Гуморальный иммунный ответ к вирусу Эпштейна-Барр в диагностике рака носоглотки (обзор литературы и 30-летний опыт собственных исследований)

Гурцевич Владимир Эдуардович; Степина Вера Николаевна; Сенюта Наталья Борисовна; Гончарова Елена Васильевна; Щербак Лиана Нодаровна; Душенькина Татьяна Егоровна; Репкина Ирина Анатольевна; Белоусова Нина Васильевна; Кондратьева Татьяна Тихоновна; Алиева Севил Багатуровна; Ахундов Азер Алиевич; Матякин Евгений Григорьевич; Поддубный Борис Константинович; Пробатова Наталья Александровна; Пачес Александр Ильич

Владимир Эдуардович Гурцевич1, Вера Николаевна Степина2, Наталья Борисовна Сенюта3, Елена Васильевна Гончарова4,

Лиана Нодаровна Щербак5, Татьяна Егоровна Душенькина6,

Ирина Анатольевна Репкина7, Нина Васильевна Белоусова8,

Татьяна Тихоновна Кондратьева9, Севил Багатуровна Алиева10,

Азер Алиевич Ахундов11, Евгений Григорьевич Матякин12,

Борис Константинович Поддубный13, Наталья Александровна Пробатова14,

Александр Ильич Пачес15

ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ К ВИРУСУ ЭПШТЕЙНА—БАРР В ДИАГНОСТИКЕ РАКА НОСОГЛОТКИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И 30-ЛЕТНИЙ ОПЫТ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ)

1 Профессор, д. м. н., заслуженный деятель науки РФ, заведующий, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

2 Д. м. н., старший научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза

РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

3 К. м. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза

РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

4 К. м. н., научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза

РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

5 К. м. н., научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза

РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

6 Ведущий инженер, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

7 Ведущий инженер, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

8 Профессор, д. м. н., ведущий научный сотрудник, эндоскопическое отделение НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

9 Д. м. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория клинической цитологии НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

10 К. м. н., старший научный сотрудник, радиологическое отделение НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

11 Д. м. н., старший научный сотрудник, хирургическое отделение №11 (опухолей верхних дыхательнопищеварительных путей) НИИ клинической онкологии РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

12 Профессор, д. м. н., заведующий, отделение хирургическое №11, (опухолей верхних дыхательнопищеварительных путей) НИИ клинической онкологии РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

13 Профессор, д. м.. н., заведующий, эндоскопическое отделение НИИ клинической онкологии

РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

14 Профессор, д. м.. н., ведущий научный сотрудник, патологоанатомическое отделение НИИ клинической онкологии РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

15 Профессор, д. м.. н., ведущий научный сотрудник, отделение хирургическое № 4 (опухолей головы и шеи) НИИ клинической онкологии РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Гурцевич Владимир Эдуардович;

e-mail: [email protected]

Подведен итог многолетних исследований по оценке эффективности серологической диагностики рака носоглотки методом непрямой иммунофлуоресценции с помощью титров и спектра гуморальных антител к белкам литической инфекции вируса Эпштейна—Барр. Изучена сыворотка/плазма крови 648 больных с клинически и гистологически установленным диагнозом рака носоглотки, 177 больных с увеличенными лимфатическими узлами в области шеи без невыявленного первичного очага опухоли, а также 171 больного с другими опухолями головы и шеи. Показана высокая информативность для диагностики и дифференциальной диагностики недифференцированного варианта рака носоглотки антител класса IgG к капсидному и раннему, а также антител класса 1дА к капсидному антигенам вируса. Созданное на базе совокупного анализа этих маркеров решающее правило позволяло в неэндемичных для указанного заболевания регионах (каковыми являются Россия и страны бывшего СССР) выявлять недифференцированный вариант рака носоглотки с достоверностью 90%.

Ключевые слова: вирус Эпштейна—Барр, рак носоглотки, метод непрямой иммунофлуоресценции, капсидный и ранний антигены вируса, диагностика, дифференциальная диагностика.

В течение последних 25 лет наблюдается значительная экспансия опухолей, ассоциированных с вирусом Эпштейна—Барр (ВЭБ). К их числу кроме хорошо известной африканской лимфомы Беркитта относят определенные варианты лимфомы Ходжкина, целый ряд лим-фом, возникающих у больных с иммунодефицитными состояниями различного происхождения, в том числе у больных со СПИДом. Не исключается вирусное происхождение некоторых морфологических форм рака желудка и опухолей гладкомышечного происхождения. Результаты молекулярно-эпидемиологических исследований свидетельствуют, что для большинства указанных опухолей ассоциация с ВЭБ варьирует в зависимости от географического происхождения больного, воздействия на организм канцерогенных факторов (паразитарных инфекций, пищевых канцерогенов), а также так называемых собственно хозяйских факторов. К числу последних относят ослабленный иммунный ответ на вирусную инфекцию, ослабленный локальный иммунный ответ, определенный НЬА-генотип хозяина, наследственная предрасположенность, действия эпигенетических механизмов, приводящих к метилированию генов опухолевых супрессоров, других генов и т. д. [1—4]. По данным молекулярных и морфологических исследований, в некоторых ассоциированных с ВЭБ опухолях вирус присутствует только в отдельных опухолевых клетках. В связи с этим возникает вопрос о роли вируса в патогенезе таких опухолей.

От перечисленных новообразований существенно отличается рак носоглотки (РНГ) — опухоль эпителиального происхождения, описанная впервые Regaud и Schmincke в 1921 г. РНГ диагностируют во всем мире с различной частотой. В западных странах это новообразование регистрируют редко (менее 0,5 случая на 100 000 населения в год). Примерно с такой же частотой РНГ встречается и на территории бывшего СССР, включая Россию. В частности, в структуре злокачественных новообразований в России в 2006 г. опухоли носоглотки у мужчин составляли 0,15%, а у женщин 0,08% [5]. В то же время в некото-

© Гурцевич В. Э., Степина В. Н., Сенюта Н. Б., Гончарова Е. В., Щербак Л. Н., Душенькина Т. Е., Репкина И. А., Белоусова Н. В., Кондратьева Т. Т., Алиева С. Б., Ахундов А. А., Матякин Е. Г., Поддубный Б. К., Пробатова Н. А., Пачес А. И., 2011 УДК 616.327.2-006.6-073.524:578.825.13(048.8)

рых регионах Юго-Восточной Азии, Северной Африки, в Гренландии и на Аляске заболеваемость РНГ достигает 25—30 случаев на 100 000 населения в год [6—8].

Согласно классификации ВОЗ [9] РНГ морфологически подразделяется на 3 типа: ороговевающий рак (keratinising squamous cell carcinoma) и неороговеваю-щий рак (non-keratinising squamous cell carcinoma), в состав которого как подтип входит недифференцированный рак носоглотки — нРНГ (undifferentiated carcinoma). Для неороговевающего рака обычно характерна обильная лимфоидная инфильтрация, состоящая из лимфоцитов, гистиоцитов, эозинофилов и других реактивных клеточных элементов [10]. Эти опухоли также получили название «лимфоэпителиальный рак» или «лим-фоэпителиома». В настоящее время ассоциация с ВЭБ некератинизирующего рака, особенно недифференцированного типа, хорошо доказана. Практически все случаи нРНГ являются ВЭБ-позитивными независимо от страны проживания и этнической принадлежности больного. Важно также отметить, что вирус присутствует во всех опухолевых клетках в отличие от ряда других патологий, ассоциированных с этим вирусом, причем вирусный геном у этих больных можно обнаружить уже на ранних стадиях опухолевого процесса [11]. Для большинства больных нРНГ характерны повышенные титры гуморальных антител (АТ) к ВЭБ [12; 13], которые поднимаются до высоких уровней задолго до установления диагноза [14]. Эти находки позволили предположить, что ВЭБ может участвовать в патогенезе нРНГ еще в доклинической фазе болезни. На основании этих данных, а также результатов лабораторных исследований, доказавших трансформирующий (онкогенный) потенциал ВЭБ [15], этот вирус экспертами Международного агентства по изучению рака (МАИР) был отнесен к 1-й группе канцерогенов, т. е. к факторам доказанной кан-церогенности для человека.

Цель настоящего исследования — подвести итог 30-летнего изучения гуморального ответа к ВЭБ у больных с опухолями головы и шеи и показать высокую информативность серологических маркеров вируса для диагностики нРНГ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования служили сыворотка или плазма крови 648 больных с морфологически установленным диагнозом РНГ, 177 больных с лимфатиче-

скими узлами в области шеи из невыявленного первичного очага, а также 171 больного другими опухолями головы и шеи (ДОГШ), не локализованными в носоглотке. Материал был собран в период с 1980 по 2010 г. в отделениях опухолей головы и шеи, верхних дыхательно-пишеварительных путей, радиологическом и эндоскопии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. В качестве контрольных были исследованы сыворотки от 586 здоровых лиц

12 возрастных групп, в каждой из которых число лиц колебалось от 16 до 95. Образцы крови здоровых детей были получены из детской клинической больницы № 2 им. И. В. Русакова. Образцы крови от взрослых лиц были получены на Центральной станции переливания крови Москвы, в отделении переливания крови РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН и в доме престарелых № 1 г. Москвы. Кроме того, в качестве контрольных были также сыворотки от больных сифилисом (32 образца) и туберкулезом (28 образцов), полученные из инфекционной клинической больницы № 1 Москвы.

Реакция непрямой иммунофлуоресценции

Для тестирования исследуемых сывороток или плазмы крови на наличие АТ к белкам раннего антигенного комплекса ВЭБ и для определения их титров использовали клеточные линии: P3HR1, продуцирующую вирус и синтезирующую его капсидный антиген (ВКА), который является структурным компонентом вирусного капсида, и вируснепродуцирующую клеточную линию Raji, синтезирующую после обработки индукторами ранний антиген (РА) вируса. Для получения клеток, продуцирующих РА и ВКА, клеточную линию Raji, обрабатывали TPA (12-О-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат) в концентрации 20 нг/мл в сочетании с бутиратом Na в дозе 3 мкМ/мл в течение 3—5 дней, а клеточную линию P3HR1 — только TPA в течение 3—6 дней в той же дозе. В результате обработки индукторами в каждой клеточной линии имелось примерно 10% антигенсодержащих клеток. После отмывки в PBS клеточную суспензию каждой линии наносили на предметные стекла в виде изолированных капель, которые высушивали на воздухе и фиксировали охлажденным ацетоном. Приготовленные препараты до использования хранили при температуре —20 °С. При постановке реакции на каждую каплю фиксированных клеток наносили соответствующие 10-кратные разведения сыворотки от 1 : 10 до 1 : 2560, а в качестве контроля — известные высокопозитивную или негативную сыворотки в разведении 1 : 20. Препараты инкубировали во влажной камере в течение 30 мин при температуре 37 °C, отмывали PBS и вновь инкубировали при тех же условиях с АТ против глобулинов IgG или IgA человека (Sigma США; ИЭМ им. Н. Ф. Гамалея, Россия). Реакцию оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа фирмы «Opton» (Япония). Наличие АТ к вирусу определяли по ярко-зеленому свечению клеток на фоне негативных клеток. Титром АТ считали то последнее разведение сыворотки или плазмы, в котором обнаруживали не менее 5% специфически флуоресцирующих клеток (при четких позитивном и негативном контролях). В каждой группе обследуемых лиц подсчитывали средние геометрические значения (СГЗ) титров АТ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Известно, что ВЭБ является убиквитарным герпес-вирусом человека, инфицированность которым взрослого населения планеты превышает 90%. Первичное инфицирование этим вирусом происходит в ранние годы жизни и протекает, как правило, бессимптомно. Инфицирование ВЭБ в более поздние годы может привести к клиническому синдрому под названием «инфекционный мононуклеоз» (ИМ) — доброкачественному лимфопролиферативному заболеванию, которое завершается, как правило, самовыздоровлением [16; 17]. После первичного инфицирования вирус в организме персистирует в течение всей жизни хозяина и в большинстве случаев без клинических проявлений. При этом у каждого индивидуума экспрессия вируса устанавливается на определенном уровне и контролируется иммунной системой организма. Между организмом человека и вирусом устанавливается некий баланс: ослабление иммунитета ведет к усилению экспрессии вируса, и наоборот, уровень экспрессии вируса снижается при восстановлении иммунитета. Указанную закономерность мы могли наблюдать при изучении гуморального ответа к ВЭБ среди 12 возрастных групп практически здоровых лиц (рис. 1).

Из представленного графика следует, что титры АТ класса IgG к ВКА и РА после их появления в возрасте 6 мес становятся максимальными к 2—4 годам. В последующие годы титры вирус-специфических АТ колеблются незначительно. Существенное повышение титров АТ обнаружено лишь у лиц старше 55 лет, особенно в группе лиц старше 70 лет, функциональная активность иммунитета у которых существенно снижена.

Возрастные группы

Рисунок 1. Динамика титров АТ к ВЭБ в различных возрастных группах населения России. 1 — СГЗ титров АТ класса ^ к ВКА; 2 — СГЗ титров АТ класса ^ к РА. I—XII — возрастные группы: I — 0—0,5 года; II — 0,6—2 года; III — 3—4 года; IV — 5—9 лет; V — 10—14 лет; VI — 15—19 лет; VII — 20—24 года; VIII — 25—34 года; IX — 35—44 года; X — 45—54 года; XI — 55— 69 лет; XII — 70 лет и старше.

В нашей работе особое внимание было уделено РНГ, недифференцированный вариант которого (нРНГ), по данным ряда зарубежных авторов, в эндемичных регионах сопровождается высокими уровнями ВЭБ-специфических АТ [18—20]. Данные об ассоциации РНГ с ВЭБ в неэндемичных регионах в середине 70-х годов XX века, т. е. к началу проведения этого исследования, были представлены лишь в отдельных публикациях, которые немногочисленны и в настоящее время [12; 21; 22]. При проведении аналогии с лимфомой Беркитта, которая характеризуется выраженной ассоциацией с ВЭБ в эндемичных для нее регионах и практическим отсутствием такой ассоциации в неэндемичных, оставался открытым вопрос о степени ассоциации ВЭБ с РНГ в неэндемичных регионах и обусловливало необходимость его самостоятельного углубленного изучения. При этом было показано, что ороговевающий вариант рака в регионах с высоким уровнем заболеваемости РНГ в 100% случаев ассоциирован с ВЭБ, тогда как в регионах с низким уровнем заболеваемости такая ассоциация с вирусом обнаружена только в 1/3 случаев [10].

Для объективной оценки иммунного ответа к ВЭБ у больных РНГ в России и странах бывшего СССР, где заболевание встречается редко, нами разработано так называемое решающее правило, основанное на информативности различных серологических маркеров ВЭБ для диагностики нРНГ. В частности, нами ранее установлено, что наиболее информативными являются сочетания определенных титров АТ классов IgG и 1дА к ВКА и АТ класса IgG к РА вируса. С помощью многофакторного анализа были определены оптимальные сочетания этих

3 серологических маркеров и выведено решающее правило, позволяющее по характеру иммунного ответа к указанным антигенам осуществлять диагностику нРНГ с достоверностью 90% (табл. 1) [12].

На следующем этапе диагностическая значимость серологических маркеров ВЭБ решающего правила была проверена в группах больных с клинически и морфологически установленным диагнозом нРНГ, а также больных с другой патологией, включая ДОГШ (табл. 2). По приведенным данным, у 73 (95%) из 77 больных нРНГ гуморальный ответ к вирусу был характерным для этого заболевания: титры и спектр вирус-специфических АТ согласно решающему правилу соответствовали диагнозу нРНГ. Число позитивных случаев, т. е. случаев с типичными для нРНГ спектром и титрами АТ в группе больных ДОГШ составило 8% (13 из 171), а у больных сифилисом 6% (2 из 32). Ни одного позитивного случая не было обнаружено в группах больных туберкулезом (28) и доноров крови (83).

Используя решающее правило, мы изучили гуморальный ответ к ВЭБ у 648 больных с патологией в области носоглотки. Из указанного числа у 402 (62%) диагноз нРНГ был подтвержден серологически и клинически, а у остальных 246 (38%) на основании выявленных низких титров и ограниченного спектра антивирусных АТ этот вариант РНГ был отвергнут. Следует отметить, что титры АТ к ВЭБ в известной степени отражали размер опухоли и степень ее метастазирования в регионарные лимфатические узлы, т. е. коррелировали с опухолевой нагрузкой (табл. 3). Исключение составили больные с максимально

Таблица 1

Решающее правило для дифференциальной диагностики РНГ по титрам АТ классов IgG и 1дД к антигенам ВЭБа

Специфичность антител № группы Разведение сыворотки Диагностический вес значений титров антител, усл. ед.

АТ класса ^ к ВКА 1 1:160 -48

2 1:320 -51

3 1:640 42

4 >1:640 57

АТ класса ^ к РА 1 1:20 -60

2 1:40, 1:80 34

3 >1:80 26

АТ класса !дА к ВКА 1 0 -135

2 1:10 61

3 >1:10 74

а Диагностические веса, соответствующие титрам АТ классов ^ и !дА, необходимо сложить, определить сумму 3 чисел и сравнить с нулем. Положительная сумма с достоверностью 90% указывает на наличие у больного РНГ, отрицательная — с той же достоверностью свидетельствует о ДОГШ или ином заболевании.

распространенным опухолевым процессом, часто находящиеся в предтерминальной стадии, у которых титры АТ классов IgG и ^А существенно снижены по сравнению с менее развернутыми формами болезни. Вероятно, это объясняется угнетением функциональной активности иммунной системы у таких больных.

При обследовании больных нРНГ в динамике характер иммунного ответа к ВЭБ, как правило, отражал клиническое состояние больного. Успешная терапия, приводящая к регрессии опухоли и наступлению ремиссии, сопровождалась снижением титров АТ ко всем ассоциированным с ВЭБ антигенам. В период стойкой ремиссии титры АТ к антигенам ВЭБ могут достигать иногда значений, присущих здоровым лицам. Однако следует отметить некоторую инертность антивирусного иммунного ответа в отражении динамики опухолевого процесса, определяемую временем, которое необходимо для выработки специфических для вируса АТ. Ниже в качестве примера мы приводим гуморальные ответы к ВЭБ у больных нРНГ с разными вариантами течения болезни в ответ на химио- и химиолучевую терапию. При этом на оси абсцисс указаны временные интервалы, прошедшие после исходного тестирования больного на антитела к ВЭБ (нулевая точка). На левой оси ординат представлены титры АТ класса IgG к ВКА ВЭБ, а на правой — IgG к РА и

Таблица 2

Дифференциальная диагностика РНГ с помощью решающего правила

Обследованные группы Число наблюдений Наличие титров и спектра ВЭБ-специфических АТ, характерных для нРНГ

число случаев %

Больные нРНГ 77 73 95

Больные ДОГШ 171 13 8

Больные сифилисом 32 2 6

Больные туберкулезом 28 0 0

Доноры крови 83 0 0

1дА к ВКА. Примеры серологического ответа на положительный эффект от примененного лечения представлены на рис. 2, А и 2, Б (случаи РНГ590 и РНГ85). Применение у этих больных химиолучевой и лучевой терапии, которая по данным клинического наблюдения в течение соответственно 7 и 12 лет привела к ремиссии, сопровождалась значительным снижением титров АТ ко всем тестируемым антигенам вируса. В случае РНГ590 через 1 год достигнута ремиссия: резорбция опухоли в носоглотке и метастазов в лимфатических узлах (опухоль — 100%; лимфатические узлы — 80%), а затем и полная клиническая ремиссия на протяжении следующих 6 лет (со 2-го по 7-й годы; см. рис. 2, А). В случае РНГ85 ремиссия достигнута также чере год. Она длилась на протяжении последующих 11 лет (со 2-го по 12-й годы; см. рис. 2, Б).

Повышение титров АТ к антигенам ВЭБ в период ремиссии или положительного эффекта терапии (в виде уменьшения размеров опухоли и/или метастазов в шейных лимфатических узлах) свидетельствует об угрозе рецидива опухолевого процесса. Часто повышение титров АТ опережает от полугода до 2 лет клиническое проявление рецидива. Динамика титров АТ к ВЭБ у больных при прогрессировании опухолевого процесса отражена на рис. 3, А и 3, Б (случаи РНГ374 и РНГ47). В первом случае через 0,5 года после курса химиолучевой терапии достигнута ремиссия — резорбция опухоли в носоглотке и метастазов в лимфатических узлах (опухоль — 80%; лимфатические узлы — 50%). Через 1 год отмечен рецидив опухоли в носоглотке, в лимфатических узлах — стабилизация, проведен курс полихимиотерапии (ПХТ); со 2-го по 5-й год достигнута ремиссия (опухоль — 100%; лимфатические узлы — 80%), через 6 лет снова рецидив опухоли в носоглотке, проведен курс ПХТ; с 7-го по 8-й год — клиническая ремиссия (см. рис. 3, А). Во втором случае через 6 мес после химиолучевой терапии отмечен продолженный рост опухоли в носоглотке, проведен курс ПХТ, через 9 мес достигнута клиническая ремис-

сия (опухоль — 80%; лимфатические узлы — 50%), через 22 мес — рецидив опухоли в носоглотке, вновь курс ПХТ и через 26 мес — клиническая ремиссия (см. рис. 3, Б).

Из представленных данных следует, что химиолу-чевая терапия, проведенная у этих больных, оказывала лишь частичный эффект, сопровождаемый временным снижением уровня антивирусных АТ, последующий его резкий подъем указывал на дальнейшее прогрессирование заболевания.

Нарастание титров АТ к антигенам ВЭБ или их стабилизация после терапии свидетельствует об отсутствии лечебного эффекта. Подобная картина гуморального ответа у больных с прогрессированием опухолевого процесса отображена на рис. 4, А и 4, Б (случаи РНГ625 и РНГ49). Из представленных графиков видно, что титры АТ ко всем антигенам вируса, несмотря на проведенную терапию, постепенно нарастали, косвенно отражая прогрессирование опухолевого процесса: в случае РНГ625 через 3 мес после химиолучевой терапии отмечен продолженный рост опухоли в носоглотку и проведен курс ПХТ, через 8 мес достигнута клиническая ремиссия (опухоль — 80%; лимфатические узлы — 80%), но через 17 мес вновь развился рецидив опухоли в носоглотке, проведен курс ПХТ (см. рис. 4, А). В случае РНГ49 клиническая ремиссия достигнута через 0,5—1 год после химиолучевой терапии: резорбция опухоли в носоглотке и метастазов в лимфатических узлах (опухоль — 100%; лимфатические узлы — 80%), через 2—2,5 года развился рецидив опухоли в носоглотке, по поводу чего проведен курс ПХТ (см. рис. 4, Б).

У больных в предтерминальной и терминальной стадиях болезни с тяжелым поражением клеточного и гуморального иммунитета титры специфических для вируса АТ имели тенденцию к резкому падению. Примером

Таблица 3

Гуморальный ответ больных нРНГ к ВЭБ в зависимости от степени распространенности опухолевого процесса“

Характе- ристика опухоли Число наблюде- ний АТ класса !дО к АТ класса !дА к

ВКА РА ВКА

Т1 2 905 57 40

Т2 9 1010 64 25

Т3 26 1345 102 66

Т4 28 881 132 49

N0 13 580 45 40

N1 22 1128 139 74

N2 18 2100 145 88

N3 11 905 113 22

а Представлены СГЗ титров АТ

гуморального ответа к ВЭБ при агрессивно протекающем заболевании, завершившемся летальным исходом, несмотря на последовательное проведение лучевой и химиолучевой терапии, можно было наблюдать у больного РНГ97 (рис. 5): через 3 мес после курса химиолу-чевой терапии отмечен продолженный рост опухоли в носоглотку, по поводу чего проведен курс ПХТ, и через

5 мес достигнута клиническая ремиссия (опухоль — 80%; лимфатические узлы — 50%); через 8 мес выявлены метастазы в плечевой кости, проведена химиолучевая терапия; через 9 мес обнаружены метастазы в головном

700

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

600

500 га

400

300

200 А

100

Период наблюдения, годы

0

A

мозге и вновь проведена химиолучевая терапия, однако через 10 мес больной умер от прогрессирования основного заболевания. Исходно высокие титры АТ, особенно АТ класса IgG к ВКА и РА, за несколько месяцев до выявления метастазов в плечевой кости и в головном мозге подверглись резкому снижению, предварив летальный исход на 10-м месяце наблюдения за больным.

Клинические наблюдения позволили выявить, что если локализация опухоли ограничивается носоглоткой, то прогноз для больного более благоприятный, чем при ее распространенной форме, при которой в опухолевый

Период наблюдения, годы

Б

Рисунок 2. Динамика титров АТ к ВЭБ у больных РНГ в состоянии длительной ремиссии опухолевого процесса. 1 — титры АТ класса ^ к ВКА; 2 — титры АТ класса ^ к РА; 3 — титры АТ класса !дА к ВКА.

А. Больной Т., 28 лет (РНГ590): ремиссия опухолевого процесса в течение 7-летнего наблюдения; клинический статус при поступлении Т2Ы1М0, II стадия. Б. Больной М., 67 лет (РНГ85): ремиссия опухолевого процесса в течение 12-летнего наблюдения. Клинический статус при поступлении: Т3Ы1М0, III стадия.

А

а.

1

и

*

%

Период наблюдения, годы

Период наблюдения, мес

А

Б

Рисунок 3. Динамика титров АТ к ВЭБ у больных РНГ с чередующимися ремиссиями и рецидивами опухолевого процесса.

1 — титры АТ класса ідй к ВКА; 2 — титры АТ класса ідй к РА; 3 — титры АТ класса 1дА к ВКА.

А. Больной Я., 41 года (РНГ374); клинический статус при поступлении: Т4ШМ0, IV стадия. Б. Больная К., 26 лет (РНГ47); клинический статус при поступлении: Т3ЖМ0, IV стадия.

процесс вовлечены окружающие мягкие ткани, кости, лимфатические узлы и имеются метастазы в отдаленных органах [23]. Однако клиническое проявление болезни в результате ее длительного бессимптомного течения и анатомо-топографических особенностей носоглотки, а также несовершенства традиционных, широко применяемых диагностических тестов существенно запаздывает.

Об этом свидетельствует то, что 70—80% больных поступают в стационар для лечения уже на III—IV стадии болезни [20; 24]. Особенно трудны для диагностики случаи нРНГ, при которых опухоль в носоглотке эндоскопически не выявляется и проявление заболевания ограничивается лишь увеличением шейных лимфатических узлов. В этой ситуации необходимы дополнительные методы

Период наблюдения, мес

А

Б

Рисунок 4. Динамика титров АТ к ВЭБ у больных РНГ в состоянии рецидива опухолевого процесса. 1 — титры АТ класса ^ к ВКА; 2 — титры АТ класса ^ к РА; 3 — титры АТ класса !дА к ВКА.

А. Больная К., 50 лет (РНГ49); клинический статус при поступлении: Т3Ы1М0, III стадия. Б. Больной Г., 27 лет (РНГ 625); клинический статус при поступлении: Т4Ы2М0, IV стадия.

Период наблюдения, мес

Рисунок 5. Динамика титров АТ к ВЭБ у больного РНГ при прогрессировании опухолевого процесса, приведшего к летальному исходу. Больной П. 34 лет (РНГ97); клинический статус при поступлении: Т4ШМ0, IV стадия. 1 — титры АТ класса ідй к ВКА; 2 — титры АТ класса ідй к РА; 3 — титры АТ класса ідА к ВКА.

исследования, способствующие более раннему выявлению болезни. Таким методом стал серологический тест на наличие в сыворотке крови больных диагностических титров, специфических для ВЭБ АТ. В наших многолетних исследованиях иммунный ответ к ВЭБ был изучен у 177 больных с увеличенными шейными лимфатическими узлами в отсутствие опухоли в носоглотке при эндоскопическом исследовании. Из указанного числа больных у 97 (54,8%) обнаружены диагностические для нРНГ титры АТ к ВЭБ. В этих случаях серологический диагноз нРНГ нуждался в морфологическом подтверждении, которое оказалось возможным при дополнительном углубленном эндоскопическом исследовании.

обсуждение

Проведенные исследования показали, что при динамическом наблюдении за опухолевым процессом у больных РНГ наиболее информативными являются АТ класса 1дА к ВКА ВЭБ. У здоровых лиц АТ этой специфичности обнаруживаются редко — в 2—10% случаев, в то время как у больных РНГ — в 90% случаев. Чувствительность и специфичность АТ класса 1дА к ВКА для диагностики РНГ, по данным других авторов, составили 90 и 89,5% соответственно [18], что практически совпадает с результатами наших исследований. О диагностической ценности АТ класса 1дА к ВКА свидетельствует и то, что скрининговое обследование для выявления этих специфических для вируса АТ в разведениях >1 : 10, проведенное среди здоровой популяции в эндемичных по РНГ регионах (Китай, Гонг-Конг), позволило выявлять больных с опухолями до клинического проявления болезни. При этом повышенные титры указанных АТ к ВЭБ у этих лиц были обнаружены и поддерживались на высоком уровне часто

за 10 лет до установления диагноза [20], что явилось залогом эффективности терапевтических мероприятий.

Дискуссия о типе клеток, в которых персистирует ВЭБ (а именно об эпителиальных клетках носоглотки или В-клетках), позволила прийти к выводу о том, что основным резервуаром вируса в организме человека являются покоящиеся В-клетки памяти, которые являются объектом первичной инфекции этим вирусом [25; 26]. И хотя репликация ВЭБ четко определяется в поверхностных слоях эпителия волосатоклеточной лейкоплакии, поражения языка у больных со СПИДом, доказательства наличия персистирующей латентной инфекции при этой патологии отсутствуют [27]. Возникает вопрос, как и когда происходит заражение эпителиальных клеток носоглотки в процессе патогенеза РНГ. В результате исследований ВЭБ не был обнаружен ни в нормальных эпителиальных клетках носоглотки, ни в клетках, прилежащих к ВЭБ-позитивным опухолям этой анатомической области [28; 29].

В то же время наличие ВЭБ было доказано в носоглоточных карциномах in situ, которые предшествуют возникновению РНГ [30]. Совокупность результатов проведенных исследований позволяет предположить, что инфицирование эпителиальных клеток носоглотки ВЭБ происходит до начала инвазивного роста, но, скорее всего, не является первым этапом в патогенезе РНГ. Данное предположение поддерживается и результатами работ, проведенных in vitro. Они показали, что инфицирование ВЭБ эпителиальных клеток возможно только в случае, если клетки приобретают недифференцированный фенотип [31]. Таким образом, напрашивается вывод о том, что эпителиальные клетки могут становиться чувствительными к инфицированию ВЭБ, приобретя недифференцированный фенотип в результате воздействия на них факторов окружающей среды. Примером таких факторов могут служить нитрозамины, содержащиеся в соленой рыбе, которую с детских лет употребляют в Китае, канцерогенные вещества, входящие в состав табачного дыма, при курении, а также онкогенные варианты вирусов папилломы человека, попадающие в ротовую полость главным образом при орально-генитальных контактах [32—35].

Еще одна тема, которая до сих пор активно обсуждается, — механизм, с помощью которого вирус проникает в эпителиальную клетку. Рецептор, способствующий инфицированию В-клеток ВЭБ, CD-21, в эпителиальных клетках человека in vivo не экспрессируется [36], хотя в опытах in vitro низкая степень экспрессии CD-21 была все же зарегистрирована рядом исследователей [37; 38]. При этом показано, что заражение эпителиальных клеток происходит эффективно лишь при прямом контакте (слиянии) с инфицированными вирусом В-клетками [39]. Присутствие в слизистой оболочке носоглотки лимфоцитов, продуцирующих ВЭБ в результате литической инфекции, действительно предполагает возможность реализации механизма заражения этим вирусом эпителиальных клеток in vivo [29].

заключение

Результаты наших исследований показали, что развитие нРНГ у больных в России и странах бывшего СССР,

как и в эндемичных регионах, сопровождается выработкой АТ к ВЭБ в высоких титрах. Это может быть использовано в качестве важного серологического маркера для диагностики нРНГ. По нашим данным, высокую диагностическую ценность имеют АТ к ВКА классов IgG и IgA и АТ класса IgG к РА вируса. Решающее правило, полученное на основе многофакторного анализа этих 3 маркеров серологического ответа к ВЭБ, позволило нам диагностировать нРНГ с достоверностью 90%. Динамическое наблюдение за титрами и спектром АТ, специфических для ВЭБ, позволяло также следить за клиническими проявлениями болезни и служить прогностическим фактором. Высокие титры АТ или их повышение свидетельствовали

о прогрессировании заболевания, их снижение после лечения — о ремиссии патологического процесса.

Ввиду клинической особенности РНГ — раннего ме-тастазирования в лимфатические узлы шеи без визуально и часто эндоскопически выявляемой патологии в носоглотке — диагностика этого новообразования часто бывает затруднена или ошибочна. С развитием в последние годы молекулярной диагностики, особенно с применением количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, а также метода определения концентрации вирусной ДНК в плазме крови больных методом ПЦР в реальном времени, стало доступно большее число показателей для обнаружения АТ и антигенов, специфических для ВЭБ, которые могут быть использованы в качестве маркеров для диагностики и терапии РНГ [40—42].

Исследования, однако, показали, что не все из этих маркеров обладают достаточной диагностической чувствительностью и точностью, не говоря уже о непростых условиях широкого применения этих методов в клинике. Клиницисты же нуждаются в технически доступном, простом и надежном подходе к диагностике и дифференциальной диагностике нРНГ. В этом плане тест на серологические маркеры ВЭБ, определяющий титры и спектр АТ к комплексу антигенов литической инфекции вируса, может стать незаменимым дополнительным методом, существенно расширяющим стандартные подходы к диагностике и мониторингу нРНГ. Наш 30-летний опыт серологической диагностики этой патологии, полученный на базе клинических отделений РОНЦ им. Н. Н. Блохина, свидетельствует в пользу такого заключения.

Работа поддержана грантом. РФФИ (проект №10-04-00060а).

ЛИТЕРАТУРА

1. The extent of genetic diversity of Epstein-Barr virus and its geographic and disease patterns: a need for reappraisal / Chang C. M., Yu K. J., Mbulaiteye S. M., Hildesheim A., Bhatia K. // Virus Res. — 2009. — Vol. 143. — P. 209—221.

2. Cho W. C. Nasopharyngeal carcinoma: molecular biomarker discovery and progress // Mol. Cancer. — 2007. — Vol. 6. — P. 1—9.

3. Li J., Qian C. N., Zeng Y. X. Regulatory T cells and EBV associated malignancies // Int. Immunopharmacol. — 2009. — Vol. 9. — P. 590—592.

4. HLA associations with nasopharyngeal carcinoma / Li X., Fasa-no R., Wang E., Yao K. T., Marincola F. M. // Curr. Mol. Med. — 2009. — Vol. 9. — P. 751—765.

5. Давыдов М. И., Аксель Е. М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ // Вестн. РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 2008. — Т 19, №2 (прил. 1).

6. Nasopharyngeal carcinoma in Alaskan Eskimos Indians, and Aleuts: a review of cases and study of Epstein-Barr virus, HLA, and environmental risk factors / Lanier A., Bender T., Talbot M., Wilmeth S., Tschopp C., Henle W., Henle G., Ritter D., Terasaki P. // Cancer — 1980. — Vol. 46. — P. 2100—2106.

7. Yu M. C. Nasopharyngeal carcinoma: epidemiology and dietary factors // IARC Sci. Publ. — 1991. — Vol. 105. — P. 39—47.

8. Yu M. C., Yuan J. M. Epidemiology of nasopharyngeal carcinoma // Semin. Cancer Biol. — 2002. — Vol. 12. — P. 421—429.

9. Pathology and genetics head and neck tumors / Barnes L., Eve-son J. W., Reichart P., Sidransky D. (ed.) — Lyon: IARC Press, 2005.

10. Brennan B. Nasopharyngeal carcinoma // Orphanet. J. Rare. Dis. — 2006. — Vol. 1. — P. 23—28.

11. Epstein-Barr virus carriage by nasopharyngeal carcinoma in situ // Yeung W. M., Zong Y. S., Chiu C. T., Chan K. H., Sham J. S., Choy D. T., Ng M. H. // Int. J. Cancer. — 1993. — Vol. 53. — P. 746—750.

12. Epstein-Barr viral serology in nasopharyngeal carcinoma patients in the USSR and Cuba, and its value for differential diagnosis of the disease / Gurtsevitch V., Ruiz R., Stepina V., Plachov I., Le Riverend E., Glaz-kova T., Lavoue M. F., Paches A., Aliev B., Mazurenko N. // Int. J. Cancer. — 1986. — Vol. 37. — P. 375—381.

13. Niedobitek G. Epstein-Barr virus infection in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma // Mol. Pathol. — 2000. — Vol. 53. — P. 248—254.

14. Ho H. C., Ng M. H., Kwan H. C. Factors affecting serum IgA antibody to Epstein-Barr viral capsid antigens in nasopharyngeal carcinoma // Br. J. Cancer. — 1978. — Vol. 37. — P. 356—362.

15. Expression of the Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 induces B cell lymphoma in transgenic mice / Kulwichit W., Edwards R. H., Davenport E. M., Baskar J. F., Godfrey V., Raab-Traub N. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A — 1998. — Vol. 95. — P. 11 963—11 968.

16. Evans A. S. Clinical syndromes associated with EB virus infection // Adv. Intern. Med. — 1972. — Vol. 18. — P. 77—93.

17. Epstein-Barr virus (EBV) infection in infectious mononucleosis: virus latency, replication and phenotype of EBV-infected cells / Nie-dobitek G., Agathanggelou A., Herbst H., Whitehead L., Wright D. H., Young L. S. // J. Pathol. — 1997. — Vol. 182. — P. 151—159.

18. Combined determination of Epstein-Barr virus-related antibodies and antigens for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma / Luo Y. L., Ou G. P., Chi P. D., Liang Y. N., Liu Y. H., Huang M. Y. // Ai. Zheng. — 2009. — Vol. 28. — P. 76—78.

19. Diagnostic value of Epstein-Barr virus capsid antigen-IgA in nasopharyngeal carcinoma: a meta-analysis // Li S., Deng Y., Li X., Chen Q. P., Liao X. C., Qin X. // Chin. Med. J. (Engl.). — 2010. — Vol. 123. — P. 1201—1205.

20. Detection of Stage I nasopharyngeal carcinoma by serologic screening and clinical examination / Ji M. F., Yu Y. L., Cheng W. M., Zong Y. S., Ng P. S., Chua D. T., Ng M. H. // Chin. J. Cancer. — 2011. — Vol. 30. — P. 120—123.

21. Clinical values of multiple Epstein-Barr virus (EBV) serological biomarkers detected by xMAP technology / Gu A. D., Lu L. X., Xie Y. B., Chen L. Z., Feng Q. S., Kang T., Jia W. H., Zeng Y. X. // J. Transl. Med. — 2009. — Vol. 7. — P. 73—81.

22. Epstein-Barr virus detection in nasopharyngeal carcinoma: implications in a low-risk area // Breda E., Catarino R. J., Azevedo I., Lobao M., Monteiro E., Medeiros R. // Braz. J. Otorhinolaryngol. — 2010. — Vol. 76. — P. 310—315.

23. Prognostic value of paranasopharyngeal extension of nasopharyngeal carcinoma. A significant factor in local control and distant metastasis / Chua D. T., Sham J. S., Kwong D. L., Choy D. T., Au G. K., Wu P. M. // Cancer. — 1996. — Vol. 78. — P. 202—210.

24. Современная диагностика рака носоглотки / Белоусова Н. В., Поддубный Б. К., Унгиадзе Г. В., Кондратьева Т. Т., Архипов В. В., Пробатова Н. А., Гурцевич В. Э., Степина В. Н., Щербак Л. Н., Михайлова Н. А., Новикова Е. В. // Современ. онкол. — 2000. — Т. 2. — № 3. — С. 78—82.

25. Niedobitek G., Young L. S. Epstein-Barr virus persistence and virus-associated tumours // Lancet. — 1994. — Vol. 343. — P. 333—335.

26. Thorley-Lawson D. A., Miyashita E. M., Khan G. Epstein-Barr virus and the B cell: that's all it takes // Trends Microbiol. — 1996. — Vol. 4. — P. 204—208.

27. Epstein-Barr virus infection in oral hairy leukoplakia: virus replication in the absence of a detectable latent phase / Niedobitek G.,

Young L. S., Lau R., Brooks L., Greenspan D., Greenspan J. S., Rickin-son A. B. // J. Gen. Virol. — 1991. — Vol. 72. — P. З0З5—З04б.

28. Analysis of Epstein-Barr virus infection in nasopharyngeal biopsies from a group at high risk of nasopharyngeal carcinoma / Sam C. K., Brooks L. A., Niedobitek G., Young L. S., Prasad U., Rickinson A. B. // Int. J. Cancer. — 1993. — Vol. 53. — P. 957—9б2.

29. Evidence for lytic infection by Epstein-Barr virus in mucosal lymphocytes instead of nasopharyngeal epithelial cells in normal individuals / Tao Q., Srivastava G., Chan A. C., Chung L. P., Loke S. L., Ho F. C. // J. Med. Virol. — 1995. — Vol. 45. — P. 71—77.

30. Clonal proliferations of cells infected with Epstein-Barr virus in preinvasive lesions related to nasopharyngeal carcinoma / Path-manathan R., Prasad U., Sadler R., Flynn K., Raab-Traub N. // N. Engl. J. Med. — 1995. — Vol. 333. — P. б93—б98.

31. In vitro production of stable Epstein-Barr virus-positive epithelial cell clones which resemble the virus:cell interaction observed in nasopharyngeal carcinoma / Knox P. G., Li Q. X., Rickinson A. B., Young L. S. // Virology. — 199б. — Vol. 215. — P. 40—50.

32. Mass spectrometric identification of a phorbol diester 12-O-hexadecanoylphorbol-13-acetate, an Epstein-Barr virus-activating substance, in the soil collected from under Sapium sebiferum / Takeda N., Ohigashi H., Hirai N., Koshimizu K., Suzuki M., Tatematsu A., Osato T., Mizuno F. // Cancer Lett. — 1991. — Vol. 59. — P. 153—158.

33. Liebowitz D. Nasopharyngeal carcinoma: the Epstein-Barr virus association // Semin. Oncol. — 1994. — Vol. 21. — P. 37б—381.

34. Role of the RARRES1 gene in nasopharyngeal carcinoma / Kwok W. K., Pang J. C., Lo K. W., Ng H. K. // Cancer Genet. Cytoge-net. — 2009. — Vol. 194. — P. 58—б4.

35. Enhancive effect of N,N'-dinitrosopiperazine on inducing precan-cerous lesion on nasal and/or nasopharyngeal epithelia of TgN(p53mt-

LMP1)/HT mice / Tian D. F., He Y. C., Lu F. G., Tang F. Q. // J. Zhejiang Univ. Sci. B. — 2009. — Vol. 10. — P. 172—179.

36. Identification of a human epithelial cell surface protein sharing an epitope with the C3d/Epstein-Barr virus receptor molecule of B lymphocytes / Young L. S., Dawson C. W., Brown K. W., Rickinson A. B. // Int. J. Cancer. — 1989. — Vol. 43. — P. 786—794.

37. Characterization of an Epstein-Barr virus receptor on human epithelial cells / Birkenbach M., Tong X., Bradbury L. E., Tedder T. F., Kieff E. J. // Exp. Med. — 1992. — Vol. 176. — P. 1405—1414.

38. Epstein-Barr virus infection and replication in a human epithelial cell system / Li Q. X., Young L. S., Niedobitek G., Dawson C. W., Birkenbach M., Wang F., Rickinson A. B. // Nature. — 1992. — Vol. 356. — P. 347—350.

39. Bayliss G. J., Wolf H. Epstein-Barr virus-induced cell fusion // Nature. — 1980. — Vol. 287. — P. 164—165.

40. Quantitative analysis of aberrant p16 methylation using real-time quantitative methylation-specific polymerase chain reaction / Lo Y. M., Wong I. H., Zhang J., Tein M. S., Ng M. H., Hjelm N. M. // Cancer Res. — 1999. — Vol. 59. — P. 3899—3903.

41. Tan E. L., Looi L. M., Sam C. K. Evaluation of plasma Epstein-Barr virus DNA load as a prognostic marker for nasopharyngeal carcinoma // Singapore Med. J. — 2006. — Vol. 47. — P. 803—807.

42. Plasma EBV DNA clearance rate as a novel prognostic marker for metastatic reccurent nasopharyngeal carcinoma / Wang F. H., Twu C. W., Chen H. Y., Jan J. S., Jiang R. S., Chao J. Y., Liang K. L., Chen K. W., Wu C. T., Lin J. C. // Clin. Cancer Res. — 2010. — Vol. 16. — P. 1016—1024.

Поступила 20.03.2011

Vladimir Eduardovich Gurtsevich1, Vera Nikolayevna Stepina2,

Natalia Borisovna Senyuta3, Elena Vasilievna Goncharova4,

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Liana Nodarovna Scherbak5, Tatiana Egorovna Dushenkina6,

Irina Anatolievna Repkina7, Nina Vasilievna Belousova8,

Tatiana Tikhonovna Kondratyeva9, Sevil Bagaturovna Aliyeva10,

Azer Aliyevich Akhundov11, Evgeniy Grigoryevich Matyakin12,

Boris Konstantinovich Poddubny13, Natalia Alexandrovna Probatova14,

Alexander Ilyich Paches15

HUMORAL IMMUNE RESPONSE TO EPSTEIN—BARR VIRUS IN THE DIAGNOSIS OF NASOPHARYNGEAL CARCINOMA (LITERATURE REVIEW AND 30-YEAR AUTHORS' OWN EXPERIENCE)

1 MD, PhD, DSc, Professor, RF Honored Scientist, Head, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)

2 MD, PhD, DSc, Senior Researcher, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,