CC BY
30
УДК 574.64:575.224
ГЕНОТОКСИЧНОСТЬ ВОДЫ РОДНИКОВ г. РОСТОВА н/Д (2009 г.)
© 2011 г. М.А. Сазыкина, В.А. Чистяков, И.С. Сазыкин, Е.М. Новикова, З.С. Кхатаб, Л.П. Лагутова, А.В. Латышев
Научно-исследовательский институт биологии Scientific Research Institute of Biology
Южного федерального университета, of Southern Federal University,
пр. Стачки, 194/1, г. Ростов н/Д, 344090, Stachki Ave, 194/1, Rostov-on-Don, 344090,
[email protected] [email protected]
Приведены данные по генотоксичности воды родников г. Ростова-на-Дону (2009 г.), полученные с использованием бактериальных lux-биосенсоров. Выявлены родники, наиболее загрязненные генотоксикантами. Данные для отдельных источников значительно варьируют во времени. Показано, что практическое использование системы тестов на основе lux-биосенсоров дает возможность получения объективной информации о состоянии экосистем. Для повышения чувствительности тестирования генотоксично-сти необходимо увеличить число используемых тест-систем.
Ключевые слова: генотоксичность, lux-биосенсор, родник, биотестирование, загрязнение.
In the article the data on genotoxicity of water springs of Rostov-on-Don (2009) received with usage of bacterial lux-biosensors is resulted. The springs most polluted by genotoxicants are detected. The data for separate springs considerably varies in time. It is shown that practical usage of the system of tests based on lux-biosensors gives the possibility to receive objective information about the condition of ecosystems. It is necessary to increase number of used test systems for increase of sensitivity of genotoxicity testing.
Keywords: genotoxicity, lux-biosensor, spring, biotesting, pollution.
Многообразие антропогенных поллютантов диктует повышенные требования к экспрессности и производительности тест-систем, используемых для мониторинга водных экосистем. Лишь небольшая их часть пригодна для организации экологического мониторинга, приносящего реальную пользу. Прежде всего, это системы, основанные на использовании биосенсоров, в частности люминесцентных [1, 2].
В бактериальных lux-биосенсорах гены, ответственные за свечение, находятся под контролем специфических промоторов. Такие тест-системы удобны для оценки загрязнения окружающей среды геноток-синами, тяжелыми металлами, сульфонатами и т.д. [3-5]. Высокая экспрессность и производительность тестов, основанных на использовании биосенсоров, позволяют делать больше анализов с использованием различных методологических подходов [2, 6].
Задача нашей работы - изучение генотоксичности воды родников г. Ростова н/Д при помощи люминесцентных биосенсоров.
Материалы и методы исследований
Образцы воды для биотестирования периодически отбирались из 19 родников г. Ростова н/Д в течение весны и лета 2009 г.
В качестве тест-системы использован SOS-lux тест [7, 8]. Репортером SOS-ответа служил lux-оперон. Использовали штамм E. coli С600, трансформированный плазмидой pPLS-1, в которой оперон биолюминесценции находится под контролем SOS-промотора - С600 [pPLS-1], созданного из cda гена плазмиды ColD [8, 9].
Для контроля генотоксичности использовался биосенсор E. coli AB1157 (pRecA-lux), любезно предоставленный И.В. Мануховым (ФГУП «ГосНИИГе-нетика»). В качестве SOS-промотора в биосенсоре использован PrecA [10].
Бактерии растили в бульоне Луриа-Бертани (LB), содержащем 100 мкг/мл ампициллина с аэрацией при
30 °С. Ночную культуру разводили до концентрации 107 клеток/мл в свежем LB и растили при 30 оС 2 ч. Затем пробы по 100 мкл переносили в специальные кюветы, часть которых служила контролем (в нее добавляли 100 мкл дистиллированной воды), а в другие кюветы вносили по 100 мкл образца природной воды. При использовании метаболической активации в лунки вносилось по 10 мкл активирующей смеси 8-9.
Приготовленные таким образом кюветы с клетками 1их-биосенсора помещали в микропланшетный люминометр ЬМ-01Т («Immumtech») и через определенные интервалы времени измеряли интенсивность биолюминесценции клеточной суспензии. Инкубацию проб проводили при температуре 30 оС. Мерой загрязнения служил фактор индукции. Степень индукции (фактор индукции) определяли как отношение интенсивности свечения суспензии штамма, содержащей тестируемое соединение (Ьс), к интенсивности свечения контрольной суспензии штамма (Ьк): 1=ЬС/Ьк, где Ьс - интенсивность свечения суспензии 1их-штамма в присутствии тестируемого соединения; Ьк - интенсивность свечения контрольной суспензии.
Достоверность отличия биолюминесценции в опыте от контрольной величины оценивали по ^критерию [11]. Вывод о генотоксичности пробы делали при р<0,05. Если при достоверном отличии опыта от контроля значения фактора индукции меньше 2, обнаруженный генотоксический эффект оценивали как слабый; от 2 до 10 - как средний, а при превышении 10 -как сильный.
Все эксперименты проводили в 3^5 независимых повторностях.
Результаты и их обсуждение
Результаты тестирования проб воды с использованием бактериальных 1их-биосенсоров представлены в таблице.
Генотоксичность воды родников г. Ростова н/Д (2009 г.), зарегистрированная при помощи различных 1их-биосенсоров
Название родника Дата отбора Фактор индукции, определенный с помощью различных lux-биосенсоров
E. coli AB1157 (pRecA-lux) Е. coli С600 (pPLS-1)
-S9 +S9 -S9 +S9
«Гремучий», вблизи ж/д станции «Ростов-Берег», ул. Амбулаторная, 55 * 09.06.09 1,95* 2,69* 2,76* 2,58*
24.06.09 1,55* 2,64* 1,68* 2,01*
29.06.09 1,53* 2,67* 1,24 2,38*
13.07.09 1,24 2,57* 1,43 2,75*
В районе Ростовского зоопарка, на правом берегу р. Темерник* 09.06.09 1,86* 1,85* 0,71 1,34
02.07.09 1,04 1,89* 0,94 1,17
16.07.09 1,12 1,71* 1,40 2,35*
Ул. Береговая, на территории Парамоновских складов 09.06.09 0,96 2,31* 1,20 1,85*
24.06.09 1,26 2,12* 1,23 1,42
29.06.09 1,35 2,06* 1,32 2,78*
16.07.09 1,19 2,09* 1,20 1,60*
Источник «Серебряный», район ж/д станции Первомайская, ГПЗ-10 09.06.09 1,28 1,95* 0,91 1,59*
24.06.09 1,04 1,76* 1,34 1,98*
29.06.09 1,14 1,94* 0,59 1,47
16.06.09 1,23 1,88* 0,80 1,55*
Пересечение ул. Борко-Капустина 10.06.09 1,21 2,01* 0,84 1,22
02.07.09 0,91 1,73* 1,18 1,22
«Сурб-Хач», у мемориального комплекса «Сурб-Хач» * 10.06.09 0,94 2,39* 1,37 1,09
02.07.09 1,00 1,94* 1,57* 1,12
16.07.09 1,22 2,05* 1,25 1,72*
Источник им. Преподобного Серафима Саровского, на территории Ботанического * сада 24.06.09 1,24 2,11* 0,97 1,81*
02.07.09 1,14 1,86* 1,03 1,66*
09.07.09 1,28 2,29* 2,32* 1,55*
16.07.09 1,24 1,85* 1,31 1,69*
16.07.09 1,21 1,93* 1,39 2,35*
Богатяновский, пр. Кировский -ул. Береговая* 16.06.09 1,08 2,12* 1,13 1,40
16.06.09 1,14 2,17* 1,26 1,84*
На территории яхт-клуба «Аврал», Нижний Железнодорожный проезд, д. 107 16.06.09 1,16 1,85* 1,29 2,26*
Нижний Железнодорожный проезд, д. 37* 22.06.09 0,96 2,54* 0,66 1,71*
Ул. Каяльская, 71* 22.06.09 1,13 1,94* 0,99 1,09
«Пост ВОХР», ул. Кобякова, 32 22.06.09 1,10 1,91* 0,88 1,11
Ул. Кржижановского, 396* 22.06.09 1,11 1,91* 1,29 1,57*
На правом берегу р. Темерник (родник Святого Павла), в районе Змиевской балки* 02.07.09 1,29 2,36* 1,73* 2,13*
Район ж/д станции «Аксай» 03.07.09 1,00 2,00* 0,89 2,71*
Район ул. Можайской, у водоемов* 09.07.09 1,21 2,01* 1,40 1,50*
У плотины низового водохранилища на правом берегу р. Темерник в Северном жилом массиве* 09.07.09 1,24 1,81* 1,04 1,27
На правом берегу р. Темерник, на ул. Куликовской, около д. 37* 10.07.09 1,29 2,05* 1,76* 2,52*
16.07.09 1,36 2,06* 1,50* 3,51*
«Богородичный», на правом берегу р. Темерник в районе женского монастыря Иверской Иконы Божьей Матери* 16.07.09 1,13 2,12* 1,58* 2,19*
# - названия родников обозначены в соответствии с «Инвентаризационным перечнем» [12];
* - отличия от контроля статистически значимы, ^критерий, р<0,05.
При использовании биосенсора E. coli AB1157 (pRecA-lux) слабый генотоксический эффект зарегистрирован в 4 пробах воды из 2 родников (10,53 %) без применения метаболической активации, в 17 пробах из 10 родников (52,63) - с использованием мета-
болической активации. Генотоксический эффект средней силы был зафиксирован только при применении метаболической активации в 22 пробах воды из 12 родников (63,16 %). Сильный генотоксический эффект в пробах воды не был обнаружен.
Наиболее сильный ответ биосенсора зарегистрирован в роднике Гремучий. Фактор индукции в пробах воды, отобранных в разное время, оставался практически неизменным и составил около 2,6 ед. (таблица). Причем реакция штамма была зафиксирована в случае как использования метаболической активации, так и без нее.
Данный факт свидетельствует о наличии постоянного источника загрязнения вблизи этого источника, который поддерживает определенный уровень поступления ДНК-тропных веществ.
Следует отметить, что для всех остальных проб родниковой воды, за исключением вышеуказанной, а также воды из родника в районе Ростовского зоопарка (на правом берегу р. Темерник), ответ биосенсора фиксировался в случае использования метаболической активации, что свидетельствует о присутствии веществ промутагенной природы.
В целом можно сделать вывод, что ДНК-тропные вещества обнаружены во всех родниках, при этом зарегистрирован слабый и средний генотоксический эффект.
При тестировании с помощью SOS-lux теста слабый генотоксический эффект зарегистрирован в 6 пробах воды 5 родников (26,32 %) без использования метаболической активации, в 14 пробах 8 родников (42,11) - с ее использованием, средний генотоксический эффект - в 2 пробах воды из 2 родников (10,53) без применения метаболической активации, а с ее использованием - в 13 пробах из 9 родников (47,37). Сильный эффект, как и в случае тестирования с биосенсором E. coli AB1157(pRecA-lux), не был зарегистрирован.
Наиболее сильный ответ биосенсора зарегистрирован при использовании метаболической активации в пробах воды родника на ул. Береговой, на территории Парамоновских складов (29.06.09) и в пробах из родника на правом берегу р. Темерник, на ул. Куликовской, 37 (16.07.09). Фактор индукции составил 2,78 и 3,51 (таблица).
Таким образом, в 15 родниках (79 %) обнаружены ДНК-тропные вещества, при этом зарегистрирован как слабый, так и средний генотоксический эффект. В 4 родниках (на пересечении ул. Борко-Капустина; на ул. Каяльская, 71; ул. Кобякова, 32 («Пост ВОХР») и у плотины низового водохранилища на правом берегу р. Темерник в Северном жилом массиве) ответ биосенсоров, отвечающих на повреждение ДНК, не зафиксирован.
Как биосенсор E. coli AB1157 (pRecA-lux), так и Е. coli С600 (pPLS-1) отвечают повышением уровня биолюминесценции на ДНК-повреждающие вещества. При сравнении данных, полученных при помощи этих биосенсоров, можно увидеть, что результаты (присутствие/отсутствие генотоксического эффекта), полученные без метаболической активации, совпадают для 31 пробы родниковой воды (79,5 %), в случае использования активации совпадение регистрируется в 28 пробах (71,8).
Таким образом, по результатам биотестирования можно сделать вывод, что уровень загрязнения родников г. Ростова н/Д не однороден, данные для отдельных источников значительно варьируют во времени. Детальную картину загрязнения можно получить после параллельного использования биотестирования и химического анализа.
Практическое использование системы тестов на основе lux-биосенсоров показало возможность получения объективной информации о состоянии экосистем, а следовательно, повышения эффективности природоохранных мероприятий. Перспективным путем повышения чувствительности тестирования гено-токсичности может быть увеличение числа используемых тест-систем.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (проект по аналитической ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)», грант № 2.1.1/5028).
Литература
1. Modeling and measurement of a whole-cell bioluminescent biosensor based on a single photon avalanche diode / R. Daniel [et al.] // Biosens. Bioelectron. 2008. Vol. 24, № 4. P. 888-893.
2. Studies on the fluorescence fiber-optic DNA biosensor using p-hydroxyphenylimidazo[f]1,10-phenanthroline ferrum[III] as indicator / S.Y. Niu [et al.] // J. Fluoresc. 2008. Vol. 18, № 1. P. 227-235.
3. The combined bacterial Lux-Fluoro test for the detection and quantification of genotoxic and cytotoxic agents in surface water / C. Baumstark-Khan [et al.] // Technical Workshop on Genotoxicity Biosensing Aquat. Toxicol. 2007. Vol. 85, № 3. P. 209-218.
4. Fibre-optic bacterial biosensors and their application for the analysis of bioavailable Hg and As in soils and sediments from Aznalcollar mining area in Spain / A. Ivask [et al.] // Biosens. Bioelectron. 2007. Vol. 22, № 7. P. 1396-1402.
5. The cytotoxic and genotoxic potential of surface water and wastewater effluents as determined by bioluminescence, umu-assays and selected biomarkers / H. Dizer [et al.] // Che-mosphere. 2002. Vol. 46, № 2. P. 225-233.
6. Palchetti I., Mascini M. Nucleic acid biosensors for environmental pollution monitoring // Analyst. 2008. Vol. 133, № 7. P. 846-854.
7. Птицын Л.Р. Биолюминесцентный анализ SOS-ответа клеток E. mli // Генетика. 1996. Т. 32, № 3. С. 354-358.
8. A biosensor for environmental genotoxin screening based on an SOS lux assay in recombinant Escherichia coli cells / L.R. Ptitsyn [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol. 63, № 11. P. 4377-4384.
9. Physical and genetic analysis of the ColD plasmid / J. Frey [et al.] // J. Bacteriol. 1986. Vol. 166. P. 15-19.
10. Zavilgelsky G.B., Kotova V.Yu., Manukhov I.V. Action of 1,1-dimethylhydrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide // Mutation Res. 2007. Vol. 634. P. 172-176.
11. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990. 352 с.
12. Решение коллегии администрации г. Ростова н/Д от 06.02.97 № 2 о программе «Родники г. Ростова н/Д». URL: http://www.bestpravo.ru/rostov/data06/tex20470.htm (дата обращения 20.05.2009).
Поступила в редакцию_30 июля 2010 г
