CC BY
18
Є
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Гидрофильные регуляторные гексапептиды — ингибиторы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток
В. В. ЛЕБЕДЕВ, С. А. НОВИКОВ, Е. Ю. РЫБАЛКИНА*, Т. Н. ЗАБОТИНА*
ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва
* Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Hydrophilic Regulator Hexapeptides as Inhibitors of Tumor Cell Multiple Drug Resistance
V. V. LEBEDEV, S. A. NOVIKOV, E. YU. RYBALKINA, T. N. ZABOTINA Central Research Institute of Epidemiology, Moscow
N. N. Blokhin Russian Scientific Centre of Oncology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток к действию цитостатических препаратов является одним из наиболее распространённых и тяжёлых осложнений химиотерапии онкологических больнык. Феномен МЛУ может быть вызван резким усилением работы АТФ-зависимых транспортный белков системы ABC, которые обеспечивают откачивание химиопрепаратов из клетки во внеклеточное пространство. До настоящего времени все попытки создания лекарственных средств для преодоления МЛУ оказались безуспешныши. Одним из перспективных направлений разработки такого рода препаратов является применение гидрофильных регуляторный пептидов. B качестве модуляторов МЛУ использовали три гидрофильных регуляторных гексапептида линейной и циклической структуры. Чувствительность опухолевый клеток к различным цитотоксическим препаратам при добавлении пептидов, использованных в работе, определяли с помощью МТТ-теста и прямого подсчёта выживших клеток. B работе исследовали влияние гексапептидов на клетки MCF7, KB8-5 и PC3. Данные позволяют сделать вытод, что гидрофильные гексапептиды линейной и циклической структуры повышают чувствительность опухолевый клеток к цитостатику доксорубицину. Ингибирование МЛУ опухолевый клеток опосредуется через АТФ-зависимый транспортный белок MRP. Обнаруженное свойство гексапептидов указышает на перспективу их использования в качестве лекарственных средств для преодоления МЛУ.
Ключевые слова: доксорубицин, множественная лекарственная устойчивость, опухолевые клетки, цитостатики, гексапептиды.
Multiple drug resistance (MDR) of tumor cells to cytostatics is one of the most often and severe complications of chemotherapy in oncological patients. The phenomenon of MDR could be due to a sharp increase of the activity of the ATP-dependent transport proteins of the ABC system, that provides pumping of the drug from the cells to the extracellular space. Up to now, all the attempts to design agents preventing MDR were of no success. One of the prospective trends is the use of hydrophilic regulator hexapeptides. Three regulator hydrophilic hexapeptides of the linear and cyclic structure were used as the MDR modulators. The sensitivity of the tumor cells to various cytostatics in the presence of the peptides was determined by the MTT-test and the direct counting of the survived cells. The effect of the hexapeptides on MCF7, KB8-5 and PC3 cells was investigated. It was concluded that the hydrophilic hexapeptides of the linear and cyclic structure increased the sensitivity to doxorubicin (a cytostatic). The tumor cell MDR inhibition was mediated by the ATP-dependent transport protein MRP. Such a characteristic of the hexapeptides is of interest for their use as agents preventing MDR.
Key words: doxorubicin, multiple drug resistance, tumor cells, cytostatics, hexapeptides.
Введение
Возникновение множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолевых клеток к ци-тостатическим препаратам представляет собой одну из наиболее актуальный проблем современной химиотерапии. В отличие от лекарственной устойчивости, вызванной мутацией генов резистентно© Коллектив авторов, 2010
Адрес для корреспонденции: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24. РОНЦ им. Н. Н. Блохина
сти, МЛУ возникает в результате активации различных АТФ-зависимых транспортныгх белков семейства ABC, таких как MRP, P-gp и других [1]. Транспортные белки обеспечивают выброс из клеток биологически активных продуктов, токсических соединений и химиотерапевтических препаратов. Резкое усиление выведения из клетки цитостатиков вызывает формирование МЛУ и снижение эффективности химиотерапии.
До настоящего времени все попытки создания лекарственных средств для преодоления МЛУ
-е-
e
оказались безуспешными. Одним из перспективных направлений разработки такого рода препаратов является применение гидрофильных регуляторных пептидов. Обнаружено, что отдельные представители данного класса биологически активных соединений модулируют выброс из клетки флуоресцентных красителей [2]. Однако влияние гидрофильных регуляторных гексапептидов на формирование устойчивости к химиотерапевтическим препаратам оставалось не изученным.
В этой связи представляло интерес изучить модулирующее действие гидрофильных регуляторных гексапептидов на чувствительность опухолевых клеток к цитостатическим препаратам. Исследование указанных свойств необходимо в плане доклинической оценки их применения для преодоления МЛУ.
Материал и методы
Чувствительность опухолевых клеток к различным цито-токсическим препаратам при добавлении пептидов, использованных в работе, определяли с помощью МТТ-теста и прямого подсчёта выживших клеток. Колориметрический метод оценки цитотоксической активности различных веществ с помощью МТТ (3-(4,5-диметил тиазолил-2)-2,5-дифенилтет-разолиум бромид) («Sigma», США) основан на способности митохондриальных дегидрогеназ живых клеток превращать «жёлтый» МТТ в «синий» формазан [3].
В качестве модуляторов использовали гидрофильные регуляторные гексапептиды: имунофан (аргинил-альфа-аспар-тил-лизил-валил-тирозил-аргинин), биопоэтин (лизил-гис-тамил-глицил-лизил-гистамил-глицин), циклобурсин (цикло-лизил-гистамил-глицил-лизил-гистамил-глицин).
В работе исследовали влияние гексапептидов на клетки MCF7 — аденокарцинома молочной железы человека, KB8-5 — карцинома полости рта человека и РС3 — рак предстательной железы человека. MCF7 и РС3 экспрессируют транспортные белки MRP типа. Клетки KB8-5 экспрессируют преимущественно транспортные белки P-gp и в минимальной степени MRP.
Клетки помещали на 96-луночные планшеты в количестве 1—2х 104 на лунку в 100 мкл стандартной среды и добавляли доксорубицин в различных концентрациях и один из гексапептидов до конечной концентрации 0,1 нМ. Через 72 ч инкубации в стандартных условиях в каждую лунку добавляли 20 мкл МТТ и инкубировали ещё 2 ч для прохождения реакции образования формазана. Оптическую плотность образцов определяли через 3—4 суток на многоканальном фотометре («Multiscan», Германия) при длине волны 540 нм. Жизнеспособность клеток оценивали по соотношению оптической плотности в контрольных лунках и лунках с клетками, обработанными препаратами. На каждую исследуемую точку проводили по три определения.
Результаты и обсуждение
Результаты, полученные в предыдущих работах in vitro, демонстрируют способность гидрофильных гексапептидов модулировать работу транспортных белков MRP в сверхнизких дозах, порядка десятых долей наномоля [4]. Специфическая активность гидрофильных гексапептидов не менее чем в 1000 раз превышает действие известных ингибиторов транспортных насосов гидрофобных пептидов таких, как циклоспорин А и его
Рис. 1. Влияние гексапептидов на выживаемость клеток MCF7 при действии доксорубицина.
химические производные [4]. Указанные исследования были выполнены на модели транспорта флуоресцентных красителей родамина 123 и каль-цеина. Существование субстратной специфичности транспортных белков не позволяло оценить действие гидрофильных гексапептидов в отношении других групп химических веществ, в том числе цитостатических препаратов. Поэтому при оценке возможности использования гидрофильных гексапептидов для устранения развития феномена МЛУ возникла необходимость изучить их влияние на транспорт цитостатических препаратов.
Данные, представленные на рис. 1, показывают, что влияние гексапептидов увеличивает чувствительность клеток MCF7 к цитотоксическим препаратам, т. е. снижает уровень МЛУ.
Обнаруженный феномен ингибирования МЛУ может быть обусловлен двумя причинами. Возможно снижение МЛУ связано с ингибированием активности транспортных белков, ответственных за откачивание доксорубицина из клетки. Другой механизм накопления цитостатиков в клетке может быть обусловлен уменьшением количества транспортных белков. Очевидно, что снижение количества транспортных белков в клетке вызовет торможение откачивания и соответственно накопления цитостатика в опухолевых клетках.
Важно отметить, что гексапептиды в клетках с преимущественной экспрессией P-gp не изменяют чувствительность к цитостатику (рис. 2). Возможно, это связано с тем, что в клетках КВ8-5 за транспорт препарата из клетки отвечают белки обоих типов — преимущественно P-gp и в меньшей мере MRP. Вклад этих белков в АТФ-зависи-мый транспорт из клетки во внеклеточное пространство не одинаков. Ингибирование активности белков MRP вызывает компенсаторное увеличение транспорта, опосредованного белками P-gp. С другой стороны, изменение экспрессии транс-
-о-
Є
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рис. 2. Влияние гексапептидов на выживаемость клеток КВ8-5 при действии доксорубицина.
портного белка MRP также может влиять на активность P-gp. Увеличение количества белка MRP приводит к уменьшению активности P-gp и наоборот. Таким образом, посредством сопряженной регуляции активности белков P-gp и MRP, клетки могут контролировать уровень откачивания цитостатиков и соответственно формирование МЛУ.
C целью дальнейшей оценки влияния гидрофильных гексапептидов на формирование МЛУ быши проведены опыты на клетках РС3, экспрессирующих только транспортный белок MRP (рис. 3).
Как видно из результатов, представленных на рис. 3, гексапептиды линейной и циклической структуры увеличивают чувствительность к действию доксорубицина опухолевых клеток, экспрессирующих MRP. Поскольку линия РС3 экспрессирует только один белок MRP, то явление сопряженной регуляции, посредством откачива-
Рис. 3. Влияние гексапептидов на выживаемость клеток РС3 при действии доксорубицина.
ния цитостатика через другие транспортные белки, не возникает.
Выводы
• Гидрофильные гексапептиды линейной и циклической структуры повышают чувствительность к цитостатику — доксорубицину.
• Ингибирование МЛУ опухолевый клеток гидрофильными гексапептидами опосредуется через АТФ-зависимый транспортныш белок MRP.
• Гидрофильные гексапептиды линейной и циклической структуры вызывают повышение чувствительности опухолевых клеток к действию цитостатического препарата в сверхнизких дозах порядка десятых долей нМ, что указывает на перспективу их использования в качестве лекарственных средств для преодоления МЛУ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Krishna R., Mayer L. D. Multidrug resistance (MDR) in cancer. Mechanisms, reversal using modulators of MDR and the role of MDR modulators in influencing the pharmacokinetics of anticancer drugs. Eur. J Pharm. Sci. 2000; 11: 265-283.
2. Корыстов Ю. H, Лебедев В. В. u др. Гексапептид имунофан ингибирует MRP-зависимую множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток. Докл. АН. 2004; Т. 395, 6: 1—4.
Carmichael J., DeGraff W. G. et al. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res 1987; 47: 4: 936—942.
Лебедев В. В., Новиков С. А. Гидрофильный гексапептид имунофан — гиперактивный регулятор транспортных белков множественной лекарственной устойчивости. Бюл. экспер. биол. 2006; 142: 12: 649—651.
