CC BY
36
УДК 579.833.29:599.323.4(571.63):574.3
Л.Н. Яшина1, Л.И. Иванов2, Р.А. Слонова3, Г.Г. Компанец3, В.В. Гуторов1, Т.В. Кушнарева3, Н.П. Высочина2,
С.А. Абрамов4, Т.А. Дупал4, Н.М. Пуховская2, Н.И. Здановская2
1 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (пос. Кольцово Новосибирской обл.), 2 Хабаровская противочумная станция Роспотребнадзора, 3 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (г. Владивосток), 4 Институт систематики и экологии животных CO РАН (г. Новосибирск)
ХАНТАВИРУСЫ, ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ В ПОЛЕВКАХ MICROTUS FORTIS И MICROTUS MAXIMOWICZII
Ключевые слова: хантавирус, полевки, генотип.
Методом обратной транскрипции — полимеразной цепной реакции с последующим секвенированием — были изучены 8 полевых штаммов хантавирусов, выделенных от полевок рода Microtus из дальневосточного региона России. Было проведено независимое зоологическое определение вида грызунов-носителей и анализ их митохондриальной ДНК. Сравнительный анализ установленных нуклеотидных последовательностей фрагментов М-сегмента вирусного генома штаммов хантавирусов и мтДНК полевок-носителей с нуклеотидными последовательностями, представленными в базе данных GenBank, выявил циркуляцию двух генотипов KBRV и \ЬАУ в двух видах полевок — носителей вирусов. Наши исследования впервые выявили циркуляцию генотипов KBRV в полевках M. maximowiczii и VLAV в полевках M. fortis на территории Амурской области, а также подтвердили циркуляцию VLAV в полевках М. на территории Приморского края.
На Дальнем Востоке России носителями хантавирус-ной инфекции являются не менее 11 видов грызунов [6]. Среди них у дальневосточной полевки МктШз fortis выявлен один из наиболее высоких уровней ин-фицированности. Доля грызунов, в легочной ткани которых при обследовании был найден хантавирусный антиген, достигала 19,7%, а специфические антитела в сыворотках крови обнаруживают у 23,6% животных [2, 6]. В 1988 г. от М. fortis, отловленной на территории Хабаровского края, был изолирован штамм Mf43/KBR-88, идентифицированный как новый вирус Хабаровск (KBRV) [4]. На основании изучения полной структуры генома хантавируса KBRV, а также его антигенных свойств, установлена уникальность данного вируса [4, 8]. В 1991 г. от М. fortis был изолирован штамм М052/ KBR-91, который значительно отличался от вируса KBRV [2]. Различие кодируемых аминокислотных последовательностей фрагмента белка G2 составляло 12%. Позднее при анализе вирусной последовательности S-сегмента генома РНК, полученной от инфицированной хантавирусом М. fortis, отловленной на территории Приморского края, также были выявлены значительные отличия изолята от KBRV [5]. Различие нуклеотидных и аминокислотных последовательностей с вирусом KBRV составило 21 и 10%, что соответствует критерию различий двух генотипов. Это сделало возможным предположить, что дальневосточная полевка является носителем другого генотипа, отличного от KBRV, названного Владивосток (УЪАУ). Нами при генетическом исследовании материала от серопозитивных дальневосточных полевок, отловленных на других участках очаговой территории Приморского
края, на основании анализа M-сегмента генома было установлено значительное (22%) отличие в нуклеотидных последовательностях от KBRV [6]. Недавно на территории Бурятии установлена циркуляция VLAV в популяциях M. fortis и Microtus oeconomus [7], а исследования, проведенные на территории Китая и внутренней Монголии, позволили установить, что хантавирус VLAV циркулирует в популяциях M. fortis, а KBRV у М. maximowiczii [9].
В настоящем исследовании проведена характеризация геномов хантавирусов и митохондриальной ДНК его природных хозяев — полевок рода Microtus, отловленных на территории Дальнего Востока России.
Исследованы антиген- или серопозитивные образцы ткани легких 17 полевок рода Microtus, отловленных в 1997—2005 гг. на территории Приморского, Хабаровского краев и Амурской области. Суммарная РНК/ДНК выделена из ткани легких с использованием набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN Gmbh, Germany) и подвергнута анализу методом обратной транскрипции — полимеразно-цепной реакции (ОТ—ПЦР) для выявления фрагментов М-сегмента генома. Для анализа выбран фрагмент гена гликопротеина G2, соответствующий нуклеотидным позициям 2735—2993 штамма KBRV Mf43. Амплификация проводилась методом ОТ—ПЦР в одной пробирке с использованием набора Titan (Roche GmbH, Germany). Образцы легких ОТ-ПЦР-позитивных грызунов использовали для анализа митохондриальной ДНК (мтДНК) на высоковариабельном участке, примыкающем к региону начала репликации тяжелой цепи мтДНК (участок Д-петли). ПЦР-продукты разделены методом электрофореза в 1,2% агарозном геле, фрагменты подходящего размера вырезаны из геля и очищены с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Gmbh, Germany). ПЦР-продукты секвенированы на автоматическом анализаторе Applied Biosystem 310. Полученные последовательности анализировали путем сравнения с известными последовательностями хантавирусов из банка данных GenBank. Для филогенетического анализа различий между выделенными изолятами и известными хантавирусами использован метод объединения соседних последовательностей. Индексы поддержки получены для 1000 повторов анализа. Установленные нами нуклеотидные последовательности хантавирусов зарегистрированы в базе данных GenBank под номерами EU360905—EU360908.
48
Тихоокеанский медицинский журнал, 2008, № 2
Таблица
Результаты генетического и серологического тестирования образцов легких от полевок рода Мicrotus.
№ образца Год отлова Место отлова Титр Генотип
антигена антител вируса грызуна
18650 1997 Городечное Приморского кр. + - VLAV М. fortis
26648 1997 Спасский р-н Приморского кр. + - VLAV М. fortis
605 2002 Черняево Амурской обл. - 1:80 КВКУ М. maximowiczii
612 2002 Черняево Амурской обл. 1:4 1:20 КВКУ М. maximowiczii
657 2002 Сковородино Амурской обл. 1:16 1:80 КВКУ М. maximowiczii
679 2002 Сковородино Амурской обл. + - КВКУ М. maximowiczii
28179 2005 Спасский р-н Приморского кр. + 1:20 VLAV М. fortis
1151 2005 Благовещенск Амурской обл. - 1:20 VLAV М. fortis
Для анализа генетической вариабельности хан-тавирусов, циркулирующих в полевках рода МктШз, нами были проанализированы 17 вируссодержащих образцов (полевых штаммов). Нуклеотидные последовательности М-сегмента вирусного генома (позиции 2735-2993) были выявлены в 8 образцах (табл.).
В сравнительный анализ, помимо представителей всех известных, были включены опубликованные в 2008 г. последовательности штаммов вирусов KBRV и УЬЛУ из Китая и Бурятии [7, 9]. Результаты анализа показали, что в четырех образцах нами были выявлены последовательности вируса KBRV, а в оставшихся четырех образцах — вируса \ЪЛУ. Все штаммы KBRV были близки прототипному штамму KBRV М543. Следующим по степени близости являлся штамм ТОРУ изолированный от сибирского лемминга; различия составляли 17,8—22,8% для нуклеотидных и 8,6% — для аминокислотных последовательностей. Вариабельность геномов KBRV находились в пределах 2,3—11,4%, при этом аминокислотные последовательности всех штаммов на выбранном участке оказались полностью идентичны прототипному вирусу. Вариабельность геномов \ЪЛУ составляла 0,9—11,0%, аминокислотные последовательности были идентичны друг другу. Установленные последовательности оказались наиболее близки (4,1—11,9% нуклеотидных и 0% аминокислотных различий) последовательностям штаммов \ЪЛУ из города Fusong, расположенного в Китае в 400 км от Владивостока. В то же время различие с географически более удаленными штаммами \ЪЛУ из Бурятии достигало 16,9—19,6% для нуклеотидных и 3,8% — для аминокислотных последовательностей. Нами установлено значительное различие между хантавирусами УЬЛУ и KBRV, циркулирующими на одной территории. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности отличались на 20,5—24,7 и 11,3% соответственно. Как и в случае с вирусом KBRV, различие нуклеотидных последовательностей \ЪЛУ по сравнению со штаммом TOPV было меньше и составляло 17,8—22,8%, различие аминокислотных последовательностей — 10,0%.
Для определения генетического родства изучаемых штаммов с ранее известными хантавирусами на основе М-сегмента вирусного генома реконструирована его филогения (рис.). На филогенетическом
древе все штаммы KBRV образуют единую группу с высоким индексом поддержки, что говорит о единстве их происхождения. Внутри группы штаммы KBRV объединяются по географическому признаку, а вся группа KBRV объединена на филогенетическом древе с ТОРУ Более сложная картина филогенетических взаимосвязей выявлена для штаммов УЬАУ Эта группа, имеющая высокий уровень поддержки, разделена на две подгруппы. В первую вошли объединенные по географическому принципу штаммы из Приморского края и Китая (Городечное и Fusong), из Приморского края и Амурской области (Спасск и Благовещенск). Штаммы из Бурятии образовали вторую подгруппу. Таким образом, анализ вирусных последовательностей М-сегмента генома четко показывает, что ханта-вирусы КНВУ и VLAV представляют две различных ветви на филогенетическом древе и являются двумя различными генотипами.
Большинство имеющихся в настоящее время данных согласуются с гипотезой о параллельной эволюции хантавирусов и их природных хозяев. Предшествующие данные о циркуляции двух генотипов вируса у М. fortis противоречат этой гипотезе и ставят вопрос о более точной идентификации природных хозяев генотипов KBRV и \ЬАУ Ранее отмечалось, что прототипный штамм вируса KBRV был изолирован от дальневосточной полевки М. fortis, отловленной в Хабаровском крае. Из того же вида носителя в Приморском крае были выявлены вирусные последовательности VLAV [3, 5].
Для более точного определения вида полевок рода МктШз проведено независимое зоологическое определение вида носителей и анализ их мтДНК. Нами получены и секвенированы фрагменты мтДНК длиной 403 нуклеотида. Межвидовая дивергенция между различными видами грызунов в пределах исследованного участка Д-петли варьировала от 5,5 до 13,7%. При этом внутривидовая вариабельность данного участка ДНК не превышает 4,5%. При сравнительном анализе мтДНК животных, являющихся носителем вируса KBRV, и животных, у которых был выявлен генотип \ЬАХ оказалось, что различие составляет более 9%. При этом различие мтДНК носителей VLAV не превышало 1,0%, а различие мтДНК полевок — носителей
89
нь
— Sotkamo-Cg/Finland
— Vindeln-Cg/Sweden
— Muji-Er997/Korea
К
-------------CG1820/Russia
-------------Couvin-Cg/Belgium
---------------Kamisso-Crf/Japan
-------------SHK-Crf74333/Prim
100 г Nesterikha-MF500/Buryatia
98
100
96 I
L Barguzin-Mo483/Buryatia ■ Blagoveshensk-Mf1151/Amursk
— Spassk-Mf26648/Prim - Fusong-Mf682/China ■ Gorodechnoe-Mf18650/Prim
98 L Spassk-Mf28179/Prim
— TOP-Ls/Russia KBR-Mf43/Russia Skovorodino-Mm657/Amursk Skovorodino-Mm679/Amursk
— Yakeshi-Mm59/China
— Chernyaevo-Mm605/Amursk
— Chernyaevo-Mm605/Amursk PH-1/USA
— TULA-Ma/Moravia
-----NY/USA
---------SN/USA
------------Thailand
89
— SEO-SR11/Japan
- HTN-76118-Aa/Korea AMR-Ap74403/Russia
-----DOB-Af/Slovenia
-----DOB-Aa/Saa
Рис. Филогенетическое древо, построенное на основе нуклеотидной последовательности фрагмента М-сегмента генома хантавирусов, позиции 2735—2993. Жирным шрифтом выделены исследованные нами полевые штаммы. Показаны индексы поддержки больше 70.
KBRV составляло 1,0—2,9%. Полученные данные свидетельствуют о том, что различающиеся генотипы хантавирусов КВКУ и \ЪАУ также циркулируют в двух различных носителях. Определение видовой принадлежности полевок на основании анализа признаков черепа и рисунка жевательной поверхности коренных зубов [1], а также мтДНК показало, что штаммы KBRV выявлены от полевок Максимовича (М. тахтоц^И), а \ЪАУ — от дальневосточных полевок (М. fortis).
Ранее, при отсутствии доступных для сравнения последовательностей М-сегмента генома УЬАУ мы предположили наличие нового, генетически отличающегося вируса в М. fortis, отловленных в окрестности п. Городечное [3]. Настоящее исследование, а также появление последовательностей М-сегмента VLAV в GenBank, позволило уточнить ранее полученные данные. Сравнение установленных и выявленных ранее последовательностей хантавируса от М. fortis, отловленных в окрестности п. Городечное, выявило их высокое родство (0—0,9% различий) и принадлежность к последовательностям \ЪАУ. Циркуляцию VLAV в М. fortis и циркуляцию KBRV в М. тахтоц^п под-вердили данные зарубежных исследователей [7, 9]. Ранее присутствие хантавирусной инфекции у М. та-
ximowiczii было описано российскими учеными на территории Читинской области, однако вирус не был идентифицирован. Наша работа впервые выявила циркуляцию вируса KBRV в полевках M. maximowiczii и VLAV — в полевках M. fortis на территории Амурской области, а также подтвердила циркуляцию VLAV в полевках M. fortis на территории Приморского края.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы BTEP в рамках проекта МНТЦ 0805.2.
Литература
1. Громов И.М., Ербаева М.А. Млекопитающие фауны России и сопредельных территорий. Зайцеобразные и грызуны. - СПб. : Изд-во Зоол. ин-та РАН, 1995.
2. Иванов Л.И., Чижиков В.Е., Деконенко А.Е. и др. // Хантавирусы и хантавирусные инфекции / под ред. Р.А. Слоновой, В.А. Иванис. - Владивосток : Примпо-лиграфкомбинат, 2003. - С. 151—161.
3. Яшина Л.Н. //Журн. микробиол, эпидемиол. и имму-нобиол. - 2006. - № 3. - С. 78—81
4. Horling J, Chizhikov V., Lundkvist A. et al. // J. Gen. Virol. - 1996. - Vol. 77. - P. 687-694.
5. Kariwa H, Yoshimatsu K., Sawabe J. et al. // Virus Res. -1999. - Vol. 59. - P. 219-228.
6. Kosoy M., Slonova R., Mills J. et al. // J. Vect. Ecol. -1997. - Vol.22. - P. 52-63.
7. Plyusnina A., Laakkonen J., Niemimaa J. et al. // Virol. J. - 2008. - Vol. 5. - P. 4.
8. Vapalahti O, Lundkvist A., Fedorov V. et al. // J. Virol. -1999. Vol. 73. - P. 5586-5592.
9. Zou Y., Wang J.B., Gaova H.S. et al. // J. Med. Virol. -2008. - Vol. 80. - P. 680-688.
Поступила в редакцию 14.05.2008.
HANTA VIRUSES, CIRCULATING IN MICE MICROTUS
FORTIS AND MICROTUS MAXIMOWICZII
L.N. Yashina1, L.I. Ivanov?, R.A. Slonova3, G.G. Kompanets3,
V.V. Gutorov1, T.V. Kushnareva3, N.P. Vysochina2, S.A. Abramov4, T.A. Dupal4, N.M. Puhovska’a2, N.I. Zdanovska’a2 1 State scientific centre of virology and biotechnologies «Vector» (Koltsovo, Novosibirsk area), 2 Khabarovsk antiplague station Rospotrebnadzor, 3 Scientific research institute of epidemiology and microbiology of the Siberian branch of the Russian Academy of Medical Science (Vladivostok), 4 Institute of systematization and ecology of animals Siberian branch of the Russian Academy of Science (Novosibirsk)
Summary — By the method of a return transcription - polymerase chain reaction with the subsequent 8 strains of Hantavirus, allocated from mice sorts Microtus from Far East region of Russia have been investigated. Independent zoological definition of a kind of rodents of carriers and the analysis of mitochondrial DNA have been done. The comparative analysis established nucleotide sequences of fragments of M of a segment virus of genome of the Hantavirus and m-DNA of mice with nucleotide sequences submitted in database GenBank, has revealed circulation of two genotypes KBRV and VLAV in two kinds of rodents — carriers of viruses. Our researches for the first time have revealed circulation of genotypes KBRV in mice M. maximowiczii and VLAV in mice M. fortis in territory of the Amur area, and also have confirmed circulation VLAV in mice M. fortis in territory of Primorsky Krai. Key words: hantavirus infection, mice, genotype.
Pacific Medical Journal, 2008, No. 2, p. 47—49.
90
76
99
99
99
100
75
