы; 4-5 - штаммы гиссарского подвида;
6, 27 - штаммы биовара orientalis; 7-9 - штаммы основного подвида; 10, 28 - отрицательный контроль; 11-14 - штаммы улэгейского подвида; 15-19 - штаммы алтайского подвида; 20-23 - штаммы кавказского подвида; 24-25 - штаммы биовара antiqua; 26 - штамм биовара medievalis; 29 - Y. pseudotuberculosis
биоваров medievalis и antiqua.
Нитратредукция. Изучение другого таксономически значимого признака - нитратредукции с помощью специфических праймеров на ген napA [8] показало, что все использованные штаммы основного подвида Y. pestis содержат неизмененный структурный ген (рис. 2), определяющий синтез нитратредуктазы, поскольку в ПЦР наблюдали образование фрагмента одинакового размера у всех изученных штаммов. Наличие интактного гена обусловливает фенотипическую экспрессию этого признака.
Аналогичная картина отмечена для штаммов кавказского подвида, выделенных от полевок в Закавказском высокогорном очаге чумы, и характеризующихся как наличием структурного гена napA, так и денитрифицирующей активностью (таблица).
При исследовании штаммов Y. pseudotuberculosis в ПЦР выявлен специфический амплификат, характерный для интактного гена napA (рис. 2), что обусловливает их способность к восстановлению нитратов.
Иная картина получена для алтайского и улэ-гейского подвидов, а также штаммов, выделенных в Таласском высокогорном очаге чумы от мышевидных грызунов. Эти изоляты не обладали способностью редуцировать нитраты, несмотря на присутствие гена napA. При наличии специфического ам-плификата в ПЦР фенотипическое проявление признака нитратредукции у них отсутствовало. По-видимому, выявленный дефект в гене не идентифицируется данными праймерами. В то же время выявлено два штамма гиссарского подвида, у которых обнаружена способность к денитрификации.
Дальнейшее сравнительное изучение нуклеотидной последовательности гена napA у штаммов с фенотипической характеристикой NAP и NAP- позволит выявить причины отсутствия способности редуцировать нитраты у штаммов алтайского, улэ-гейского, гиссарского подвида, а также таласских штаммов.
Утилизация арабинозы. Тестирование выборки штаммов возбудителя чумы и псевдотуберкулеза на наличие дефекта в гене araC проводили, используя специфические праймеры [8]. Анализ результатов
430 п.н.
Рис. 2. Определение присутствия гена napA в геноме природных штаммов возбудителя чумы:
1-3 - штаммы гиссарского подвида; 4-6 - штаммы улэгейского
подвида; 7-8 - таласские штаммы; 9 - отрицательный контроль;
10-12 - штаммы алтайского подвида; 13-15 - штаммы основного подвида; 16-17 - штаммы кавказского подвида
ПЦР показал, что все изученные штаммы содержали структурный ген регуляторного белка AraC. Не выявлено изолятов, имеющих делецию в гене araC, аналогичную обнаруженной у биовара microtus [8], несмотря на то, что в изученной выборке присутствовали штаммы алтайского и гиссарского подвидов, неспособные к ферментации арабинозы (таблица). Фенотипическое проявление этого признака у них отсутствовало, хотя в ПЦР выявляли специфический амплификат размером в 130 п.н. Таким образом, отсутствие способности к ферментации араби-нозы у штаммов алтайского и гиссарского подвидов обусловлено, по-видимому, другими причинами, чем у штаммов биовара microtus.
Отечественные и зарубежные исследователи используют различные схемы внутривидовой дифференциации Y. pestis, однако до сих пор не определено соотношение этих схем друг с другом и информационная значимость различных тестов, лежащих в их основе. Настоящая работа посвящена изучению генетической основы таксономически значимых признаков нитратредукции, ферментации глицерина и арабинозы у штаммов основного и неосновных подвидов Y. pestis, циркулирующих в
России и за рубежом. Способность к ферментации глицерина является надежным признаком, позволяющим дифференцировать штаммы биоваров medievalis и antiqua от биовара orientalis. Строгая корреляция отсутствия способности к ферментации глицерина у штаммов биовара orientalis с наличием делеции размером 93 п.н. в гене glpD, детерминирующем синтез глицеро-3-фосфат дегидрогеназы, позволила сделать заключение, что именно этот дефект обусловливает глицериннегативный фенотип штаммов восточного биовара [6]. Однако у некоторых глицериннегативных штаммов, выделенных в Северной Америке, присутствует другой дефект в пути утилизации глицерина. Это делеция размером 956-bp, затрагивающая гены glpK (глицеролкиназа) и glpX (неизвестный белок метаболизма глицерина), которая приводит к инактивации этих ферментов. Для штаммов нового биовара microtus, циркулирующих в ряде очагов Китая, показано наличие интактного ген glpD [8]. Проведенное изучение штаммов пяти подвидов возбудителя чумы и псевдотуберкулезного микроба из нашей коллекции показало, что все они фенотипически проявляют способность к ферментации глицерина и содержат интакт-ный ген glpD. Исключение составили штаммы из
Азии и Африки, неспособные разлагать глицерин. При анализе результатов ПЦР у этих штаммов выявлена делеция размером 93 п.н. Таким образом, полученные данные подтверждают тот факт, что способность к ферментации глицерина является надежным таксономическим критерием штаммов био-вара orientalis.
Отсутствие способности к нитратредукции является маркером штаммов биовара medievalis. Эта особенность обусловлена заменой одного нуклеотида в 205 кодоне гена napA, определяющем синтез периплазматической нитратредуктазы, что приводит к образованию стоп-кодона и отсутствию нит-ратредуцирующей активности [5]. Такая же особенность отмечена и для ряда штаммов, отнесенных к биоварам orientalis, antiqua, и некоторых пестоидов (по отечественной классификации - к неосновным подвидам) [3]. У штаммов вновь предлагаемого биовара microtus отсутствие нитратредуцирующей активности обусловлено другой мутацией - заменой нуклеотида в 341 кодоне, что приводит к замене аминокислоты в составе нитратредуктазы и инактивации фермента [8]. В результате наших исследований установлена фенотипическая и генетическая однородность штаммов основного подвида по признаку нитратредукции. В то же время штаммы неосновных подвидов (алтайского, гиссарского и улэ-гейского) фенотипически не проявляли нитратреду-цирующей активности, несмотря на присутствие тестируемого фрагмента гена napA. Аналогичные результаты представлены зарубежными исследователями, которые у ряда штаммов, относимых к пес-тоидам (по отечественной классификации - к неосновным подвидам) и не способных редуцировать нитраты, не выявили мутации в гене napA, характерной для штаммов биовара medievalis [4]. Неспособность к нитратредукции может быть обусловлена либо другими мутационными событиями в гене napA, либо низким уровнем экспрессии фермента нитратредуктазы [3, 8]. Для выяснения, какая из этих причин обусловливает неспособность к редукции нитратов у тех штаммов Y. pestis, у которых нами выявлена нуклеотидная последовательность гена нитратредуктазы, будет проведено определение нуклеотидной последовательности. Поскольку штаммы возбудителя псевдотуберкулеза, как и штаммы основного подвида возбудителя чумы, обладают способностью к нитратредукции, а штаммы неосновных подвидов лишены такой активности, по-видимому, нарушение гена napA произошло у штаммов неосновных подвидов уже после их отделения от общего ствола эволюции чумного микроба.
При изучении способности к ферментации ара-бинозы - признака, имеющего таксономическое значение, установлено, что эта активность отсутствует у штаммов гиссарского и алтайского подвидов. Известно, что это характерно также для штаммов био-вара microtus, у которых в структурном гене регуля-
торного белка арабинозного оперона (araC) выявлена делеция размером 122 п.н, обусловливающая их арабинозонегативный фенотип [8]. Однако при анализе нашей коллекции штаммов основного и неосновных подвидов чумного микроба не выявлено изолятов с таким дефектом гена araC. По-видимому, отсутствие способности к ферментации араби-нозы у штаммов алтайского и гиссарского подвидов обусловлено иными мутационными событиями, чем у биовара microtus. Ответ на этот вопрос может быть получен при секвенировании генов арабинозного оперона. Различный характер генетических изменений, обусловливающих неспособность к ферментации арабинозы штаммами алтайского и гиссарского подвидов, с одной стороны, и штаммами биовара microtus, с другой - не соответствуют высказанному мнению о том, что они составляют единую эволюционную ветвь [3].
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ ОФИ (проект № 07-04-00100-а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Руководство по профилактике чумы. - Саратов, 1992. - 278 с. - 2. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. // Мол. генет. - 2006. - № 2. - С. 9-19. - 3. Achtman M., Morelli G., Zhu P. et al. // PNAS. - 2004. - Vol. 101. - P. 1783717842. - 4. Chain P., Hu P., Malfatti et al. // J. Bacteriol. -2006. - Vol. 188. - P. 4453-4463. - 5. Deng W., Burland V., Plunkett G. et al. // J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184. - P. 46014611. - 6. Motin V., Georgescu A., Elliott J. et al. // J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184. - P. 1019-1027. - 7. Parkhill J., Wren B., Thomson K. et al. // Nature. - 2001. - Vol. 413. -P. 523-527. - 8. Zhou D., Tong Z., Song Y. et al. // J. Bacteriol. - 2004. - Vol. 186. - P. 5147-5152.
L.M.Koukleva, G.A.Yeroshenko, A.I.Pavlova, N.Yu.Shavina, N.S.Solodovnikov, V.V.Kutyrev
Characterization of Different Yersinia pestis Subspecies on the Basis of Nitrate Reduction,
Glycerol and Arabinose Fermentation
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
A collection of natural Yersinia pestis strains belonging to the main and minor subspecies and isolated in some focal plague infectious areas in Russia and abroad, was studied according to their phenotypic manifestations and genetic determination of their taxonomic characteristics, i.e., nitrate reducing, glycerol and arabinose fermentation activities. Both the main and minor subspecies of these strains were shown to contain an intact gene for glycero-3-phosphate dehydrogenase (glpD) and to be able of glycerol fermentation. In contrast to the main subspecies, the minor subspecies strains did not manifest any nitrate reducing ability despite the presence of the structural gene for nitrate reductase (napA). The main subspecies and all the minor plague agent strains were found to contain the gene for regulatory protein of arabinose operon (araC), on the other hand the strains of Altai and Ghis-sar subspecies showed no ability of arabinose fermentation.
Key words: the main and minor Yersinia pestis subspecies, taxonomy, nitrate reduction, glycerol and arabinose fermentation.
Поступила: 27.10.06.
