CC BY
29
9. Eloranta T.O., Kajander E.O. Catabolism and lability of S-adenosyl-L-methionine in rat liver extracts. Biochem. J, 1984, vol. 224, no. 1, pp. 137-144.
10. García-Estrada C., Barreiro C., Jami M.-S., Martín-González J., Martín J.-F. The inducers 1,3-diaminopropane and spermidine cause the reprogramming of metabolism in Penicillium chry-sogenum, leading to multiple vesicles and penicillin overproduction. J. Proteomics, 2013, vol., 85, pp. 129-159.
11. Kaeberlein M. Spermidine surprise for a long life. Nat. Cell Biol., 2009, vol. 11, no. 11, pp. 1277-1278.
12. Kosalková K., García-Estrada C., Ullán R., Godio R., Feltrer R., Teijeira F., Mauriz E., Martín J.-F. The global regulator LaeA controls penicillin biosynthesis, pigmentation and sporulation, but not roquefortine C synthesis in Penicillium chrysogenum. Biochimie, 2009, vol. 91, no. 2, pp. 214-225.
13. Martín J., García-Estrada C., Rumbero A., Recio E., Albillos S.M., Ullán R., Martín J.-F. Characterization of an autoinducer of penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol., 2011, vol. 77, no. 16, pp. 5688-
5696.
14. Martín J., García-Estrada C., Kosalková K., Ullán R., Albillos S.M., Martín J.-F. The inducers 1,3-diaminopropane and spermidine produce a drastic increase in the expression of the penicillin biosynthetic genes for prolonged time, mediated by the laeA regulator. Fungal Genet. Biol., 2012, vol. 49, no. 12, pp. 1004-1013.
15. Perez-Leal O., Merali S. Regulation of polyamine metabolism by translational control. Amino acids, 2012, no. 2-3 (42), pp. 611-617.
16. Perrin R.M., Fedorova N.D., Bok J.W., Cramer R.A., Wortman J.R., Kim H.S., Nier-man W.C., Keller N.P. Transcriptional regulation of che-mical diversity in Aspergillus fumigatus by LaeA. PLoS Pathog., 2007,vol. 3, no. 4, pp. 508-517.
17. Raney A., Law, G.L., Mize G.J., Morris D.R. Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA. J. Biol. Chem., 2002, vol. 277, no. 8, pp. 5988-5994.
18. Willert E., Phillips M.A. Regulation and function of polyamines in African trypanosomes. Trends Parasitol., 2012, vol. 28, no. 2, pp. 66-72.
Поступила в редакцию 25 июля 2015 г.
После переработки - 14 сентября 2015 г.
УДК 577.152.321+579.26
ХАРАКТЕР ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЯ цАМФ У РАСТЕНИЙ КАК ВОЗМОЖНЫЙ КРИТЕРИЙ УСТОЙЧИВОСТИ КУЛЬТУР К ЗАГРЯЗНЕНИЮ ПОЧВ ФТОРИДАМИ
Л.А. Ломоватская, О.В. Кузакова, А.А. Симакова, Л.Г. Соколова, А.С. Романенко
Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук,
664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317, [email protected]
Работа проводилась в рамках решения проблемы ранней диагностики устойчивости растений к загрязнению почв фторидами. Для анализа использовали проростки пшеницы, редьки масличной, донника и ячменя, выращенные на вытяжках, полученных из почвы с искусственно внесенным NaF и из почвы, загрязненной аэровыбросами Иркутского алюминиевого завода (ИРКАЗа), а также проростки и растения, выращенные до стадии урожая на почве с искусственно внесенным NaF и почве, загрязненной аэровыбросами ИРКАЗа. Определяли уровень цАМФ в органах растений и вес этих органов. Было показано, что устойчивость растений к данному абиотическому стрессовому фактору зависит от системной активации их аденилатциклазной сигнальной системы. Наиболее устойчивыми в соответствии с выбранными параметрами оценки оказались пшеница и редька масличная.
Ил. 4. Библиогр. 9 назв.
Ключевые слова: устойчивость к водорастворимым фторидам; цАМФ; системная активация аде-нилатциклазной сигнальной системы.
CHARACTER OF cAMP LEVEL CHANGE IN PLANTS AS A PROBABLE CRITERION OF CULTIVARS ESISTANCE TO SOIL POLLUTION BY FLUORIDES
L.A. Lomovatskaya, O.V. Kuzakova, A.A. Simakova, L.G. Sokolova, A.S. Romanenko
Siberian Institute of Plant Physiology & Biochemistry Siberian Branch of the Russian Academy of Science,
132, Lermontov St.,Irkutsk, 664033, Russia, p/b 317, [email protected]
The work was conducted within the framework of solving the problem of early diagnostics of plants resistance to soil contamination by fluorides. The study was performed on the seedlings of wheat, oilradish, melilot and barley grown on the extracts acquired from the soil with artificially introduced NaF and from the soil polluted with IrkAZ air exhaust and with the seedlings and plants grown up to the yield phase on the soil with artificially introduced NaF and on the soil polluted with IrkAZ air exhaust. cAMP level in the plant organs and organs weight were determined. Plant resistance to this abiotic stress factor was shown to depend on systemic activation of adenylcyclasesignal system. The most stable in accordance with the setting turned out to assess wheat and oilseed radish. 4 figures. 9 sources.
Keywords: plantresistance to watersoluble fluorides; cAM; systemic activation of plant adenylcyclase signal system.
ВВЕДЕНИЕ
Вопросам ранней диагностики устойчивости растений посвящено немалое количество работ, но, как правило, предлагаемая методология использует для оценки устойчивости единичный параметр, как то: скорость роста или содержание эндогенных сахаров. Такой подход не дает объективной оценки устойчивости растений к неблагоприятному фактору среды, поскольку отслеживает частные проявления защитных реакций растений.
Для того чтобы экстраполировать полученные в ранней диагностике результаты на взрослое растение в полевых условиях, требуется выбор параметров, в полной мере отражающих особенности метаболизма растения в предлагаемых условиях. Кроме того, желательно, чтобы эти параметры регулировали реализацию конститутивных механизмов устойчивости. Это относится к сигнальным системам растений, поскольку именно они уже на этапе восприятии сигнала дифференцируют его и обеспечивают соответствующий защитный ответ растительной клетки.
Ранее исследования по воздействию биотического стресса на растения картофеля (возбудитель кольцевой гнили) показали, что характер изменения уровня цАМФ в растениях картофеля под воздействием инфекции зависит от их сортовой устойчивости: более быстрый и интенсивный системный ответ аде-нилатциклазной сигнальной системы (АСС) наблюдался у растений устойчивого сорта [1].
Такой ответ АСС вполне объясним и призван оперативно запускать защитные механизмы у растений.
В тоже время роль АСС в реализации механизмов устойчивости растений к абиотическому стрессу, в частности, к загрязнению почв водорастворимыми фторидами, остается совершенно не исследованной.
Поэтому задачей данной работы было дать сравнительную оценку реакции аде-нилатциклазной сигнальной системы ряда сельскохозяйственных культур на повышенный уровень фторидов в почве.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для экспериментов использовали семена следующих культур: районированный сорт яровой пшеницы (Тулунская-12), редька масличная (линия ИргСХА), донник белый «Обский гигант», ячмень яровой. Исследования проводили на нескольких модельных системах:
- «проростки-почвенная вытяжка»- семена ряда сельскохозяйственных культур проращивали на вытяжках из почвы с искусственно внесенным №Р и из почвы, загрязненной аэровыбросами ИРКАЗа;
- «первый лист-почва» - те же культуры выращивали в почве с искусственно внесенным ЫаР и почве, загрязненной аэровыбросами ИРКАЗа до фазы первого листа;
- «взрослые растения-почва» - те же культуры выращивали в аналогичных условиях до фазы урожая.
Вытяжку в соответствии с методом [5] получали из агросерой почвы («контроль»), вторая вытяжка была сделана из той же почвы, содержащей ЫаР (500 мг/г почвы - «ЫаР»), и третья вытяжка производилась из почвы, взятой из зоны загрязнения ИРКАЗа (содержание Р 10 ПДК - «ИРКАЗ»). Семена проращивались 7 дней на каждой из вытяжек, затем у них определяли вес корней и листьев, а также содержание цАМФ отдельно в корнях и листьях. В поле растения выращивали в условиях мел-коделяночных опытов [2], где присутствовали те же варианты почв. Вовсех случаях определяли те же параметры, а именно вес листьев и корней, а также уровень цАМФ в корнях и листьях по отдельности. Лабораторные эксперименты проводили в 4 биологических повторно-стях по 50 семян. В полевых экспериментах проводили 2 биологических повторности по три растения в каждой.
Концентрацию цАМФ определяли методом ИФА [8], расчет уровня цАМФ делали на г сырого веса. Количество аналитических повтор-ностей - 8.
Статистическая обработка данных заключалась в определении ошибки среднего.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Прежде всего следует сказать, что все полевые культуры отличались по эндогенному содержанию цАМФ, что отражает их видовые особенности. Наряду с этим у проростков и взрослых растений всех исследуемых культур была выявлена неодинаковая реакция на абиотический стрессор. Это выражалось в колебаниях как уровня цАМФ, так и веса корней и колеоптилей/листьев растений. Параметр «вес» был использован для более объективной оценки физиологического состояния растений.
У пшеницы в эксперименте «проростки-почвенная вытяжка» во всех вариантах вес проростков оставался практически на уровне контроля, также как и концентрация цАМФ. Это свидетельствует о том, что проростки пшеницы в данных условиях не испытывали стресса. В системе «первый лист-почва» при проращивании семян пшеницы на различных вариантах почв вес корней также оставался почти на уровне контроля, тогда как у листьев превышал его, особенно в варианте «ИРКАЗ». Однако уровень цАМФ у таких растений значительно снижался (рис.1). В обоих экспериментах воздействию неблагоприятного фактора подвергались проростки, но в почвенном опыте присутствовали дополнительные негативные факторы, как то, нестабильная температура, ветер и осадки, что нашло свое отражение в резком
понижении уровня цАМФ в органах проростков. По литературным данным, именно в период «всходы-кущение» пшеница наиболее уязвима для внешних воздействий [4]. Тем не менее, при этом в этих экспериментах растения сохраняли высокую биомассу, особенно листья, которые испытывали только косвенное влияние фторида в отличие от корней. Совокупность высокой биомассы органов растений с пониженным уровнем цАМФ, на наш взгляд, можно рассматривать как адаптацию проростков пшеницы к высокому содержанию фторидов в субстрате роста. Если такой вывод справедлив, то это должно найти подтверждение результатах экспериментов на растениях, выращенных в тех же условиях, на стадии сбора урожая. Результаты показали, что вес органов растений во всех вариантах эксперимента был выше контроля, что сопровождалось весьма существенным повышением уровня цАМФ, причем в большей степени в корнях в варианте «ЫаР», чем в варианте «ИРКАЗ».
Как на почвенной вытяжке у проростков (вариант «ЫаР» и «Ирказ»), так и у взрослых растений (вариант «ИРКАЗ») при сборе урожая была отчетлива заметна системная активация АСС, что выражалось в повышенном уровне цАМФ не только в корнях, но и в колеоптилях или листьях пшеницы. Совокупность полученных данных указывает на то, что пшеница успешно адаптировалась к данному стрессору.
У растений редьки масличной реакция на неблагоприятное воздействие на уровне проростков, выращенных на почвенной вытяжке, была близка к таковой у пшеницы (рис. 2). Однако, если в модели «проростки-почвенная вытяжка» вес корней и листьев во всех вариантах опыта мало отличался между собой, то реакция АСС существенно превышала контроль у проростков редьки как на почвенной вытяжке, так и в почве. В последнем случае обращает на себя внимание высокий уровень цАМФ как в корнях, так и в листьях редьки, что свидетельствует о развитии системного ответа АСС растений на абиотический стресс. При этом сохранение веса примерно на уровне контроля указывает на переход растений от стресса к успешной адаптации, что, в итоге, подтвердилось в экспериментах на взрослых растениях («взрослые растения-почва»), где вес их корней и листьев был выше контроля в 1,5-2,3 раза. Интересно, что это сопровождалось очень низким уровнем цАМФ, что, возможно, связано с завершением вегетационного периода у этой культуры.
Донник во всех вариантах эксперимента (как на проростках, так и у взрослых растений) проявлял более интенсивную реакцию АСС, что
I-1||АМФ
Рис. 1. Изменение веса и активности аденилатциклазной сигнальной системы органов проростков/растений пшеницы под воздействием повышенной дозы водорастворимого фтора
сопровождалось снижением веса во всех вариантах, кроме массы листьев у взрослых растений (рис. 3). Такое распределение физиологических показателей указывает на то, что донник, начиная со стадии проростков, испытывал сильный стресс, что привело, в результате, к истощению адаптивного потенциала. Одной из причин этого явления может быть повышенный расход АТФ, в том числе на синтез цАМФ.
Ячмень продемонстрировал в экспериментах с проростками совершенно иную стратегию стрессовых реакций (рис. 4). На почвенных вытяжках высокий уровень цАМФ наблюдался только в корнях проростков как в варианте «NaF», так и в варианте «ИРКАЗ». При этом в колеоптилях этот показатель был значительно ниже 100%, что указывает на блокирование системной реакции АСС. Однако, при этом вес органов проростков сохранялся на уровне, близком к контролю. Такая реакция проростков свидетельствует о развитии ранней неспецифической стрессовой реакции. Можно утверждать, что повышенная активность АСС только в корнях связана с повышенным содержанием в них ионов фтора. Известно, что ионы фтора поступают в ткани корня пассивно [7], что может явиться причиной активации трансмембранной аденилатциклазы путем стимуляции активности соответствующего ГТФ-связывающего белка. Однако, резкое снижение уровня цАМФв колеоптилях тех же проростков свидетельствует об ингибировании системной реакции АСС проростков ячменя. Это может быть отражением сложных метаболических событий, протекающих в проростках под воздействием пол-
лютантов. Действительно, ионы фтора могут связывать многие потенциалобразующие ионы
[3], прежде всего кальций, что нарушает нормальный электрохимический потенциал клеток корня и ингибирует развитие системной реакции АСС. В то же время у проростков ячменя, находящихся в почве, была заметна существенная системная активация АСС. Можно предположить, что одним из механизмов этого явления является меньшее поступление в корни растений ионов фтора. Это, возможно, за счет его частичного удержания в почве
[4].Таким образом, на стадии проростков ячмень демонстрировал сильный стресс на загрязнение субстрата роста ионами фтора. На более поздней стадии роста, а именно, в период сбора урожая активность АСС у растений ячменя почти исчезала, а вес растений в варианте «NaF» был на 30% ниже контроля, тогда как в варианте «ИРКАЗ» превышал контроль всего на 18%. Такое сочетание уровня цАМФ и веса органов растений свидетельствует о том, что стрессовая нагрузка на ранних стадиях роста не способствовала реализации у взрослых растений необходимых адаптационных механизмов. Это подтверждается и литературными данными о низкой устойчивости ячменя к загрязнению фторидами [3].
Аденилатциклазная сигнальная система растений, как и все остальные сигнальные системы, очень быстро реагирует на изменение условий окружающей среды. Однако механизмы, приводящие к модуляции активности данной системы в ответ на стрессоры биотической и абиотической природы, различны. Если при биотическом стрессе основная роль
2400 2200 2000 1800 1600 2 1400 ° 1200
X
о
1000 800 600 400 200 0
\\в П* Пп Пп
корень №Р
лист ЫэР
корень ИрКАЗ
лист ИрКАЗ
корень 1_1 и лист корень
№Р ЫэР ИрКАЗ
|цАМФ ■вес
---- п
проростки-почвенная вытяжка
лист ИрКАЗ
первый лист-почва взрослые растения-почва
корень лист корень лист
№Р ЫэР ИрКАЗ ИрКАЗ
Рис. 2. Изменение веса и активности аденилатциклазной сигнальной системы органов проростков/растений редьки масличной под воздействием повышенной дозы водорастворимого фтора
I 1иАМФ
проростки-почвенная вытяжка первый лист-почва взрослые растения-почва
Рис. 3. Изменение веса и активности аденилатциклазной сигнальной системы органов проростков/растений донника под воздействием повышенной дозы водорастворимого фтора
3000
2750
2500
2250
2000
2
^ о 1750
1— X 1500
о
:£ 1250
о?
1000
750
500
250
0
корень лист корень
ЫэР №Р ИрКАЗ
лист корень
ИрКАЗ ЫэР
проростки-почвенная вытяжка
лист ЫэР
|цАМФ ■вес
корень ИрКАЗ
лист
ИрКАЗ
♦ ~ _
корень лист корень лист
№Р ЫэР ИрКАЗ ИрКАЗ
первыилист-почва
взрослые растения-почва
Рис. 4. Изменение веса и активности аденилатциклазной сигнальной системы органов проростков/растений ячменя под воздействием повышенной дозы водорастворимого фтора
принадлежит специфическим лиганд-рецеп-торным взаимодействиям [9], то при абиотическом, в частности, при загрязнении почвы фторидами, наблюдается неспецифическая стрессовая реакция АСС. Она складывается из многих физиологических процессов, косвенно или прямо влияющих на ее активность, и, вероятно, прежде всего, зависит от пула поглощенного водорастворимого фтора. Испытанные виды растений, очевидно, отличаются между собой по способности накапливать фториды [3]. Поступая в растение, ионы фтора могут частично утилизироваться: «сбрасываться» в вакуоль, связываться с органическими молекулами, а также образовывать комплексы с некоторыми катионами, например кальцием и магнием [3]. Последнее может оказывать значительное влияние на сигнальную сеть растений, затрагивая деятельность, например, кальциевой и липок-сигеназной сигнальных систем [6], что ведет за собой разнообразные сдвиги в метаболизме. Если такие события происходят на ранних этапах роста растений, то это, несомненно, в дальнейшем приведет к различным расстройствам роста и развития, поскольку известно, что условия роста в ювенильный период определяют дальнейшее физиологическое состояние растений. Именно такое явление и наблюдалось в наших экспериментах. Если у пшеницы и у редьки масличной на уровне проростков, выращенных на почвенных вытяжках,
наблюдалась системная активация АСС, то есть уровень цАМФ возрастал как в корне, так и в стебле, то у донника и ячменя наблюдался сильный перекос по этому показателю. Уровень цАМФ существенно возрастал только в корне, а развитие системного ответа в листьях было блокировано. Таким образом, избыток данной сигнальной молекулы в одном органе и резкий недостаток в другом не только нарушал баланс многих сигнальных систем, но и вероятно, в какой-то степени ингибировал включение защитных реакции: как-то синтез стрессовых белков или изменение пула фитогормонов. Таким образом, повышенная нагрузка ионами фтора оборачивается сильнейшим стрессом для донника и ячменя, и, что очень важно, невозможностью развития системного защитного ответа. В дальнейшем это приводит к потерям урожая у взрослых растений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Из полученных результатов можно сделать вывод, что для устойчивости растений к повышенным дозам фтора в почвах очень важна системная активация аденилатциклазной сигнальной системы растений уже на самых ранних этапах развития, когда формируется и реализуется адаптивный потенциал последних.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 14-05-00735.
1. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Кри-волапова Н.В., Копытчук В.Н., Саляев Р.К. Возможная роль эндогенного цАМФ картофеля в развитии системного сигнала при патогенезе кольцевой гнили // ДАН. 2004. Т. 394, № 5. С. 715-717.
2. Ломоватская Л.А., Рыкун О.В., Симакова А.А., Соколова Л.Г., Романенко А.С., Помазкина Л.В. Влияние повышенных доз фторидов в почве на активность аденилатциклазной сигнальной системы растений // Известия ИГУ. Серия «Биология. Экология». 2014. Т. 7. С. 11-19.
3. Полонский В.И., Полонская Д.Е. Фто-ридное загрязнение почвы и фиторемедиация // Сельскохоз. биология. 2013. № 1. С. 3-14.
4. Помазкина Л.В., Котова Л.Г., Лубнина Е.В., Зорина С.Ю., Лаврентьева А.С. Устойчи-
ЕСКИЙ СПИСОК
вость агроэкосистем к загрязнению фторидами Иркутск, 2004. С. 225.
5. Семендяева Н.В., Мармулев А.Н., Доб-ротворская Н.И. Методы исследования почв и почвенного покрова. Изд-во НГАУ, 2011. 202 с.
6. Тарчевский И. А. Метаболизм растений при стрессе. Казань, 2001. 448 с.
7. Усманов И.Ю., Рахманкулова З.Ф., Кулагин А.Ю. Экологическая физиология растений: учеб. пособие. М., 2001. 224 с.
8. Lomovatskaya L.A., Romanenko A.S., Filinova N.V., Dudareva L.V. Determination of cAMP in Plant Cells by the Modified Enzyme Immunoassay // Plant Cell Rep. 2011. Vol. 30. P. 125-132. DOI 10. 1007/s00299-010-0950-5.
9. Vanderplank J. Host pathogen interaction in plant desease. N.Y., Acad.Press. 1982. 207 p.
REFERENSES
1. Lomovatskaya L.A., Romanenko A.S., Krivolapova N.V., Kopytchuk V.N., Salyaev R.K. Vozmozhnaya rol' endogennogo tsAMF kartofelya v razvitii sistemnogo signala pri patogeneze kol'tsevoi gnili [The possible role of potato endogenic cAMP in system signal development at ring rot pathogenesis]. Doklady Akademii Nauk -Doklady Biological Sciences, 2004, vol. 394, no. 5, pp. 715-717.
2. Lomovatskaya L.A., Rykun O.V., Sima-kova A.A., Sokolova L.G., Romanenko A.S., Pomazkina L.V. Vliyanie povyshennykh doz ftori-dov v pochve na aktivnost' adenilattsiklaznoi sig-nal'noi sistemy rastenii [Effect of high doses of fluoride in the soil on the activity of adenylyl cyclase signaling system of plants]. Izvestiya Ir-kutskogo Gosudarstvennogo Universiteta. Seriya Biologiya. Ekologiya - The Bulletin of Irkutsk State University Series Biology. Ecology, 2014, vol. 7, pp. 11-19. Available at: http://isu.ru/izvestia.
3. Polonskii V.I., Polonskaya D.E. Ftoridnoe zagryaznenie pochvy i fitoremediatsiya [Fluoride contamination of soil and phytoremediation (review)]. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya - Agricultural biology, 2013, no. 1, pp. 3-14.
4. Pomazkina L.V., Kotova L.G., Lubnina E.V., Zorina S.Yu., Lavrent'eva A.S. Ustoichivost' agroekosistem k zagryazneniyu ftoridami [The resistance of agroecosystems to fluoride pollution]. Irkutsk, Institute of Geography SB RAS Publ., 2004, 225 p.
5. Semendyaeva N.V., Marmulev A.N., Do-brotvorskaya N.I. Metody issledovaniya pochv i pochvennogo pokrova [Methods of soil and soil cover investigation]. Novosibirsk, NSAU Publ., 2011,202 p.
6. Tarchevskii I. A. Metabolizm rastenii pri stresse [The metabolism of plants under stress]. Kazan', 2001, 448 p.
7. Usmanov I.Yu., Rakhmankulova Z.F., Ku lagin A.Yu. Ekologicheskaya fiziologiya rastenii [Environmental Plant Physiology]. Moscow, 2001, 224 p.
8. Lomovatskaya L.A., Romanenko A.S., Fil-linova N.V., Dudareva L.V. Determination of cAMP in Plant Cells by the Modified Enzyme Immunoassay. Plant Cell Rep., 2011, vol. 30, pp. 125-132. DOI 10.1007/s00299-010-0950-5.
9. Vanderplank J. Host pathogen interaction in plant disease. N.Y., Acad. Press., 1982, 207 p.
Поступила в редакцию 15 мая 2015 г.
После переработки - 16 сентября 2015 г.
