CC BY
1
RM'A'X
https://cmac-joumal.ru
КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ ХИМИОТЕРАПИЯ
Том 26 №1
2024
DOI: 10.36488/cmac.2024.1.4-13
Оригинальная статья
Гены вирулентности у Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis/ выделенных из гемокультуры больных с гематологическими заболеваниями
Фёдорова А.В.1, Хрульнова С.А.1, Ветохина А.В.2, Молчанова И.В.3, Куцевалова О.Ю.4, Клясова Г.А.1
1 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва, Россия
2 ГБУЗ «Иркутская ордена «Знак Почета» областная клиническая больница», Иркутск, Россия
3 ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница», Челябинск, Россия
4 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России, Ростов-на-Дону, Россия
Контактный адрес: Анастасия Владимировна Фёдорова
Эл. почта: [email protected]
Ключевые слова: Еп1еюсосси$ faecium, Еп1егюсюсси$ (аесаИ$, гены вирулентности, гемокультура, гематологические заболевания.
Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
Внешнее финансирование: исследование проведено без внешнего финансирования.
Цель. Изучить гены вирулентности у E. faecium и E. faecalis, выделенных из гемокультуры больных с гематологическими заболеваниями.
Материалы и методы. Гены вирулентности исследовали среди штаммов E. faecium и E. faecalis, выделенных из гемокультуры от больных с гематологическими заболеваниями в четырех лечебных учреждениях России (2002-2020 гг.). Чувствительность к ванкомицину определяли методом серийных микроразведений в бульоне (CLSI, 2022). Гены резистентности к ванкомицину (vanA, vanB и vanD) и гены вирулентности - энтерококковый поверхностный протеин (esp), субстанция агрегации (asal), гиалуронидаза (hyl), желатиназа (gelE) и цитолизин (cylA) детектировали с помощью мультиплексной ПЦР.
Результаты. Всего был исследован 551 Enterococcus spp., из них 440 (79,9%) E. faecium и 111 (20,1%) E. faecalis. Резистентыми к ванкомицину были 86 (19,5%) E. faecium (VR-E. faecium), из них 62 (72,1%) штамма имели vanA генотип и 24 (27,9%) - vanB. Один (1,1%) E. faecalis был умеренно-резистентным к ванкомицину (vanD). Гены вирулентности были детектированы у 86,2% Enterococcus spp., достоверно чаще среди E. faecalis (95,5%) по сравнению с E. faecium (83,9%, р = 0,003). Среди E. faecium преобладали ген esp (70,2%) и ген hyl (52,1%), другие гены составили от 1,1% до 4,5%. У E. faecalis доминировали другие гены, такие как ген gelE (66,7%), asa1 (65,8%) и ген cylA (36,9%). Статистически значимые отличия были определены по всем исследуемым генам вирулентности среди E. faecium и E. faecalis (р < 0,0001). Среди E. faecalis в сравнении с E. faecium достоверно чаще определяли сочетание трех и более исследованных генов вирулентности (45% против 2,5%, p < 0,0001), тогда как наличие одного гена или их отсутствие преобладало среди E. faecium (40,2% против 17,1%, p < 0,0001; 16,1% против 4,5%, p = 0,003, соответственно). При сравнении двух периодов исследования (2002-2010 гг. и 2011-2020 гг.) у E. faecalis было отмечено значимое увеличение доли штаммов, имевших сочетание трех и более генов вирулентности с 33,3% до 55% (р = 0,03), среди E. faecium - с одним геном вирулентности (с 31,7% до 46,3%, p = 0,002) и их отсутствием (с 6,6% до 23%, p < 0,0001).
Выводы. Штаммы E. faecium и E. faecalis отличаются по частоте детекции генов вирулентности и их спектру. Гены вирулентности достоверно чаще определяются у E. faecalis с преобладанием среди них сочетаний из трех и более генов.
Original Article
Virulence genes in Enterococcus faecium u Enterococcus faecalis isolated from blood culture in haematological patients
Fedorova A.V.1, Khrulnova S.A.1, Vetokhina A.V.2, Molchanova I.V.3, Kutsevalova O.Yu.4, Klyasova G.A.1
1 National Medical Research Center for Hematology, Moscow, Russia
2 Irkutsk Regional Clinical Hospital, Irkutsk, Russia
3 Chelyabinsk Regional Clinical Hospital, Chelyabinsk, Russia
4 National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russia
Contacts:
Anastasia V. Fedorova E-mail: [email protected]
Key words: Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, virulence
Objective. To study virulence genes in E. faecium and E. faecalis isolated from the blood cultures of patients with hematological diseases.
Materials and methods. Virulence genes were studied in E. faecium and E. faecalis strains isolated from blood culture from hematological patients in four Russian hospitals (2002-2020). Susceptibility to vancomycin was determined by broth microdilution method (CLSI, 2022). Virulence genes (esp, hyl, asa1,
Фёдорова А.В. и соавт.
factors, blood culture, hematologic disease.
Conflicts of interest: all authors report no conflicts of interest relevant to this article.
External funding source: no external funding received.
cylA u gelE) in E. faecium and E. faecalis as well as vancomycin resistance genes (vanA, vanB and vanD) in Enterococcus spp. were detected by multiplex PCR.
Results. A total of 551 Enterococcus spp. strains were studied, of them 440 (79.9%) were E. faecium and 111 (20.1%) E. faecalis. Resistance to vancomycin was detected in 86 (19.5%) E. faecium, of them 62 (72.1%) carried vanA and 24 (27.9%) vanB genes. One (1.1%) of 111 E. faecalis was vancomycin-intermediate (MIC 16 ^ig/ml) with vanD gene. Virulence genes were detected in 86.2% of Enterococcus spp., significantly more often among E. faecalis (95.5%) compared to E. faecium (83.9%, p = 0.003). The predominant genes in E. faecium were esp (70.2%) and hyl (52.1%), the detection of the asa1, cylA and gelE genes was minimal. Other genes dominated in E. faecalis: gelE (66.7%), asa1 (65.8%), cylA (36.9%). Statistically significant differences between E. faecium and E. faecalis were determined for all studied virulence genes (p < 0.0001). A combination of three or more virulence genes was detected significantly more often among E. faecalis in comparison with E. faecium (45% vs. 2.5%, p < 0.0001), whereas the presence of one gene or their absence prevailed in E. faecium (40.2% vs. 17.1%, p < 0.0001; 16.1% vs. 4.5%, p = 0.003, respectively). When comparing the two study periods (2002-2010 and 2011-2020), E. faecalis showed a significant increase in the proportion of strains with a combination of three or more virulence genes from 33.3% to 55% (p = 0.03), in E. faecium - with one virulence gene (from 31.7% to 46.3%, p = 0.002) and no genes (from 6.6% to 23%, p < 0.0001). Conclusions. Differences in the frequency of detection of virulence genes and their spectrum have been identified between E. faecium and E. faecalis strains. Virulence genes are significantly more often detected in E. faecalis with a predominance of combinations of three or more genes.
Введение
Энтерококки входят в число ведущих возбудителей инфекций кровотока у больных с гематологическими заболеваниями [1, 2]. В этиологической структуре инфекций кровотока в гематологии преобладают E. faecium (78,2%) над E. faecalis (19,7%) [3]. К факторам, оказывающим влияние на результаты лечения и течение эн-терококковых инфекций, относят не только резистентность возбудителей к противомикробным препаратам, но и наличие у них различных факторов вирулентности. В качестве потенциальных факторов вирулентности у Enterococcus spp. выделяют факторы агрегации, которые усиливают процессы генетического обмена у этих микроорганизмов; внеклеточные металлопептидазы, способные гидролизовать различные белки (коллаген, гемоглобин и другие); цитолизины, разрушающие про- и эукариотические клетки, а также факторы, обеспечивающие секрецию цитолизинов [4]. Наиболее изученными среди факторов агрегации являются энтерококковый поверхностный протеин и субстанция агрегации, среди внеклеточных металлопептидаз - гиалуронидаза и жела-тиназа, а также цитолизин.
Энтерококковый поверхностный протеин, кодируемый геном esp, стимулирует адгезию бактериальных клеток друг к другу, к клеткам хозяина, а также к органическим и неорганическим поверхностям, что может приводить к развитию катетер-ассоциированных инфекций. Другой адгезин, субстанция агрегации, кодируется геном asa1, также как и энтерококковый поверхностный протеин, обеспечивает контакт между бактериальными клетками и адгезию Enterococcus spp. к различным клеткам макроорганизма. Также этот фактор вирулентности стимулирует выработку Т-лимфоцитов и воспалительных цитокинов, индуцирует повреждение тканей. Субстанция агрегации способствует переносу плазмид, содержащих детерминанты резистентности к антибиоти-
Фёдорова А.В. и соавт.
кам, а также другого фактора вирулентности - цитолизина. Цитолизин запускает воспалительные процессы, разрушая эритроциты, макрофаги и полиморфноядер-ные лейкоциты. Помимо разрушения клеток хозяина, цитолизин также является бактериоцином и проявляет антимикробное действие против других грамположи-тельных бактерий. Ген cylA, кодирующий цитолизин, может находиться как на плазмиде, так и в хромосоме. Желатиназа, кодируемая геном ge1Е, является внеклеточной цинксодержащей металлопротеиназой, гидро-лизует широкий спектр субстратов, таких как желатин, инсулин, казеин, гемоглобин, фибриноген и коллаген. Экзофермент оказывает цитотоксическое действие, подавляет активность фагоцитов и активирует аутолиз тканей, а также участвует в образовании биопленок. Другой экзофермент - гиалуронидаза, расщепляет гиа-луроновую кислоту, входящую в состав соединительных тканей, на более простые субстраты, которые транспортируются и метаболизируются в бактериальной клетке, обеспечивая ее питательными веществами. Этот экзо-фермент, кодируемый геном hyl, повышает инвазивную способность Enterococcus spp. и способствует проникновению их в ткани макроорганизма. У более вирулентных штаммов Enterococcus spp. гены, кодирующие различные факторы вирулентности, способны объединяться в кластеры и формировать островки патогенности (pathogenicity island, PAI), которые могут передаваться менее вирулентным энтерококкам. Распределение генов вирулентности среди разных видов Enterococcus spp. может отличаться [5].
Целью нашего исследования было изучение наиболее распространенных генов вирулентности, таких как esp, hyl, asa1, cylA и gelE у E. faecium и E. faecalis, выделенных из гемокультуры от больных гематологическими заболеваниями.
Материалы и методы
Источники бактериальных изолятов
В исследование были включены клинические штаммы E. faecium и E. faecalis, выделенные из гемокультуры от больных гематологическими заболеваниями с симптомами инфекции, находившихся на лечении в гематологических отделениях 4 лечебных учреждений России в период с 2002 г. по 2020 г. В исследование включали первый штамм, выделенный из гемокультуры. Все включенные в исследование штаммы были доставлены в отдел микробиологии и антимикробной терапии ФГБУ «Национального медицинского исследовательского центра гематологии» Минздрава России (НМИЦ гематологии), где проводилась окончательная их идентификация, определение чувствительности к антимикробным препаратам, детекция генотипов резистентности к ванкоми-цину и генов вирулентности.
Видовая идентификация и хранение изолятов
Идентификацию штаммов до вида в НМИЦ гематологии проводили методом матричной лазерной десор-бционной ионизационной времяпролетной масс-спек-трометрии (MALDI-TOF MS) на анализаторе Microflex LT (Bruker Daltonics, Германия) с использованием программы MALDI Biotyper Real Time Classification, версия 3.1 (Bruker Daltonics, Германия). В качестве критерия надежной видовой идентификации использовали рекомендуемые значения коэффициента совпадения (Score) от 2,0 и выше. До момента тестирования изоляты хранили в триптиказо-соевом бульоне (Oxoid, Великобритания) с добавлением 30% глицерина (Sigma-Aldrich, США) при температуре -70 °С.
Определение чувствительности к ванкомицину
Определение чувствительности Enterococcus spp. к ванкомицину проводили методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтон (Oxoid, Великобритания) с использованием 96-луночных планшетов в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов США (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) [6]. Интерпретацию результатов определения чувствительности Enterococcus spp. выполняли на основании пограничных значений минимальных подавляющих концентраций (МПК) в соответствии с критериями CLSI, 2022 г. Чувствительными к ванкоми-цну считали изоляты Enterococcus spp., имевшими значения МПК < 4 мкг/мл, умеренно-резистентыми - МПК 8-16 мкг/мл и резистентными - МПК > 32 мкг/мл. Для внутреннего контроля качества определения чувствительности использовали референтные штаммы Е. faecalis АТСС®29212 и Е. faecalis АТСС®51299. Статистическую обработку и анализ данных проводили с помощью программы WHONET версия 5.6.
Выделение ДНК
Для выделения ДНК штаммы Enterococcus spp. культивировали на колумбийском агаре с добавлением 5% ба-
раньей крови (bioMerieux, Франция) при 37°С в течение 20-24 ч. Суточную культуру Enterococcus spp. суспендировали в 0,5 мл воды высокой степени очистки (система Milli-Q, Merck Millipore, США) в пробирках вместимостью 1,5 мл типа Eppendorf, затем инкубировали в течение 5 мин. при 95° С, далее центрифугировали 1 мин. при 12000 об/мин. Полученный супернатант использовали в качестве исследуемого образца ДНК при постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Пробы ДНК хранили при температуре -200С.
Детекция генотипов резистентности к гликопептидам и генов вирулентности Enterococcus spp.
Детекцию генов vanA, vanB и vanD у ванкомицино-резистентных Enterococcus spp. проводили с помощью мультиплексной ПЦР, используя праймеры, предложенные Dutka-Malen S. и соавт. [7]. В качестве положительных контролей применяли штаммы E. faecium BM4147 (vanA) и E. faecalis ATCC®51299 (vanB). В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК маркер GeneRuler™, 100 п.н. (Thermo Fisher Scientific, США). Гены вирулентности esp, hyl, asa1, cylA и gelE у E. faecium и E. faecalis детектировали с помощью мультиплексной
ПЦР [8, 9].
Статистическая обработка результатов
Различия между характеристиками оценивали с помощью двустороннего точного критерия Фишера (программа Statistica) и считали статистически значимыми при степени вероятности безошибочного прогноза 95% (p < 0,05).
Результаты
Гены вирулентности были определены у 86,2% Enterococcus spp. и достоверно чаще были среди E. faecalis (95,5%) по сравнению с E. faecium (83,9%, р = 0,003), Таблица 1. Среди Enterococcus spp. преобладали гены esp (63%) и hyl (47,2%), реже - gelE (17,1%), asa1 (15,3%) и cylA (8,4%). При сравнении E. faecium и E. faecalis статистически значимые отличия были определены в частоте встречаемости всех исследуемых генов вирулентности (р < 0,001), Рисунок 1А. Гены esp и hyl достоверно чаще были определены среди E. faecium в сравнении с E. faecalis (70,2% против 34,2%, p < 0,0001; 52,1% против 27,9%, p < 0,0001 соответственно), а гены asa1, cylA и gelE преобладали у E. faecalis (65,8% против 2,5%, p < 0,0001; 36,9% против 1,1%, p < 0,0001 и 66,7% против 4,5%, p < 0,0001 соответственно).
Гены вирулентности преобладали в сочетаниях (50,6%) у всех исследуемых Enterococcus spp. за счет высокой частоты их выявления у E. faecalis (78,4%), Таблица 1.
Доля штаммов, имеющих один ген вирулентности среди Enterococcus spp., составила 35,6% и определялась статистически значимо чаще среди E. faecium (40,2%) в сравнении с E. faecalis (17,1%, р < 0,0001),
Фёдорова А.В. и соавт.
(%)
esp asa 1 cylA hyl gelE
гены вирулентности п 309 38 11 73 5 41 229 31 20 74
НЕ faecium, п = 440 II Е. faecalis, п = 111
(%]
рованы количество генов
п 71 5 177 19 181 37 9 38 2 10 0 2 11 Е. faecium, п = 440 11 Е. faecalis, п - 111
Рисунок 1. Распределение генов вирулентности среди E. faecium и E. faecalis
А) Распределение всех исследованных генов вирулентности. *р < 0,0001 Б) Детекция генов изолированно и в сочетаниях. *р < 0,05
Рисунок 1Б. В сочетаниях преобладала детекция двух генов у всех штаммов Enterococcus spp. (39,6%), которая была несколько выше среди E. faecium (41,1%) в сравнении с E. faecalis (33,3%). Сочетание генов esp + hyl было наиболее распространенным у Enterococcus spp. (30,9%) по причине высокой частоты обнаружения их у E. faecium (38,6%), Таблица 1. Вторая позиция по частоте детекции двух генов вирулентности у Enterococcus spp. была представлена сочетанием генов asal + gelE (3,4%), которое достоверно чаще определяли у E. faecalis (16,2%) по сравнению с E. faecium (0,2%, р < 0,0001). Другие сочетания двух генов вирулентности среди E. faecalis и E. faecium были представлены у единичных штаммов.
Доля штаммов с тремя генами вирулентности у Enterococcus spp. составила 8,5% и достоверно чаще была среди E. faecalis (34,2%) в сравнении с E. faecium (2%, р < 0,0001). Наиболее распространенным сочетанием трех генов вирулентности у E. faecalis было определение генов esp + asal + gelE (8,1%) и генов asal +
Фёдорова А.В. и соавт.
су1А + де1Е (9%). Среди Е. faecium сочетание трех генов вирулентности было представлено у всего у трех штаммов. У штамма Е. faecalis, проявлявшего умеренную резистентность к ванкомицину (МПК 16 мкг/мл) и имевшего генотип vanD, было детектировано сочетание генов asa1 + де1Е + Иу1.
Сочетания четырех и более генов вирулентности было выявлено у 2,6% Enterococcus эрр., из них достоверно чаще у Е. faecalis (9%) в сравнении с Е. faecium
Таблица 1. Гены вирулентности у Enterococcus spp.
Entero- Enterococcus spp.
Гены вирулентности coccus spp. Всего 551 n (%) E. faecium, Всего 440 n (%) E. faecalis, Всего 111 n (%) P
Обнаружены 475 (86,2) 369 (83,9) 106 (95,5) 0,003
Один ген 196 (35,6) 177 (40,2) 19 (17,1) < 0,0001
esp 131 (23,8) 126 (28,7) 5 (4,5) < 0,0001
hyl 47 (8,5) 46 (10,5) 1 (0,9) 0,0004
gelE 13 (2,4) 4 (0,9) 9 (8,1) 0,0001
cylA 1 (0,2) 0 1 (0,9) 0,2
asa1 4 (0,7) 1 (0,2) 3 (2,7) 0,32
Сочетания генов 279 (50,6) 192 (43,6) 87 (78,4) < 0,0001
Два гена 218 (39,6) 181 (41,1) 37 (33,3) 0,16
из них esp + hyl 170 (30,9) 170 (38,6) 0 < 0,0001
asa1 + gelE 19 (3,4) 1 (0,2) 18 (16,2) < 0,0001
другие сочетания 29 (5,3) 10 (2,3) 19 (17,1) < 0,0001
двух генов1
Три гена 47 (8,5) 9 (2) 38 (34,2) < 0,0001
из них esp + asa1 + gelE 12 (2,2) 3 (0,7) 9 (8,1) < 0,0001
asa1 + cylA + gelE 10 (1,8) 0 10 (9) < 0,0001
другие сочетания 25 (4,5) 6 (1,3) 19 (17,1) < 0,0001
трех генов2
Четыре гена 12 (2,2) 2 (0,5) 10 (9) < 0,0001
из них esp + asa1 + cylA + gelE 6 (1,1) 1 (0,2) 5 (4,5) 0,0016
другие сочетания 6 (1,1) 1/1 (0,2) 5 (4,5) 0,0016
четырех генов3
Пять генов4 2 (0,4) 0 2 (1,8) 0,04
1 Другие сочетания двух генов (n = 29): esp + gelE (n = 8), asa1 + hyl (n = 7), hyl + gelE (n = 6), cylA + hyl (n = 3), cylA + gelE (n = 3), esp + asa1 (n = 1), asa1 + cylA (n = 1).
2 Другие сочетания трех генов (n = 25): asa1 + cylA + hyl (n = 6), asa1 + hyl + gelE (n = 5), esp + asa1 + cylA (n = 3), esp + asa1 + hyl (n = 3), esp + cylA + hyl (n = 3), esp + cylA + gelE (n = 3), esp + hyl + gelE (n = 2).
3 Другие сочетания четырех генов (n = 6): asa1 + cylA + hyl + gelE (n = 3), esp + asa1 + cylA + hyl (n = 1), esp + asa1 + hyl + gelE (n = 1), esp + cylA + hyl + gelE (n = 1).
4 Пять генов (n = 2): esp + asa1 + cylA + hyl + gelE (n = 2).
Таблица 2. Гены вирулентности среди VR-E. faecium и VS-E. faecium
1Другие сочетания двух генов (n = 11): hy! + ge!E (n = 5), esp + ge!E (n = 3), asal + hy! (n = 2), asal + ge!E (n = 1). 2Три гена (n = 8): esp + asa1 + ge!E (n = 3), esp + hy! + ge!E (n = 2), esp + asa1 + hy! (n = 1), esp + asa1 + cy!A (n = 1), asa1 + cy!A + hy! (n = 1).
3Четыре гена (n = 2): esp + asa1 + cy!A + ge!E (n = 1), esp + cy!A + hy! + ge!E (n = 1).
(0,5%, р < 0,005). Все пять генов вирулентности были определены только у двух штаммов (1,8%) E. faeca!is.
Среди изолированно детектируемых генов вирулентности у Enterococcus spp. (n = 196) преобладал ген esp (23,8%), который достоверно чаще определяли у E. faecium (28,7%), чем у E. faeca!is (4,5%, р < 0,0001), Таблица 1. Вторую позицию в моноварианте среди Enterococcus spp. занимал ген hy! (8,5%), который также доминировал у E. faecium (10,5%) в сравнении с E. faeca!is (0,9%, р = 0,0004). У E. faeca!is преобладал ген ge!E (8,1%) в моноварианте.
При сравнении E. faecium с разной чувствительностью к ванкомицину исследуемые гены вирулентности были выявлены у сопоставимого числа штаммов (82,6% и 84,2% соответственно), Таблица 2. Отличия были только в частоте детекции гена hy!, который статистически значимо реже определяли среди ванкомицино-резистентных E. faecium (VR-E. faecium) по сравнению с ванкомициночувствительными E. faecium (VS-E. faecium, 39,5% и 55,1%, р = 0,01). Ген cy!A у VR-E. faecium отсутствовал. Среди VR-E. faecium и VS-E. faecium наибо-
Таблица 3. Гены вирулентности среди vanA и vanB VR-E. faecium
Гены вирулентности vanA Всего 62 n (%) vanB Всего 24 n (%) Р
Обнаружены 50 (80,6) 21 (87,5) 0,54
Всего esp 45 (72,6) 18 (75) 1
Всего hy! 26 (41,9) 8 (33,3) 0,6
Всего ge!E 4 (6,5) 0 0,6
Всего asa1 3 (4,8) 0 0,6
Один ген 25 (40,3) 16 (66,7) 0,03
esp 20 (32,3) 13 (54,2) 0,08
hy! 4 (6,5) 3 (12,5) 0,4
ge!E 1 (1,6) 0 1
Сочетания генов 25 (40,3) 5 (20,8) 0,13
Два гена 22 (35,5) 5 (20,8) 0,3
из них esp + hy! 21 (33,9) 5 (20,8) 0,3
другие сочетания двух генов1 1 (1,6) 0 1
Три гена2 3 (4,8) 0 0,6
1 Другие сочетания двух генов (n = 1): esp + geiE.
2 Три гена (n = 3): esp + asa1 + geiE (n = 2), esp + asa1 + hyi (n = 1).
лее часто детектировали гены esp (73,3% и 69,5% соответственно). Доля генов asal и gel у VR-E. faecium и VS-E. faecium была сопоставимой и составила менее 5%.
Сочетание двух генов статистически значимо чаще регистрировали у VS-E. faecium по сравнению с VR-E. faecium (43,8% против 31,4%, р = 0,039) по причине более частого обнаружения у VS-E. faecium сочетания доминантных генов esp + hyl (41% против 30,2%, р < 0,0001, соответственно), Таблица 2.
При сравнении разных генотипов резистентности к ванкомицину vanA и vanB VR-E. faecium не было получено отличий по частоте обнаружения генов вирулентности, Таблица 3. Наиболее часто среди vanA и vanB VR-E. faecium детектировали гены esp (72,6% и 75% соответственно). Среди vanB VR-E. faecium было отмечено представление генов в моноварианте в сравнении с vanA VR-E. faecium (66,7% против 40,3%, р = 0,03). Сочетание генов вирулентности чаще определяли у vanA по сравнению с vanB VR-E. faecium (40,3% против 20,8%).
При сравнении разных периодов исследования (2002-2010 гг. и 2011-2020 гг.) у E. faecium достоверно снизилась частота детекции доминирующих генов esp с 76% до 66,2% (р = 0,03) и hyl с 72,7% до 37,4%, (р < 0,0001) за счет увеличения доли штаммов без исследуемых генов вирулентности с 6,6% до 23% (р < 0,0001), рисунок 2А. В более поздний период исследования (2011-2020 гг.) у E. faecium было отмечено увеличение доли штаммов с одним геном вирулентности (с 31,7% до 46,3%, р = 0,002) и уменьшение с двумя генами с 59% до 28,4% (р < 0,0001).
Фёдорова А.В. и соавт.
Гены вирулентности VR-E. faecium Всего 86 n (%) VS-E. faecium Всего 354 n (%) Р
Обнаружены 71 (82,6) 298 (84,2) 0,7
Всего esp 63 (73,3) 246 (69,5) 0,6
Всего hy! 34 (39,5) 195 (55,1) 0,01
Всего ge!E 4 (4,7) 16 (4,5) 1
Всего asa1 3 (3,5) 8 (2,3) 0,5
Всего cy!A 0 5 (1,4) 0,6
Один ген 41 (47,7) 136 (38,4) 0,14
esp 33 (38,4) 93 (26,3) 0,03
hy! 7 (8,1) 39 (11) 0,56
asa1 0 1 (0,3) 1
ge!E 1 (1,2) 3 (0,8) 0,58
Сочетания генов 30 (34,9) 162 (45,8) 0,07
Два гена 27 (31,4) 155 (43,8) 0,039
из них esp + hy! 26 (30,2) 145 (41) < 0,0001
другие сочетания двух генов1 1 (1,2) 10 (2,8) 0,7
Три гена2 3 (3,5) 5 (1,4) 0,19
Четыре гена3 0 2 (0,6) 1
рованы gg гены вирулентности
n 12 59 139170 4 6 3 2 133 96 11 9
II 2002-2010, п = 183 11 2011-2020, п - 257
р = 0,01
п
76,7
70
62,7
52,9 | |
39,2
L 5 31,7
_ III
дегекти- esP asaI су/А hyl gelE рованы
гены вирулентности
Б п 3 0 15 14 27 46 20 21 12 19 32 42
I I 2002-2010, п = 51
II 2011-2020, п = 60
Рисунок 2. Распределение генов вирулентности среди E. faecium и E. faecalis в разные периоды исследования (2002-2010 гг. и 2011-2020 гг.)
А) Распределение генов вирулентности среди E. faecium
Б) Распределение генов вирулентности среди E. faecalis
Среди E. faecalis во второй анализируемый период исследования (2011-2020 гг.) было определено статистически достоверное увеличение генов asal с 52,9% до 76,7% (р = 0,01) и сочетания трех и более генов вирулентности с 33,3% (17 из 51) до 55% (33 из 60, р = 0,03) и некоторое уменьшение двух генов с 41,2% до 26,7 % (р < 0,05), Рисунок 2Б.
У VR-E. faecium в разные периоды исследования (2002-2010 гг. и 2011-2020 гг.) достоверных отличий по распределению генов вирулентности не было получено, в то время как среди VS-E. faecium статистически значимо уменьшилась частота детекции гена hyl с 74,4% до 38,4% (р < 0,0001) и гена esp с 76,8% до 63,2%
Фёдорова А.В. и соавт.
(р = 0,006), а также в более поздний период увеличился процент штаммов, не содержащих исследованные гены вирулентности с 6,1% до 24,2% (р < 0,0001).
Среди VR-E. faecium с vanA и vanB генотипами резистентности к ванкомицину в разные периоды исследования также, как и среди VR-E. faecium в целом, отмечено снижение доли гена hyl (у vanA VR-E. faecium - с 56,2% до 37%, р < 0,05, соответственно, у vanB VR-E. faecium -с 66,7% до 28,6%, р < 0,05).
Обсуждение
В приведенном исследовании у 551 штамма Enterococcus spp. нами были изучены гены вирулентности. Основные заключения данной работы могут быть суммированы следующим образом:
• гены вирулентности преобладают среди E. faecalis в сравнении с E. faecium;
• у E. faecalis отмечено преобладание сочетания трех и более генов вирулентности, а среди E. faecium -одного гена вирулентности;
• E. faecalis и E. faecium имеют разные доминирующие гены, так у E. faecium ведущими являются гены вирулентности, кодирующие энтерококко-вый поверхностный протеин и гиалуронидазу, а у E. faecalis - гены, кодирующие желатиназу и субстанцию агрегации.
Преобладание генов вирулентности у E. faecalis (95,5%) по сравнению с E. faecium (83,9%, р = 0,003), согласуется с литературными данными. В работе Strateva T. и соавт. эти показатели у E. faecalis и E. faecium составляли 100% и 90% соответственно (p < 0,0001), в другом исследовании из Словении - 100% и 73,3% (p < 0,0001%), по данным американских авторов -92,9% и 83,3%, но отличия не были статистически значимыми [10-12].
В нашем исследовании у E. faecalis в сравнении с E. faecium преобладало сочетание трех и более генов вирулентности (45% против 2,5% соответственно), которое в более поздний период исследования (2011-2020 гг.) увеличилось до 55%, в тоже время как среди E. faecium достоверно чаще определяли один ген (40,32% против 17,1%), и их доля возросла до 46% (2011-2020 гг.). Аналогичные результаты были получены в исследовании ученых из Болгарии, в котором у E. faecalis по сравнению с E. faecium достоверно чаще детектировали более 4 генов вирулентности (71,9% против 1,5%, p < 0,001), тогда как у E. faecium один ген вирулентности (50% против 1,1%, p < 0,001) [13]. В работе Padmasini E. и соавт. у E. faecalis также преобладало сочетания более четырех генов вирулентности, а среди E. faecium одного гена вирулентности [13]. По данным другого исследования все штаммы E. faecalis имели от 6 до 11 генов вирулентности, тогда как E. faecium 1-3 гена вирулентности [14].
Вирулентность Enterococcus spp. и в первую очередь E. faecalis, может быть ассоциирована с системой CRISPR/Cas (CRISPR - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), включающую последова-
40
29,4
5,9
тельность нуклеиновых кислот (24-48 пар нуклеоти-дов), которая многократно повторяется. Между идентичными повторами располагаются отличающиеся друг от друга фрагменты ДНК, спейсеры, фрагменты чужеродной (вирусной или плазмидной) ДНК, с которой сталкивалась бактериальная клетка. При проникновении нового вируса (или плазмиды) в бактериальную клетку, его обнаруживают специфические Cas-белки, которые разрезают и встраивают фрагмент вирусной ДНК в виде спейсера между идентичными повторами. В случае повторного проникновения вируса в бактериальную клетку и наличии его фрагмента в своей CRISPR/Cas системе, Cas-белки защищают клетку и уничтожают его.
В ряде работ было показано, что у E. faecalis с CRISPR/Cas системой ассоциировано два процесса, которые оказывают влияние на вирулентность. Системы CRISPR/Cas могут снижать вирулентность E. faecalis, защищая их от мобильных генетических элементов, несущих потенциальные факторы вирулентности (плазмиды, транспозоны и бактериофаги), и в тоже время регуляция экспрессии генов с помощью CRISPR/Cas системы может повышать вирулентность E. faecalis, например, путем стимулирования колонизации клеток хозяина [15, 16]. В работе Bourgogne A. и соавт. на экспериментальной модели мыши при инфекции мочевыводящих путей было установлено, что штамм E. faecalis с CRISPR/Cas системой имел повышенную способность к формированию биопленок и более эффективно колонизировал органы мыши, чем штамм, лишенный этой системы [17]. В другом исследовании наличие CRISPR/Cas системы у E. faecalis было статистически значимо ассоциировано с присутствием гена gelE, кодирующего желатиназу (р < 0,05) [18].
Нами было определено у E. faecalis преобладание генов gelE (66,7%) и asal (65,8%), далее следовали гены cylA (36,9%) и esp (34,2%). Другими исследователями были получены сопоставимые данные, в которых ген gelE был определен у 64-88% E. faecalis, ген asa1 - у 64-79%, а ген esp - у 34,2-71,8% [11, 1921]. Частота выделения гена cylA была несколько ниже в нашем исследовании (36,9%) по сравнению с результатами европейских работ (44,4-67,2%) [10, 11, 21]. Наиболее низкой у E. faecalis была частота детекции гена hyl (27,9%). По другим публикациям этот показатель сильно варьировал и составлял от 0,4-2,8% до 22,2-31,3% [10-12, 15, 21].
В нашем исследовании у 25,2% E. faecalis было определено сочетание генов asal и cyl. В ряде работ ген cyl, кодирующий цитолизин, нередко совместно с геном asal, кодирующим субстанцию агрегации, был обнаружен у E. faecalis на уникальных мобильных генетических элементах - так называемых коньюгативных феромо-нозависимых плазмидах, которые способствуют передаче как отдельных генов резистентности к антибиотикам и вирулентности, так и островков патогенности [22]. Эти плазмиды способствуют прикреплению микроорганизмов, колонизации и формированию биопленок,
причем экспрессия одновременно субстанции агрегации и цитолизина может приводить к увеличению патогенных свойств у E. faecalis [22-24]. Наиболее известными из них являются феромонозависимые плазмиды pAD1, pCF10 и pPD1.
У 18% E. faecalis нами было выявлено сочетание генов asal + cylA + gelE. По данным Raven K. и соавт. было отмечено, что гены asal, cylA и gelE статистически значимо чаще (p < 0,05) детектировали у E. faecalis, принадлежащих к клональному комплесу (clonal complex -CC) CC2, CC87 и CC388 по сравнению со спорадическими штаммами [25].
Среди 111 E. faecalis был выявлен один (0,9%) умеренно-резистентный к ванкомицину штамм, несущий гены gelE + asal + hyl. В исследовании Raven K. и соавт. не было получено различий в распределении генов вирулентности среди чувствительных и резистентных к ван-комицину E. faecalis, выделенных из гемокультуры [25].
У E. faecium доминировали другие гены вирулентности, такие как esp (70,2%) и hyl (52,1%), а гены asal, cylA и gelE составили менее 5%. В большинстве работ у E. faecium также была отмечена высокая частота детекции гена esp (70-72%), в то время как ген hyl варьировал от 3% до 53% [9-11, 14, 23, 26-29]. Высокая частота детекции генов esp и hyl у E. faecium, выделенных из гемокультуры, вероятно, не была случайной в нашем исследовании. Ген esp ассоциирован с первичным поверхностным прикреплением к клеткам хозяина и колонизацией слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, а ген hyl - повышает инвазивную способность Enterococcus spp. и, таким образом, присутствие этих генов вирулентности одновременно может быть связано с развитием инфекции кровотока вследствие транслокации E. faecium из желудочно-кишечного тракта в кровоток у больных с заболеваниями системы крови и тяжелым мукозитом [30].
Низкая частота детекции генов asal, cylA и gelE E. faecium, выявленная в нашей работе, также была отмечена другими учеными и варьировала от их полного отсутствия до 13% [9, 11, 14, 27, 27, 31].
При сравнении VR-E. faecium и VS-E. faecium частота обнаружения генов вирулентности была сопоставимой (82,6% и 84,2% соответственно), но среди VR-E. faecium в сравнении с VS-E. faecium достоверно реже выявляли ген hyl (39,5% против 55,1%, p = 0,01), а ген cylA отсутствовал. Неоднородные данные представлены в литературе. В одних работах, так же как и нами, не было выявлено отличий в детекции генов вирулентности у VR-E. faecium и VS-E. faecium, в других исследованиях гены вирулентности чаще детектировали у VR-E. faecium [9, 30, 32, 33].
Среди VR-E. faecium в нашем исследовании ген esp выявили у 73,3% штаммов, ген hyl - у 39,5%, а гены asal и gel - менее чем у 5%. В других работах детекция этих генов у VR-E. faecium была неоднородной и варьировала, так гена esp от 56% до 91,7%, гена hyl -от 28,5% до 86,7% [30, 31, 33-36]. В исследовании Rice L. и соавт. частота детекции у VR-E. faecium гена
Фёдорова А.В. и соавт.
esp и гена hyl, выделенных в США, была выше, чем в Европейских странах (65,1% против 23,5% соответственно, р = 0,001, и 38,5% против 11,8% соответственно, р = 0,03) [29]. В отдельных работах была отмечена ассоциация генов esp и hyl с принадлежностью VR-E. faecium к CC17 [30, 33]. В проведенном нами ранее исследовании среди 129 VR-E. faecium, выделенных от больных опухолями системы крови со слизистой оболочки кишечника и принадлежащих к CC17, ген esp был детектирован у 91% штаммов [37].
Гены asal и gel у VR-E. faecium были редко детектированы и в большинстве других исследований [9, 10, 19]. Однако противоположные результаты были получены в работе из Бразилии при изучении VR-E. faecium, выделенных из крови больных опухолями системы крови, в которой ген gelE был выявлен у 80% штаммов, а ген asal - у 73,3% [38]. В этом исследовании наличие гена asal у VR-E. faecium при инфекции кровотока статистически значимо чаще приводило к риску развития летального исхода (ОШ: 6,66; 95% ДИ: 1,00-44,28; р = 0,04).
Среди vanA VR-E. faecium нами чаще был определен ген esp (72,6%), вторую позицию занимал ген hyl (41,9%), а гены gelE и asal были выявлены в менее, чем у 7%. Аналогичные результаты были отмечены другими исследователями, но в некоторых публикациях доминировали гены gelE и asal, а в исследовании Wardal E. и соавт. было показано преобладание разных генов вирулентности у штаммов, выделенных в соседних клиниках [33, 36-39]. Так при сравнении vanA VR-E. faecium, выделенных от больных в двух соседних клиниках Варшавы было показано, что в Институте гематологии и трансфу-
зиологии доминировал ген esp (82,4%), а в Институте онкологии этот показатель составил всего 3,7%, в то время как ген hyl преобладал в Институте онкологии (100% против 77,8% соответственно) [39]. Выявленные различия в частоте детекции генов вирулентности в этих клиниках были ассоциированы с преобладанием разных генетических линий у vanA VR-E. faecium.
Выводы
Данное исследование продемонстрировало, что штаммы E. faecium и E. faecalis отличаются по частоте детекции генов вирулентности и их спектру. Гены вирулентности достоверно чаще определяются у E. faecalis с преобладанием среди них сочетаний из трех и более генов, а среди E. faecium доминирует один ген вирулентности. У E. faecium ведущими являются гены вирулентности, кодирующие энтерококковый поверхностный протеин и гиалуронидазу, у E. faecalis - гены, кодирующие желатиназу и субстанцию агрегации.
При сравнении с данными литературы у E. faecalis и E. faecium были получены идентичные результаты по частоте детекции генов, кодирующих желатиназу, субстанцию агрегации и энтерококковый поверхностный протеин, тогда как выявление гиалуронидазы было вариабельным. При сравнении частоты обнаружения цитолизина в нашем исследовании с другими публикациями, этот показатель у E. faecium был сопоставим, а у E. faecalis - несколько ниже в нашей работе.
Работа была выполнена в соответствии с государственным заданием, рег. № НИОКТР 122012700237-5.
Литература
Klyasova G.A. Antimicrobial therapy. In: Program treatment of blood system diseases. Ed.: Savchenko V.G., Moscow: Praktika, 2012. Russian. (Клясова Г.А. Антимикробная терапия. В кн.: Программное лечение заболеваний системы крови: сборник алгоритмов диагностики и протоколов лечения заболеваний системы крови. Под ред. Савченко В.Г. Москва: Практика, 2012.)
Klyasova G.A., Okhmat V.A. Antimicrobial therapy. In: Algorithms of diagnosing and protocols of treatment of blood system diseases. Ed.: Savchenko V.G. Moscow: Praktika, 2018. Russian. (Клясова Г.А., Охмат В.А. Антимикробная терапия. В кн.: Алгоритмы диагностики и протоколы лечения заболеваний системы крови. Под ред. Савченко В.Г. Москва: Практика, 2018.) Klyasova G.A., Fedorova A.V., Frolova I.N., Khrul-nova S.A., Vetokhina A.V., Kaporskaya T.S., et al. Antimicrobial resistance nosocomial Enterococcus spp., isolated from blood culture in patients with hematological malignancies. Kliniceskaa mikrobiologia i antimikrobnaa himioterapia. 2018;20(2):142-147.
Russian. (Клясова Г.А., Федорова А.В., Фролова И.Н., Хрульнова С.А., Ветохина А.В., Капорская Т.С. и соавт. Антибиотикорезистентность госпитальных штаммов Enterococcus spp., выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови: результаты многоцентрового исследования. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2018;20(2):142-147.) DOI: 10.36488/cmac.2018.2.142-149
4. Sidorenko S.V. Infectious process as a "Dialog" between host and parasite. Kliniceskaa mikrobiologia i antimikrobnaa himioterapia. 2001;3(4):301-315. Russian. (Сидоренко C.B. Инфекционный процесс как «диалог» между хозяином и паразитом. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001;3(4):301-315.)
5. Garcia-Solache M., Rice L. The Enterococcus: a model of adaptability to its environment. Clin Microbiol Rev. 2019;32(2):e00058-18. DOI: 10.1128/CMR.00058-18
6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 30th ed. CLSI supplement M100. 2020.
Фёдорова A.B. и соавт.
7. Dutka-Malen S., Evers S., Courvalin P. Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR. J Clin Microbiol. 1995;33(5):1434. DOI: 10.1128/ jcm.33.5.1434-1434.1995
8. Khan S.A., Nawaz M.S., Khan A.A. Hopper S.L., Jones R.A., Cerniglia C.E. Molecular characterization of multidrug-resistant Enterococcus spp. from poultry and dairy farms: detection of virulence and vancomycin resistance gene markers by PCR. Mol Cell Probes. 2005;19(1):27-34. DOI: 10.1016/j.mcp.2004.09.001
9. Vankerckhoven V., Van Autgaerden T., Vael C., Lammens C., Chapelle S., Rossi R., et al. Development of a multiplex PCR for the detection of asal, gelE, cylA, esp, and hyl genes in enterococci and survey for virulence determinants among European hospital isolates of Enterococcus faecium. J Clin Microbiol. 2004; 42(10):4473-4479. DOI: 10.1128/JCM.42.10.4473-4479.2004
10. Strateva T., Atanasova D., Savov E., Petrova G., Mitov I. Incidence of virulence determinants in clinical Enterococ-cus faecalis and Enterococcus faecium isolates collected in Bulgaria. Braz J Infect Dis. 2016;20(2):127-133. DOI: 10.1016/j.bjid.2015.11.011
11. Golob M., Pate M., Kusar D., Dermota U., Avbersek J., Papic B., Zdovc I. Antimicrobial resistance and virulence genes in Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis from humans and retail red meat. Biomed Res Int. 2019;2019:2815279. DOI: 10.1155/2019/2815279
12. Ferguson D.M., Talavera G.N., Hernández L.A., Weisberg S.B., Ambrose R.F., Jay J.A. Virulence genes among Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium isolated from coastal beaches and human and nonhuman sources in Southern California and Puerto Rico. J Pathog. 2016;2016:3437214. DOI: 10.1155/2016/3437214
13. Padmasini E., Divya G., Karkuzhali M., Padmaraj R., Ramesh S. Distribution of cylA, esp, asal, hyl and gelE virulence genes among clinical isolates of Enterococcus faecium and Entrococcus faecalis. BMC Infect Dis. 2014;14(Suppl. 3):P32. DOI: 10.1186/1471-2334-14-S3-P32
14. Eaton T.J., Gasson M.J. Molecular screening of Enterococcus virulence determinants and potential for genetic exchange between food and medical isolates. Appl Environ Microbiol. 2001;67(4):1628-1635. DOI: 10.1128/AEM.67.4.1628-1635.2001
15. Gawryszewska I., Malinowska K., Kuch A., Chrobak-Chmiel D., Trokenheim L.L., Hryniewicz W., et al. Distribution of antimicrobial resistance determinants, virulence-associated factors and clustered regularly interspaced palindromic repeats loci in isolates of Enterococcus faecalis from various settings and genetic lineages. Pathog Dis. 2017;75(2):ftx021. DOI: 10.1093/ femspd/ftx021
16. Lindenstrauss A.G., Pavlovic M., Bringmann A., Behr J., Ehrmann M.A., Vogel R.F. Comparison of genotypic and phenotypic cluster analyses of virulence determinants and possible role of CRISPR elements towards their incidence in Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. Syst
Appl Microbiol. 20ll;34(8):553-560. DOI: 10.1016/j. syapm.2011.05.002
17. Bourgogne A., Garsin D.A., Qin X., Singh K.V., Sillanpaa J., Yerrapragada S., et al. Large scale variation in Enterococcus faecalis illustrated by the genome analysis of strain OG1RF. Genome Biol. 2008;9(7):R110. DOI: l0.ll86/gb-2008-9-7-rll0
18. Rotta I.S., Rodrigues W.F., Dos Santos C.T.B., Mantovani H.C., De Oliveira A.G., Machado A.B.F., Paiva A.D. Clinical isolates of E. faecalis and E. faecium harboring virulence genes show the concomitant presence of CRISPR loci and antibiotic resistance determinants. Microb Pathog. 2022;171:105715. DOI: 10.1016/j. micpath.2022.105715
19. Kiruthiga A., Padmavathy K., Shabana P., Naveenkumar V., Gnanadesikan S., Malaiyan J. Improved detection of esp, hyl, asa?, gelE, cylA virulence genes among clinical isolates of Enterococci. BMC Res Notes. 2020;13(1):170. DOI: l0.ll86/sl3l04-020-050l8-0
20. Medeiros A.W., Pereira R.I., Oliveira D.V., Martins P.D., d'Azevedo P.A., Van der Sand S., et al. Molecular detection of virulence factors among food and clinical Enterococcus faecalis strains in South Brazil. Braz J Microbiol. 20l4;45(l):327-332. DOI: 10.1590/S1517-83822014005000031
21. Zheng J.X., Wu Y., Lin Z.W., Pu Z.Y., Yao W.M., Chen Z., et al. Characteristics of and virulence factors associated with biofilm formation in clinical Enterococcus faecalis isolates in China. Front Microbiol. 20l7;8:2338. DOI: l0.3389/fmicb.20l7.02338
22. Bhatty M., Cruz M.R., Frank K.L., Gomez J.A., Andrade F., Garsin D.A., et al. Enterococcus faecalis pCFl0-encoded surface proteins PrgA, PrgB (aggregation substance) and PrgC contribute to plasmid transfer, biofilm formation and virulence. Mol Microbiol. 20l5;95(4):660-677. DOI: l0.llll/mmi.l2893
23. Van Tyne D., Gilmore M.S. Virulence plasmids of nonsporulating gram-positive pathogens. Microbiol Spectr. 201 4 ;2 (5) : 1 0.1 1 28/microbiolspec.PLAS-0002-20l3. DOI: l0.ll28/microbiolspec.PLAS-0002-20l3
24. Shankar N., Coburn P., Pilla C., Haas W., Gilmore M. Enterococcal cytolysin: activities and association with other virulence traits in a pathogenicity island. Int J Med Microbiol. 2004;293(7-8):609-6l8. DOI: 10.1078/1438-422100301
25. Raven K.E., Reuter S., Gouliouris T., Reynolds R., Russell J.E., Brown N.M., et al. Genome-based characterization of hospital-adapted Enterococcus faecalis lineages. Nat Microbiol. 2016;1(3):15033. DOI: l0.l038/nmicrobiol.20l5.33
26. Shankar N., Baghdayan A.S., Gilmore M.S. Modulation of virulence within a pathogenicity island in vancomycin-resistant Enterococcus faecalis. Nature. 2002;4l7:746-750. DOI: l0.l038/nature00802
27. Billström H., Lund B., Sullivan A., Nord C.E. Virulence and antimicrobial resistance in clinical Enterococcus faecium. Int J Antimicrob Agents. 2008;32(5):374-377. DOI: l0.l0l6/j.ijantimicag.2008.04.026
Фëдоpовa A.B. и соaвт.
2B. Elsner H. A., Sobottka I., Mack D., Claussen M., Laufs R., Wirth R. Virulence factors of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium blood 114 culture isolates. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000;19(1):39-42. DOI: 10.1007/ s100960050007
29. Rice L.B., Carias L., Rudin S., Vael C., Goossens H., Konstabel C., et al. A potential virulence gene, hylEfm, predominates in Enterococcus faecium of clinical origin. J Infect Dis. 2003;1B7(3):50B-512. DOI: 10.10B6/367711
30. Cho S.Y., Park Y.J., Cho H., Park D.J., Yu J.K., Oak H.C., et al. Comparison of Enterococcus faecium bacteremic isolates from hematologic and non-hematologic patients: differences in antimicrobial resistance and molecular characteristics. Ann Lab Med. 201B;3B(3):226-234. DOI: 10.3343/alm.201B.3B.3.226
31. Jahangiri S., Talebi M., Eslami G., Pourshafie M.R. Prevalence of virulence factors and antibiotic resistance in vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolated from sewage and clinical samples in Iran. Indian J Med Microbiol. 2010;2B:337-341. DOI: 10.4103/0255-0B57.71B2B
32. Khrulnova S.A., Fedorova A.V., Klyasova G.A. Virulence genes in Enterococcus spp. strains, isolated from blood cultures of patients with hematological malignancies in Russia. Immunopatologija, allergologija, infektologija. 2016;1:7B-B2. Russian. (Хрульнова С.А., Фёдорова А.В., Клясова Г.А. Гены вирулентности у штаммов Enterococcus spp., выделенных из гемокуль-туры у больных опухолями системы крови в России. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2016;1:7B-B2.) DOI: 10.14427/jipai.2016.1.7B
33. Comerlato C.B., Resende M.C., Caieräo J., d'Azevedo P.A. Presence of virulence factors in Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium susceptible and resistant to
vancomycin. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2013;108(5):590-595. DOI: 10.1590/s0074-02762013000500009
34. Park S.H., Park C., Choi S.M., Lee D.G., Kim S.H., Kwon J.C., et al. Molecular epidemiology of vancomycin-resistant Enterococcus faecium bloodstream infections among patients with neutropenia over a 6-year period in South Korea. Microb Drug Resist. 2011;17(1):59-65. DOI: 10.1089/mdr.2010.0091
35. Camargo I.L., Gilmore M.S., Darini A.L. Multilocus sequence typing and analysis of putative virulence factors in vancomycin-resistant and vancomycin-sensitive Enterococcus faecium isolates from Brazil. Clin Microbiol Infect. 2006;12:1 123-1 130. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2006.01496.x
36. Biswas P.P., Dey S., Sen A., Adhikari L. Molecular characterization of virulence genes in vancomycin-resistant and vancomycin-sensitive Enterococci. J Glob Infect Dis. 2016;8(1):16-24. DOI: 10.4103/0974-777X.176141
37. Brilliantova A.N., Kliasova G.A., Mironova A.V., Tishkov V.I., Novichkova G.A., Bobrynina V.O., Sidorenko S.V. Spread of vancomycin-resistant Enterococcus faecium in two haematological centres in Russia. Int J Antimicrob Agents. 2010;35(2):177-181. DOI: 10.1016/j. ijantimicag.2009.10.006
38. Marchi A.P., Perdigäo Neto L.V., Martins R.C.R., Rizek C.F., Camargo C.H., Moreno L.Z., et al. Vancomycin-resistant enterococci isolates colonizing and infecting haematology patients: clonality, and virulence and resistance profile. J Hosp Infect. 2018;99(3):346-355. DOI: 10.1016/j. jhin.2017.10.010
39. Wardal E., Markowska K., Zabicka D., Wroblewska M., Giemza M., Mik E., et al. Molecular analysis of vanA outbreak of Enterococcus faecium in two Warsaw hospitals: the importance of mobile genetic elements. Biomed Res Int. 2014;2014:575367. DOI: 10.1155/2014/575367
Фёдорова A.B. и соавт.
