CC BY
134
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, № 2
ДНК- и клеточные технологии
УДК 636.2:576.3/.7.086.83:591.04
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА И ЖИРОВОЙ ТКАНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
И.М. ВОЛКОВА, Е.В. ВИКТОРОВА, И.П. САВЧЕНКОВА,
М.И. ГУЛЮКИН
Из костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖТ) крупного рогатого скота (КРС) выделены клеточные популяции с фенотипом, подобным мультипотентным мезенхимным стволовым клеткам (ММСК). Проведен сравнительный анализ свойств и признаков полученных популяций клеток. Установлено, что ММСК КРС, выделенные как из КМ, так и из ЖТ, способны формировать клетки жировой и костной ткани при культивировании в индукционных средах in vitro. Полученные результаты демонстрируют, что КМ и ЖТ сельскохозяйственных животных представляют собой важный источник ММСК, которые могут быть использованы в сельскохозяйственной и пищевой биотехнологии, ветеринарии, вирусологии.
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимные стволовые клетки, костный мозг, жировая ткань, культивирование, индукция, дифференцировка, крупный рогатый скот.
Keywords: multipotent mesenchymal stem cells, bone marrow, adipose tissue, cultivation, induction, differentiation, cattle.
В последнее время накапливаются данные о выделении из костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖТ) мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК). Наиболее интенсивно эти исследования проводятся у человека (1-4) и грызунов (5-6). Анализ сведений, представленных в научной литературе, показал, что работы по выделению ММСК из тканей и органов сельскохозяйственных животных только начинаются. На сегодняшний день имеются сообщения о выделении ММСК из КМ у крупного рогатого скота (КРС) (7-9), свиней (10-11), лошадей (12), овцы (13). Появилась информация о выделении клеток со свойствами и признаками ММСК из пуповинной крови лошадей (14) и КРС (15), из жировой ткани свиней (16).
Получение ММСК сельскохозяйственных животных представляет интерес в связи с их основными свойствами и признаками. Во-первых, достоверно установлено, что ММСК обладают способностью самообновляться in vitro без анеуплоидии, малигнизации, при этом они генетически стабильны, могут длительное время пролиферировать в культуре, формируя диплоидные клеточные линии. Во-вторых, при индукции к дифференци-ровке ММСК формируют in vitro клетки других тканей. Это делает их уникальным материалом для создания новых клеточных систем в сельскохозяйственной биотехнологии, ветеринарии и вирусологии. Доступность биологического материала (ЖТ и КМ), из которого можно выделить клетки со свойствами и признаками ММСК, обусловливает актуальность этого научного направления. ММСК имеют ряд достоинств, в числе которых способность расти на трехмерном носителе. Они могут заселять матрицу-носитель, дифференцироваться в заданном направлении и формировать трехмерные структуры, которые позволяют моделировать ту или иную ткань in vitro. Поэтому ММСК представляют собой перспективный объект для изучения сложных инфекционных механизмов, происходящих на клеточном и тканевом уровнях in vitro (17-18).
Кроме того, появились публикации по направленной дифференци-
ровке ММСК человека (19) и грызунов (20-21) в клетки мышечной ткани. Это новая и перспективная область исследований для различных целей — медицинских, ветеринарных, биологических и биотехнологических.
Одно из направлений сельскохозяйственной биотехнологии — пищевая биотехнология. Известно, что во многих странах ведутся работы по выращиванию in vitro мышечной ткани — так называемого «культурального мяса» (22). Подобные исследования проводятся и в России под руководством И.А. Рогова (23, 24). Использовать для этих целей диплоидные культуры клеток, полученных из тканей и органов млекопитающих, нецелесообразно из-за ограниченного периода их пролиферации in vitro (не более 50 цитогенераций) вследствие старения. Для непрерывного процесса наращивания клеточной биомассы в больших количествах необходимо иметь такой источник клеток, который будет длительное время пролиферировать in vitro. В этой связи перспективным представляется использование ММСК млекопитающих.
Целью наших исследований было выделение из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота клеток, подобных по фенотипу мультипотентным мезенхимным стволовым клеткам, и их сравнительная характеристика.
Методика. КМ (30 мл) получали от коров (возраст — 3 года) на мясокомбинате не позднее 30 мин после убоя, извлекая биологический материал из бедренной кости в стерильных условиях. Полученный образец КМ разбавляли в 4 раза физиологическим раствором, забуференным фосфатами без ионов Ca2+ и Mg2+ (ФСБ-2), с Li-гепарином («Sarstedt», Германия) и выделяли фракцию моноядерных клеток центрифугированием в течение 30 мин при 1000 g в градиенте фиколла (Ficoll-Paque, «Pharmacia», Швеция). Для выделения использовали методические наставления, разработанные нами ранее (25). Число выделенных клеток подсчитывали в камере Горяева. Клетки (1,1*106) высевали в культуральный флакон (площадь 25 см2). Основной для культивирования была среда DMEM (Dul-becco’s modified Eagle’s médium) с низким содержанием глюкозы (1 г/л), дополненная 10 % сыворотки плода коров (СПК) (HyClone, «Perbio», Бельгия) и антибиотиками (конечная концентрация стрептомицина — 100 мкг/мл, пенициллина — 100 ед/мл). Через 24 ч среду заменяли на свежую, прикрепившиеся клетки оставляли на доращивание.
ЖТ получали от тех же животных сразу после убоя. Клетки выделяли по методике, описанной нами ранее (25). Для этого ЖТ тщательно промывали ФСБ-2, измельчали маленькими острыми ножницами и скальпелем и подвергали ферментативной обработке 0,01 % раствором смеси коллагеназ типов I и II на основе DMEM при 37 °С в течение 30 мин. Коллагеназу нейтрализовали эквивалентным объемом питательной среды DMEM, дополненной 10 % СПК, и центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Клетки дважды переосаждали центрифугированием при 800 g в течение 10 мин и ресуспендировали в питательной среде. После последнего центрифугирования осадок ресуспендировали в DMEM и пропускали последовательно через фильтры с размером пор 80 мкм (для клеток стро-мально-васкулярной фракции), затем 10-7 мкм (для отбора стволовых клеток). После подсчета в камере Горяева полученные клетки (1,2*106) помещали в культуральный флакон (площадь 25 см2). Основной средой для культивирования MMСК из ЖТ была та же среда, что и для культивирования MMСК, выделенных из КM. Через 24 ч среду заменяли на свежую, прикрепившиеся клетки оставляли на доращивание; в дальнейшем среду меняли каждые 4 сут.
Эффективность клонообразования оценивали при посеве клеток (1*103) в культуральные флаконы (25 см2), рассчитывая отношение общего числа внесенных клеток к числу клонов, образовавшихся на 7-10-е сут. Жизнеспособность определяли по стандартной методике, используя окрашивание трипановым синим (0,1 % раствор). Морфологические характеристики ММСК изучали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа («Carl Zeiss AG», Германия) со специальным программным обеспечением (AxioVision Rel. 4.8). Основными критериями служили размер и форма клеток, ядерно-цитоплазматическое отношение, гомогенность цитоплазмы и наличие ядрышек в ядре. Оценку проводили как в нативных препаратах, так и в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Митотический индекс для каждой популяции клеток рассчитывали в фазу логарифмического роста как отношение числа митозов к общему числу подсчитанных клеток (не менее 1*106), умноженное на 1000 (%о).
Способность ММСК к направленной остео- и адиподифференци-ровке изучали согласно методике И.П. Савченковой с соавт. (25). Индукторами при остеогенной дифференцировке были дексаметазон («KRKA», Словения) (10-7 М), ß-глицерофосфат («Sigma», США) (10 мМ) и аскорбиновая кислота («Sigma», США) (0,2 мМ), при адипогенной — дексаметазон («KRKA», Словения) (10-7 М) и инсулин («Sigma», США) (10-9 М) (26). Эффективность формирования костной и жировой тканей in vitro как показатель остеогенной и адипогенной потенции ММСК из КМ и ЖТ оценивали на 21-28-е сут культивирования в индукторных средах.
Результаты. Известно, что ММСК, выделенные из КМ и ЖТ КРС, обладают сильной адгезией к культуральному пластику и высокой эффективностью формирования колоний. На 2-е сут культивирования мы наблюдали единичные прикрепленные к пластику клетки (рис. 1, а, б).
Популяции клеток, выделенных из КМ, были гетерогенны по морфологии. Проведенный анализ выявил присутствие трех типов клеток. Первый тип был представлен мелкими веретенообразными клетками диаметром 10-15 мкм с гомогенной цитоплазмой и низким ядерно-цитоплазматическим отношением. Второй тип включал клетки большего размера (15-20 мкм), более округлой формы, с гомогенной цитоплазмой и смещенным к одному краю клетки ядром. Третий тип характеризовался фибробластоподобной морфологией: плоские, крупные (около 60 мкм) распластанные клетки с многочисленными выростами цитоплазмы. Число клеток с определенной морфологией изменялось в процессе культивирования и зависело от начальной плотности посева. Время цитогенерации составило 24 ч. Культура выделенных клеток характеризовалась высоким митотическим индексом (45 %). Клетки пролиферировали и на 10-е сут образовывали монослой (см. рис. 1, в).
Клетки, выделенные из ЖТ, морфологически отличались от клеток, изолированных из КМ. В пределах популяции клеток, полученных из ЖТ, также были выявлены различия. Доминирующее положение занимали крупные (около 60 мкм) клетки с фибробластоподобной морфологией, в цитоплазме которых находилось много вакуолей и гранул. Небольшую часть составляла популяция маленьких (около 20 мкм) темных округлых клеток. Самая малочисленная популяция была представлена клетками, имеющими морфологию, которая оказалась сходной с таковой у клеток, выделенных из КМ, — мелкие (диаметр 10-15 мкм), узкие веретенообразные клетки с гомогенной цитоплазмой. Время цитогенерации составило 36 ч. Митотический индекс клеток, выделенных из ЖТ, равнялся 34 % , что ниже, чем у ММСК КМ. Клетки пролиферировали и на 10-е сут обра-
зовывали монослой (см. рис. 1, г).
Рис. 1. Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) крупного рогатого скота (КРС), выделенные из костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖТ), на разных этапах культивирования: а — ММСК из КМ КРС на 2-е сут культивирования; б — ММСК из ЖТ КРС на 2-е сут культивирования; в — монослой ММСК из КМ КРС на 10-е сут культивирования; г — монослой ММСК из ЖТ КРС на 14-е сут культивирования. Нативный препарат; увеличение х20 (объектив), х10 (окуляр).
При низкой плотности посева клетки, выделенные как из КМ, так и из ЖТ, были способны образовывать колонии фибробластоподобных клеток (рис. 2, а, б). Эффективность клонообразования для ММСК, выделенных из КМ и ЖТ, составила соответственно 93 и 88 %.
Рис. 2. Клонообразующие потенции мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) крупного рогатого скота (КРС): а — колония ММСК из КМ КРС на 7-е сут культивирования; б — колония ММСК из ЖТ КРС на 9-е сут культивирования. Нативный препарат; увеличение х20 (объектив), х10 (окуляр).
На 3-м пассаже клетки анализировали на наличие потенции к направленной цитодифференцировке. При культивировании в среде, инду-
цирующей остеодифференцировку, морфологические изменения в клетках, выделенных из КМ, наблюдали на 14-е сут культивирования, в то время как в клетках, выделенных из ЖТ, эти изменения были обнаружены только на 28-е сут. Визуальная оценка подтверждалась окраской экспериментальных образцов по von Kossa (рис. 3, а). Полученные нами данные согласуются с результатами других авторов (2, 7, 8, 10, 13).
Рис. 3. Направленная дифференцировка мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) крупного рогатого скота (КРС) в клетки костной и жировой тканей: а — ММСК из костного мозга КРС на 21-е сут культивирования в остеогенной среде (окраска по von Kossa); б — ММСК из жировой ткани КРС на 21-е сут культивирования в адипогенной среде (видны липидные везикулы). Увеличение Х20 (объектив), Х10 (окуляр).
При культивировании в среде, индуцирующей адипогенную диф-ференцировку, морфологические изменения в клетках, выделенных как из КМ, так и из ЖТ, наблюдали на 21-24-е сут культивирования. Адиподиф-ференцировка сопровождалась появлением кластеров клеток, в которых были выявлены липидные везикулы (см. рис. 3, б).
Таким образом, клетки, выделенные нами из двух типов тканей крупного рогатого скота (костный мозг и жировая ткань) представляют собой мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК). Полученные клеточные популяции имеют свойства и признаки, характерные для ММСК. Наши исследования продемонстрировали, что эти клетки способны при индукции формировать клетки костной и жировой ткани in vitro и представляют собой перспективный материал для сельскохозяйственной биотехнологии.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Т е п л я ш и н А.С., К о р ж и к о в а С.В., Ш а р и ф у л л и н а С.З., Ч у п и к о-
в а Н.И., Р о с т о в с к а я М.С., С а в ч е н к о в а И.П. Характеристика мезенхи-
мальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани. Цитология, 2005, 47(2): 130-135.
2. С а в ч е н к о в а И.П., Р о с т о в с к а я М.С., Ч у п и к о в а Н.И., Ш а р и ф у л-
л и н а С.З., Т е п л я ш и н А.С. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных
стромальных клеток, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека, в клетки костной ткани. Цитология, 2008, 50(10): 855-860.
3. Z u k P.A., Z h u M., A s h j i a n P., D e U g a r t e D.A., H u a n g J.I., M i z un o H., A l f o n s o Z.C., F r a s e r J.K., B e n h a i m P., H e d r i c k M.H. Human
adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell, 2002, 13(1): 4279-4295.
4. P i t t e n g e r M.F., M a c k a y A.M., B e c k S.C., J a i s w a l R.K., D o u g l a s R.,
M o s c a J.D., M o o r m a n M.A., S i m o n e t t i D.W., C r a i g S., M a r s h a k D.R.
Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 1999, 284(5411): 143-147.
5. L e n n o n D.P., C a p l a n A.I. Isolation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol., 2006, 34(11): 1606-1607.
6. D a S i l v a M e i r e l l e s L., N a r d i N.B. Murine marrow-derived mesenchymal stem cells: isolation, in vitro expansion, and characterization. British J. Hematol., 2003,
123(4): 702-711.
7. B o s n a k o v s k i D., M i z u n o M., K i m G., T a k a g i S., O k u m u r a M., F u j i n a g a T. Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Tissue Res., 2005, 319(2): 243-253.
8. D o n o f r i o G., F r a n c e s c h i V., C a p o c e f a l o A., C a v i r a n i S., S h e l-d o n M.I. Bovine endometrial stromal cells display osteogenic properties. Reprod. Biol. Endocrinol., 2008, 6: 65.
9. K a t o Y., I m a b a y a s h i H., M o r i T., T a n i T., T a n i g u c h i M., H i g a-
s h i M., M a t s u m o t o M., U m e z a w a A., T s u n o d a Y. Nuclear transfer of adult bone marrow mesenchymal stem cells: developmental totipotency of tissue-specific stem cells from an adult mammal. Biology of Reproduction, 2004, 70: 415-418.
10. B o s c h P., P r a t t S.L., S t i c e S.L. Isolation, characterization, gene modification, and nuclear reprogramming of porcine mesenchymal stem cells. Biology of Reproduction, 2006, 74(1): 46-57.
11. R i n g e J., K a p s C., S c h m i t t B., B u s c h e r K., B a r t e l J., S m o l i a n H.,
S c h u l t z O., B u r m e s t e r G.R., H a u p l T., S i t t i n g e r M. Porcine mesenchymal
stem cells: induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell Tissue Res., 2002, 307(3): 321-327.
12. S m i t h R.K., K o r d a M., B l u n n G.W., G o o d s h i p A.E. Isolation and implantation of autologous equine mesenchymal stem cells from bone marrow into the superficial digital flexor tendon as a potential novel treatment. Equine Vet. J., 2003, 35(1): 99-102.
13. R e n t s c h C., H e s s R., R e n t s c h B., H o f m a n n A., M a n t h e y S.,
S c h a r n w e b e r D., B i e w e n e r A., Z w i p p H. Ovine bone marrow mesenchymal stem cells: isolation and characterization of the cells and their osteogenic differentiation potential on embroidered and surface-modified polycaprolactone-co-lactide scaffolds. In vitro Cell. Dev. Biol. - An., 2010, 46(7): 624-634.
14. K o c h T.G., H e e r k e n s T., T h o m s e n P.D., B e t t s D.H. Isolation of mesenchymal stem cells from equine umbilical cord blood. BMC Biotechnology, 2007, 7: 26.
15. R a o u f i M.F., T a j i k P., D e h g h a n M.M., E i n i F., B a r i n A. Isolation and
differentiation of mesenchymal stem cells from bovine umbilical cord blood. Reprod. Domes.
Anim., 2011, 46: 95-99.
16. Q u C., Z h a n g G., Z h a n g L., Y a n g G. Osteogenic and adipogenic potential of porcine adipose mesenchymal stem cells. In vitro Cell. Dev. Biol. — An., 2007, 43(2): 95-100.
17. C а в ч e н к о в а И.П., Г у л ю к и н М.И. Перспективы использования стволовых клеток в ветеринарии. Ветеринария, 2011, 7: 3-5.
18. Т е п л я ш и н A.C., К о р ж и к о в а С.В., Ш а р и ф у л л и н а C.3., Р о с т о вс к а я M.C., Ч у п и к о в а Н.И., В а с ю н и н а Н.Ю., A н д р о н о в а Н.В., Т р е-
щ а л и н а Е.М., C а в ч е н к о в а И.П. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека в клетках хрящевой ткани при культивировании их в трехмерных матриксах OPLA. Цитология, 2007, 49(7): 544-551.
19. P i t t e n g e r M.F., M a r t i n B.J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ. Res., 2004, 95: 9-20.
20. M a k i n o S., F u k u d a K., M i y o s h i S., K o n i s h i F., K o d a m a H., P a n J., S an o M., T a k a h a s h i T., H o r i S., A b e H., H a t a J., U m e z a w a A., O g a-
w a S. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J. Clin. Invest., 1999, 103(5): 697-705.
21. F u k u d a K. Use of adult marrow mesenchymal stem cells for regeneration of cardiomyocytes. Bone Marrow Transpl., 2003, 32(l): 25-27.
22. V e i n J. Method for producing tissue engineered meat for consumption. United States Patent, 2004 Dec., Patent No.: US 6,835,390 B1. http://www.google.com/patents?vid=6835390.
23. Р о г о в И.А., В а л и х о в А.Ф., Д е м и н Н.Я., К р о х а Н.Г., Л и с и ц ы н А.Б.,
C е м е н о в Г.В., Т и т о в Е.И., Т у т е л ь я н В.А., Р о г о в СИ., Э р н с т Л.К.
^особ получения мясного продукта. Патент № 2314719 Российская Федерация МПК7 C12N 5/06, A 23 L 1/31. № 2006119540. Заявл. 06.06.2006. Опубл. 20.01.2008. Бюл. № 2.
24. Р о г о в И.А., В о л к о в а И.М. Получение клеток мышечной ткани in vitro, используя мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (MMCK) крупного рогатого скота. Мат. VI Московского межд. конгр. «Биотехнология: состояние и перспективы развития», М., 2011, т. 2: 155.
25. C а в ч е н к о в а И.П., Э р н с т Л.К., Г у л ю к и н М.И., В и к т о р о в а Е.В. Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков. М., 2010.
26. M i n g u e l l J.J., E r i c e s A., C o n g e t P. Mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.Y.), 2001, 226(6): 507-520.
ГНУ Всероссийский НИИ экспериментальной Поступила в редакцию
ветеринарии им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии, 20 сентября 2011 года
109428 г. Москва, Рязанский просп., 24, корп. 1, e-mail: [email protected]
CHARACTERISTIC OF MESENCHYMAL STEM CELLS, ISOLATED FROM BONE MARROW AND FATTY TISSUE OF CATTLE
I.M. Volkova, E.V. Viktorova, I.P. Savchenkova, M.I. Gulyukin S u m m a r y
From bone marrow (BM) and fatty tissue (FT) of cattle the authors isolated the cell populations with phenotype, similar to multipotent mesenchimal stem cells (MMSC). The comparative analysis was made for the properties and the features of isolated cell populations. It was established, that cattle MMSC, isolated from BM and FT, capable to form the cells of bone and fatty tissues at the cultivation in induction media in vitro. The obtained results suggested that cattle BM and FT are important source of MMSC, which can be used in agricultural and food biotechnology, veterinary, virology.
Вниманию читателей!
Подписку на журнал «Сельскохозяйственная биология» на 2012 год можно оформить через почтовое отделение
Информация о нашем издании помещена в Объединенном каталоге «Российские и зарубежные газеты и журналы»
Индекс — 70804
С 1989 года журнал выходит отдельными сериями:
— серия «Биология растений» (№№ 1, 3 и 5),
— серия «Биология животных» (№№ 2, 4 и 6).
Профиль журнала остается прежним.
На журнал можно также подписаться через редакцию. Для этого необходимо перевести деньги на расчетный счет редакции
& Институты и организации перечисляют деньги на счет редакции.
& Индивидуальные подписчики почтовым переводом перечисляют деньги на счет
редакции. Квитанцию с указанием точного адреса (индекс обязателен), на который нужно выслать журнал, необходимо переслать в редакцию.
& Стоимость подписки на I полугодие — 484 руб. за один номер с учетом НДС 10 %.
Срок подписки не ограничен
Банковские реквизиты редакции:
Получатель — ИНН 7708051012 Редакция журнала «Сельскохозяйственная биология», Марьинорощинское ОСБ 7981, г. Москва, р/с 40703810638050100603 Банк получателя — Сбербанк России ОАО, г. Москва, БИК 044525225, к/с 30101810400000000225
Адрес редакции: 127434 г. Москва, Дмитровское ш., д. 11, офис 343
Адрес в Интернете: www.agrobiology.ru E-mail: [email protected]
Редакция журнала «Сельскохозяйственная биология» выполняет рассылку электронных оттисков опубликованных статей
Для получения электронного оттиска Вам необходимо:
отослать точное описание заказа (авторы и название статьи, год, номер журнала, страницы) по адресу [email protected], указав Ваши фамилию, имя, отчество (полностью), город, где проживаете, контактные e-mail и телефон;
❖ получить из редакции по своему контактному e-mail подтверждение заказа (с присвоенным ему номером);
❖ оплатить услугу, указав в платежном документе в графе «Назначение платежа» присвоенный заказу номер и Ваши фамилию, имя, отчество.
Оттиски высылаются на Ваш контактный e-mail после зачисления оплаты на счет редакции.
Банковские реквизиты редакции:
Получатель: Банк получателя:
ИНН 7708051012 Редакция журнала «Сельскохозяйственная Сбербанк России ОАО г. Москва,
биология», Марьинорощинское ОСБ 7981, г. Москва, БИК 044525225,
р/с 40703810638050100603 к/с 30101810400000000225
В назначении платежа укажите номер заказа, Ваши фамилию, имя, отчество.
Стоимость услуги:
один оттиск — 120 р., не более шести оттисков (абонемент) — 360 р., не более двенадцати оттисков (абонемент) — 700 р. Цены приведены с учетом НДС 10 %. Абонементное обслуживание предполагает предоставление указанного числа оттисков за период не более каждого текущего года по предоплате.
E-mail для заказа электронных оттисков — [email protected]
© Электронные оттиски являются интеллектуальной собственностью редакции журнала «Сельскохозяйственная биология». Внесение в них каких бы то ни было изменений и дополнений не допускается. Перепечатка, тиражирование, размещение в средствах информации, в том числе электронных и сети Интернет, а также коммерческое распространение возможны только с разрешения редакции.
