CC BY
20
350 Clinical Medicine, Russian journal. 2017; 95(4)
_DOI http://dx.doi.org/10.18821/0023-2149-2017-95-4-350-354
Original investigations
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 Удк 616.132-007.271-003.84-076
Гуляев н.и.1, жуков М.В.2'5, Голубок А.о.2'5, Куранов Г.Л.3, Борисов Ю.А.4, Суглобова Е.д.4, Кузнецов В.В.1, Перемышленко А.С.1, Гордиенко А.В.1, Костина о.В.1
характеристика адгезивных свойств эндотелия и субэндотелиальных структур аортальных полулуний у больных c кальцинирующим аортальным стенозом
'ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Минобороны России, 194044, Санкт-Петербург; 2ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики», 197101, Санкт-Петербург;
3ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», 199034, Санкт-Петербург;
4ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова»
Минздрава России, 197022, Санкт-Петербург;
5ФГУН «Институт аналитического приборостроения» РАН, 190103, Санкт-Петербург
В статье приведены результаты исследования адгезивных свойств аортальных полулуний (эндотелиальной поверхности и субэндотелиального слоя), полученные с помощью атомно-силовой микроскопии и специально созданных зондов на основе депозитов солей кальция у больных с кальцинированным аортальным стенозом, а также результаты химического состава кальцинатов. Высказаны предположения о патогенетической значимости полученных результатов в развитии кальцинированного аортального стеноза. Разработанная методика создания специализированных зондов для атомно-силовой микроскопии позволяет использовать ее в моделировании процессов эктопической каль-цификации других органов и систем.
К л ю ч е в ы е с л о в а: кальцинирующий аортальный стеноз; кальциноз; адгезия; эндотелий; гидроксилапатит (ги-дроксиапатит); атомно-силовая микроскопия; рентгенодифракционный анализ; сканирующая электронная микроскопия; патогенез.
для цитирования: Гуляев Н.И., Жуков М.В., Голубок А.О., Куранов Г.Л., Борисов Ю.А., Суглобова Е.Д., Кузнецов В.В., Перемышленко А.С., Гордиенко А.В., Костина О.В. Характеристика адгезивных свойств эндотелия и субэндотелиальных структур аортальных полулуний у больных c кальцинирующим аортальным стенозом. Клин. мед. 2017; 95 (4): 350—354. DOI http://dx.doi.org/10.18821/0023-2149-2017-95-4-350-354
для корреспонденции: Гуляев Николай Иванович — канд. мед. наук, доц. каф. госпитальной терапии; e-mail: [email protected]
Gulyaev N.I.1, Zhukov M.V.2'5, Golubok A.O.25, Kuranov G.L.3, Borisov Yu.A.4, Suglobova E.D.4, Kuznetsov V.V.1, PeremyshlenkoA.S.1, GordienkoA.V.1, Kostina O.V.1
characteristic of adhesive properties of endothelium and subendothelial structures of aortic valve in patients with calcific aortic stenosis
'S.M. Kirov Military Medical Academy, 194044, Sankt-Peterburg;
2National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics, 197101, Sankt-Peterburg;
3Sankt-Peterburg State University, 199034, Sankt-Peterburg;
4I.P.Pavlov First Sankt-Peterburg State Medical University, 197022, Sankt-Peterburg;
5Institute of Analytical Instrument Engineering, 190103, Sankt-Peterburg, Russia
The article presents results of research on adhesive properties of aortic crescents (endothelial and subendothelial surface) obtained with the use of atomic force microscopy and specially created hydroxyapatite-based probes along with results of identification of the chemical composition of deposited calcium salts in patients with calcified aortic stenosis. The results of the study are supposed to be ofpathogenetic significance for understanding the development of calcified aortic stenosis. The proposed method for creating specialized probes for atomic force microscopy can be used in the modeling of processes of ectopic calcification of other organs and system.
K e y w o r d s: calcific aortic stenosis; calcification; adhesion; endothelium; hydroxyapatite; atomic force microscopy; XRD analysis; scanning electron microscopy.
For citation: Gulyaev N.I., Zhukov M.V., Golubok A.O., Kuranov G.L., Borisov Yu.A., Suglobova E.D., Kuznetsov V.V., Peremyshlenko A.S., Gordienko A.V., Kostina O.V. Characteristic of adhesive properties of endothelium and subendothelial structures of aortic vlve in patients with calcific aortic stenosis. Klin. med. 2017; 95(4): 350—354. DOI http://dx.doi.org/10.18821/0023-2149-2017-95-4-350-354 For correspondence: Nikolai I. Gulyaev — MD, PhD, assistant prof. Dpt. Hospital Therapy; e-mail: [email protected] Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Acknowledgements. Work is performed under the state financial support of the leading universities of the Russian Federation (grant 074-U01). Part of the research carried out using equipment of resource centers of St. Petersburg state University Research Park «Geomodel» and «x-ray diffraction studies».
Received 20.03.16 Accepted 19.04.16
Интерес к кальцинирующему поражению аортальных полулуний определяется следующими обстоятельствами. Во-первых, это распространенная патология
аортального клапана у пациентов старших возрастных групп, а во-вторых, процесс патогенеза формирования депозитов солей кальция в структурах аортального кла-
Клиническая медицина. 2017; 95(4)
DOI http://dx.doi.org/10.18821/0023-2149-2017-95-4-350-354
Оригинальные исследования
пана в полной мере до настоящего времени не изучен. И как следствие отсутствует понимание возможностей терапевтической коррекции молекулярно-клеточных нарушений. Согласно современным представлениям, в регуляции отложения фосфатов кальция участвуют около 30 различных промоторов и ингибиторов белковой или неорганической природы, ряд фенотипически измененных клеток, а также мембранно-везикулярные структуры [1—3]. Вместе с тем попытки воздействия на эти регуляторные звенья не привели к торможению процессов отложения депозитов кальция в клапанах. Следовательно, существуют некие дополнительные механизмы отложения солей кальция в межуточной ткани аортальных полулуний. Известно, что при рН более 4,2 единственным термодинамически стабильным фосфатом кальция в водном растворе является гидроксил-апатит (ГА) [4], который идентифицируется в депозитах солей кальция артерий человека [3, 5]. При этом механизмы формирования первичного «ядра» отложения ГА в межуточной ткани аортальных полулуний до настоящего времени остаются недостаточно изученными.
К числу важнейших точек применения атомно-си-ловой микроскопии (АСМ) в биологических исследованиях относится использование АСМ в качестве наноме-ханического сенсора, позволяющего изучать механические (упругие) и адгезионные свойства биоматериалов [1]. В течение последних лет выполнено множество исследований по изучению адгезии различных биологических объектов [6—8]. При этом количественные экспериментальные данные по измерению адгезионных характеристик эндотелия и субэндотелиального слоя аортальных полулуний, полученных методами АСМ в отношении фосфатов кальция, в доступной литературе отсутствуют.
Цель работы — исследование адгезивных свойств эндотелия и субэндотелиальных структур аортальных полулуний с использованием специальных зондов с частицами кальцината для выявления возможных механизмов формирования первичного «ядра» кальцифика-ции в межуточной ткани аортальных полулуний.
Материал и методы
Особенности адгезивных свойств аортального клапана изучены у 16 пациентов с тяжелым аортальным стенозом (рис. 1, см. вклейку), у которых выполнено протезирование клапана. Помимо этого, исследование проводилось на 10 аортальных клапанах людей, погибших от причин, не связанных с заболеванием сердца. Все клапаны помещались в 0,9% раствор натрия хлорида. Исследование методом АСМ проводилось в срок до 6 ч после забора клапана в несколько этапов.
На первом этапе биоматериал подвергался сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии с изучением микроморфологии, элементного и фазового состава депозитов солей кальция, выделялись частицы кальци-ната субмикронных размеров.
б » ;ЗвЧИЛ* . ■ ■ 1
Рис. 2. СЭМ-изображение ГА-зонда до (а) и после (б) переноса ГА.
На втором этапе изучалась топология клапанов и силы адгезии ГА кальцинатов к клапанам сердца методом АСМ. Для этого создавались специализированные зонды (ГА-зонды) путем приклеивания частиц кальци-ната к основанию вершины пирамиды стандартного кантилевера типа NSG01 (NT-MDT, Россия). Создание ГА-зондов и последующее изучение клапанов сердца (рис. 2) происходило на сканирующем зондовом микро -скопе NtegraAura (NT-MDT, Россия) в контактной и полуконтактной модах АСМ. Контроль полученных ГА-зондов осуществлялся на сканирующем электронном микроскопе Inspect (FEI, США).
Исследование адгезии аортального клапана сердца к ГА-зонду осуществлялось в состоянии, близком к на-тивному (на момент проведения эксперимента образец находился во влажном состоянии). Фиксация осуществлялась путем бокового механического закрепления и растягивания части клапана на слюдяной подложке. Определение топологии проводилось в полуконтактной моде для уменьшения инвазивности метода исследования. Измерение кривых отвода для определения сил адгезии выполнялось в контактном режиме на аортальной и желудочковой поверхностях аортальных полулуний, а также в субэндотелиальной области. Для измерения во внутренней части клапана производился надрез на его поверхности. Для повышения объективности и согласованности результатов выполнено более 400 последовательных измерений в случайных точках на поверхности сердечного клапана с общей площадью около 100 мм2.
Сила адгезии определялась по участку кривой отвода, отвечающему за прилипание зонда к поверхности образца (отрезок А—В на кривых отвода). Отклонение зонда 5z, обусловленное силами адгезии, определялось по длине проекции отрезка А—В на ось X (отрезок А—В). Сила адгезии F вычислялась по формуле:
F = 5z-k, (1)
где 5z — отклонение зонда, нм; k — жесткость кантилевера, Н/м.
Жесткость кантилевера k, измеренная методом Са-дера [9], составляла 2,8—2,9 Н/м.
Результаты
При выполнении СЭМ определено несколько типов отложения депозитов солей кальция. Чаще всего поверхность депозитов была образована сферическими частицами диаметром в среднем 200 нм, представляя
Clinical Medicine, Russian journal. 2017; 95(4) DOI http://dx.doi.org/10.18821/0023-2149-2017-95-4-350-354
Рис. 3. СЭМ-изображение поверхности кальцината из биоптатов аортальных клапанов пациентов.
собой скопление наплывных сфер (рис. 3, а). Второй вариант отложения представлен округлыми и линейными структурами, связанными между собой (рис. 3, б). В третьем случае депозиты солей кальция напоминали кристаллическое микропористое «покрывало», под которым расположены крупные конгломераты ГА (рис 3, в). Четвертый вариант имел сходство с друзами фигурных пластинчатых образований, которые находятся на поверхности кальцината или «прорастают» из участков коллагена (рис. 3, г).
При исследовании минерального состава отложений в аортальных полулуниях методом рентгенодиф-ракционного анализа регистрировали депозиты солей кальция в виде ГА с элементами аморфной фазы фосфата кальция, возможно имеющих также замещения карбонатными группами, не изменяющими параметры кристаллической решетки [3, 5]. На рис. 4 (см. вклейку) представлены рентгенодиафрактограммы (XRD-спектры) двух образцов кальцината в сравнении со спектром синтетического ГА. Полуколичественный элементный состав отложений был оценен по энергодисперсионным спектрам (EDX). Соотношение количества атомов кальция и фосфора составляло в среднем 1,73 (в стехиометрическом ГАП эта величина равна 1,67). Таким образом, результаты исследований XRD и EDX позволяют утверждать, что изучаемые нами каль-цинаты представляют собой в основном ГА.
Проведен анализ топологии поверхности эндотелия, в результате которого вычислена средняя шероховатость и построена гистограмма распределения высот (рис. 5, см. вклейку). Установлено, что наиболее часто встречающиеся неровности лежат в диапазоне высот 30—60 нм (вероятнее всего, это выступающие над поверхностью ядра эндотелиоцитов; рис. 7, а). Отметим, что на гистограмме (рис. 5, см. вклейку) наблюдается два характерных пика, что свидетельствует о преобладании на поверхности клапанов сердца объектов
Original investigations
высотой 35 и 45 нм; при этом средняя шероховатость поверхности клапана на площади 2,5 х 2,5 мкм2 составила около 8 нм.
При анализе кривых отвода, измеренных с помощью АСМ, вычисляли среднюю величину отклонения кантилевера в момент отлипания от поверхности (Z) и соответствующую ей среднюю силу адгезии. При вычислении силы адгезии выбирались два крайних положения зонда (точки А и В) при изгибе кан-тилевера (сигнал DFL; рис. 7). Результаты экспериментов показали, что в области неповрежденного эндотелия (см. рис. 7, а) на аортальной и желудочковой поверхностях аортальных полулуний значение Z составило 22,5± 2,5 нм, что соответствует средней силе адгезии 56,7 нН (рис. 6, см. вклейку, см. рис. 7, в). Значения тех же параметров, определенные для субэндотелиального слоя (см. рис. 7, б), оказались на порядок выше и составили 300± 20 нм и 850 нН соответственно (см. рис. 7, г). Следует отметить, что кривые адгезии имели высокую степень совпадения при многократных исследованиях различных участков сердечного клапана. Наиболее характерные кривые адгезии представлены на рис. 7, в, г. Как видно на рис. 7, для кривой отвода в случае субэндотелиального слоя в отличие от неповрежденного эпителия характерен плавный переход от нижней точки В (прилипание) к начальному положению кантилевера (горизонтальная линия напротив точки А) в правой части кривой (см. рис. 7, г), что объясняется постепенным отлипанием зонда от внутренней поверхности клапана при отводе.
Обсуждение
По совокупности наблюдений можно утверждать, что одним из механизмов формирования массивных отложений ГА является образование сферических микро- и наночастиц, представляющих собой единый конгломерат (см. рис. 3, а, б, см. вклейку). Частицы ГА сходной морфологии, обозначаемые в ряде работ термином «самореплицирующиеся кальцифицирующие наночастицы» (КНЧ, CNP) или же «нанобактерии», образуются в кровеносном русле при минерализации, контролируемой белками плазмы крови [10—12]. Минимальный размер частиц в толще аортальных полу-луний составляет около 50 нм, характеризуются они симметричным распределением, близким к нормальному, что адекватно описывается функцией логарифмически нормального распределения [5]. Последний факт указывает на направленный процесс формирования частиц, подверженный влиянию большого количества рандомизированно меняющихся факторов (например, концентрация кальция, фосфора, активности ингибиторов или промоторов кальцификации и т. п.) и типичный для образования минеральных частиц при кристаллизации в гомогенной среде.
Клиническая медицина. 2017; 95(4)
DOI http://dx.doi.org/10.18821/0023-2149-2017-95-4-350-354
Оригинальные исследования
15КУ 015Л оэиимн^
1,0
0,5
300
250
200
150
-200 -100 0 100 200 300 400 500
Рис. 7. СЭМ-изображение поверхности эндотелия аортальных полулуний (а) и субэндотелиального слоя (б). Характерные кривые отвода, полученные при АСМ на эндотелии (в) и субэндотелиальном слое (г) аортального клапана с использованием специализированных ГА-зондов.
В настоящее время некоторые исследователи считают, что ведущая роль в инициации минерализации в системе кровообращения принадлежит матричным и клеточным мембранным везикулам, которые образуются клетками в процессе остеогенеза или при апоп-тозе [13, 14]. Наблюдаемые распределения частиц по размерам не исключают, с одной стороны, механизма микровезикулярного активного синтеза ГА или же пассивного физико-химического процесса, а с другой — тех же механизмов при возможно непосредственном контакте с плазмой крови. При обоих механизмах по достижении везикулами и частицами определенного размера процесс их роста замедляется и прекращается.
Следует отметить, что эндотелий и соединительная ткань аортальных полулуний непрерывно подвергаются высокоэнергетическому гидродинамическому воздействию потоков крови со значительным градиентом давления, что приводит к выраженной деформации структуры полулуний и формирует предпосылки к повреждению эндотелия и коллагена, обнажению суб-эндотелиальных структур. В свою очередь контакт «обнаженных» сульфатированных гликопротеинов и коллагеновых волокон с ионами кальция плазмы крови может приводить к инициированию формирования кристаллических и кристаллоподобных структур непосредственно в матриксе клапана [15] (рис. 8). Потенциально этому процессу должно способствовать накопление дегенеративных изменений коллагеновых волокон при замедлении его обновления.
При переходе венозной крови в артериальную в малом круге кровообращения происходит смещение рН в щелочную сторону от 7,35 до 7,45. Высокоскоростной характер движения крови в левом желудочке способствует не только существенному гидродинамическому воздействию на митральный и аортальный клапаны, но и формированию малорастворимых средних солей —
фосфатов [Са(0Н)]3Р04 и карбонатов [Са (0Н)]2С03 кальция, растворимость которых существенно снижается на фоне даже незначительного повышения рН. При этом на начальном этапе осаждения ГА образуются частицы размером около 1 нм, что соответствует размеру ионного ассоциа-та Са9(Р04)6 [16]. В свою очередь ионные ассоциаты при наличии благоприятных условий — обнажении (денудации) су-бэндотелиального слоя при повреждении эндотелия — и с учетом высокого адгезивного потенциала субэндотелиального слоя аортальных полулуний могут осаждаться и формировать «ядра» кристаллообразования. В дальнейшем путем пассивного физико-химического процесса на образовавшемся «ядре» формируется аморфный фосфат кальция, являющийся предшественником образования ГА (см. рис. 3, в, г) [16]. Этому процессу способствует отрицательный заряд поверхности кристаллов ГА в щелочной среде, придающий им способность сорбировать ионы Са2+ и Са0Н+ из плазмы, что обеспечивает рост кристаллов [17] в межуточной ткани клапана.
Таким образом, в процесс кальцификации аортальных полулуний не только при кальцинирующем аортальном стенозе, но и при ревматизме вовлекаются следующие механизмы:
• фибриноидное набухание и/или повреждение кол-лагеновых волокон соединительной ткани, способствующее повреждению структуры полулуний аортального клапана и створок митрального клапана в местах наибольшего гидродинамического воздействия;
• повреждение эндотелиального слоя, инициирующее регенеративный процесс, приводящий в ряде случаев к сращению створок/полулуний, начиная с близкорасположенных участков с минимальной степенью подвижности — от основания;
• адгезия ионных ассоциатов Са9(Р04)6 к структурам субэндотелиального слоя при их обнажении, а также взаимодействие ионов кальция с обнаженными участками сульфатированных гликопротеинов межу-
Рис. 8. Биоптат аортального клапана больного 68 лет с кальцинирующим аортальным стенозом тяжелой степени.
Отложение солей кальция на коллагеновых волокнах. СЭМ. х 14 000.
точной ткани, которые способствуют формированию кальциноза клапана (см. рис. 8);
• постоянный рост концентрации ГА в аортальных полулуниях, осуществляющийся за счет пассивного физико-химического процесса и, возможно, инициирующий развитие параллельных активных биохимических механизмов отложения депозитов солей кальция в структуре стромы аортальных полулуний.
Выводы
1. Степень адгезии субэндотелиального слоя в отношении гидроксилапатита существенно (более чем в 14 раз) превышает адгезию эндотелия, что указывает на потенциальную возможность формирования первичного «ядра» солей кальция в межуточном веществе аортальных полулуний. При этом нельзя исключить, что минерализация участков, непосредственно контактирующих с кровью, является пассивным физико-химическим процессом.
2. Результаты исследований свидетельствуют об эффективности использования разработанных специализированных зондов на основе гидроксилапатита для моделирования процессов формирования содержащих кальций элементов в структуре сердечного клапана.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена при государственной финансовой поддержке ведущих университетов Российской Федерации (субсидия 074-U01). Часть исследований проведена с использованием оборудования ресурсных центров Научного парка СПбГУ «Геомодель» и «Рентгенодифракционные методы исследования».
ЛИТЕРАТУРА
1. Агеев Ф.Т., Баринова И.В., Серединина Е.М., Орлова Я.А., Кузьмина А.Е. Механизмы формирования кальцификации артерий. Кардиологический вестник. 2012; 7 (2): 57—64.
2. Efstratiadis G., Koskinas K., Pagourelias E. Coronary calcification in patients with end-stage renal disease: a novel endocrine disorder? Hormones. 2007; 6 (2): 120—31.
3. Prieto R. M., Gomila I., Sohnel O., Costa-Bauza A., Bonnin O., Grases F. Study on the structure and composition of aortic valvecalcific deposits: Etiological aspects .J. Biophys. Chem. 2011; 2 (1): 19—25.
4. Вересов А.Г., Путляев В.И., Третьяков Ю.Д. Химия неорганических биоматериалов на основе фосфатов кальция. Российский химический журнал. (ЖРХО им. Д.И. Менделеева). 2004; XLVIII (4): 52—64.
5. Пухов Д.Э., Васильев С.В., Зотов А.С., Ильин М.В., Рудый А.С. Микроморфология, состав, особенности локализации минеральных отложений створок аортальных клапанов по данным сканирующей электронной микроскопии и рентгенодифракци-онного анализа. Вестник Национального медико-хирургического центра им. Н.И. Пирогова. 2014; 9 (1): 23—30.
6. Дедков В.Г., Дедкова Е.Г. Контактная атомно-силовая спектроскопия биологических тканей. Письма в ЖТФ. 2010; 36 (3): 76—81.
7. Benoit M., Gaub H.E. Measuring cell adhesion forces with the atomic force microscope at the molecular level. Cells Tissues Organs. 2002; 172: 174—89.
8. Israelachvili J.N. Intermolecular and surface forces. 2nd Ed. Academic Press. 1992: 470.
9. Sader J.E., Larson I., Mulvaney P., White L.R. Method for calibration of atomic force microscope cantilevers. Rev. Sci. Instrum. 1995; 66: 3489—98.
Clinical Medicine, Russian journal. 2017; 95(4) DOI http://dx.doi.org/10.18821/0023-2149-2017-95-4-350-354
Original investigations
10. Candemir B., Ertas F.S., Kaya C.T. et al. Association between antibodies against calcifying nanoparticles and mitral annular calcification. J. Heart Valve Dis. 2010; 19 (6): 745—52.
11. Miller V.M., Rodgers G., Charlesworth J.A. et al. Evidence of nanobacterial-like structures in calcified human arteries and cardiac valves. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2004; 287 (3): 1115—24.
12. Гуляев Н.И., Коровин A.E., Кусай А.С., Неворотин А.И. Каль-цифицирующие наночастицы в патоморфогенезе структурного повреждения клапанов сердца. Клин. мед. 2015; (8): 63—4.
13. Tanimura A., McGregor D.H., Anderson H.C. Matrix vesicles in atherosclerotic calcification. Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.). 1983; 172 (2): 1773—7.
14. Ortolani F., Bonetti A., Tubaro F. et al. Ultrastructural characterization of calcification onset and progression in subdermally implanted aortic valves. Histochemical and spectrometric data. Histol. and Histopathol. 2007; 226: 261—72.
15. Scott J.E. Structure and function in extracellular matrices depend on interactions between anionic glycosaminoglycans. Pathol. Biol. (Paris). 2001; 49 (4): 284—9.
16. Omuna K., Ito A. Cluster growth model for hydroxyapatite. Сhem. Mater 1998; 10: 3346—51.
17. Казанова Т. Неорганические фосфатные материалы: Пер. с япон. Киев: Наукова думка; 1998: 17—109.
REFERENCES
1. Ageev F.T., Barinova I.V., Seredinina E.M., Orlova Ya.A., Kuz'mina A.E. Mechanisms of calcification of arteries. Kardiologicheskiy vest-nik. 2012; 7 (2): 57—64. (in Russian)
2. Efstratiadis G., Koskinas K., Pagourelias E. Coronary calcification in patients with end-stage renal disease: a novel endocrine disorder? Hormones. 2007; 6 (2): 120—31.
3. Prieto R. M., Gomila I., Sohnel O., Costa-Bauza A., Bonnin O., Grases F. Study on the structure and composition of aortic valvecalcific deposits: Etiological aspects J. Biophys. Chem. 2011; 2 (1): 19—25.
4. Veresov A.G., Putlyaev V.I., Tret'yakov Yu.D. Chemistry of inorganic biomaterials on the basis of calcium phosphate. Rossiyskiy khimi-cheskiy zhurnal. 2004; XLVIII (4): 52—64. (in Russian)
5. Pukhov D.E., Vasil'ev S.V., Zotov A.S., Il'in M.V., Rudyy A.S. Mi-cromorphology, composition and localization habits of mineral deposits of aortal valves cusps according to the scanning electron microscopy and x-ray diffractometry. Vestnik Nacional'nogo mediko-khirurgicheskogo tsentra im. N.I. Pirogova. 2014; 9 (1): 23—30. (in Russian)
6. Dedkov V.G., Dedkova E.G. Contact atomic force spectroscopy of biological tissues. Pis'ma v ZhTF. 2010; 36 (3): 76—81. (in Russian)
7. Benoit M., Gaub H.E. Measuring cell adhesion forces with the atomic force microscope at the molecular level. Cells Tissues Organs. 2002; 172: 174—89.
8. Israelachvili J.N. Intermolecular and surface forces. 2nd Ed. Academic Press. 1992: 470.
9. Sader J.E., Larson I., Mulvaney P., White L.R. Method for calibration of atomic force microscope cantilevers. Rev. Sci. Instrum. 1995; 66: 3489—98.
10. Candemir B., Ertas F.S., Kaya C.T. et al. Association between antibodies against calcifying nanoparticles and mitral annular calcification. J. Heart Valve Dis. 2010; 19 (6): 745—52.
11. Miller V.M., Rodgers G., Charlesworth J.A. et al. Evidence of nanobacterial-like structures in calcified human arteries and cardiac valves. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2004; 287 (3): 1115—24.
12. Gulyaev N.I., Korovin A.E., Kusay A.S., Nevorotin A.I. Calcified nanoparticles in pathomorphogenesis structural damage of the heart valves. Klin. med. 2015; (8): 63—4. (in Russian)
13. Tanimura A., McGregor D.H., Anderson H.C. Matrix vesicles in atherosclerotic calcification. Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.). 1983; 172 (2): 1773—7.
14. Ortolani F., Bonetti A., Tubaro F. et al. Ultrastructural characterization of calcification onset and progression in subdermally implanted aortic valves. Histochemical and spectrometric data. Histol. andHis-topathol. 2007; 226: 261—72.
15. Scott J.E. Structure and function in extracellular matrices depend on interactions between anionic glycosaminoglycans. Pathol. Biol. (Paris). 2001; 49 (4): 284—9.
16. Omuna K., Ito A. Cluster growth model for hydroxyapatite. Сhem. Mater. 1998; 10: 3346—51.
17. Kazanova T. In organic phosphate materials: Trans. from Japan. Kiev: Naukova Dumka; 1998: 17—109. (in Russian).
Поступила 20.03.16 Принята в печать 19.04.16
