CC BY
58
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ В МОСКОВСКОМ РЕГИОНЕ, МЕТОДОМ MIRU-VNTR
К. В. Шур, Д. А. Маслов, О. Б. Беккер, В. Н. Даниленко ^
Лаборатория генетики микроорганизмов, Отдел генетических основ биотехнологии, Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН, Москва
Под воздействием различных селективных факторов (применение антибиотиков, генетический полиморфизм и разнообразие иммунных статусов хозяина и др.) возбудитель туберкулеза Mycobacterium tuberculosis постоянно эволюционирует. Возникают новые линии и сублинии, характеризующиеся набором значимых и незначимых мутаций. Анализ и мониторинг представленности различных линий и их особенностей является важным для понимания эволюции патогена. В данной работе была использована коллекция из 46 клинических изолятов M. tuberculosis, выделенных в Московском регионе. Была определена их генотипическая принадлежность к различным линиям и сублиниям ти-пированием по 24 локусам MIRU-VNTR. Было показано преобладание изолятов линии Beijing в коллекции (60,9 %) и изолятов сублинии Beijing-B0/W148 (60,7 % внутри линии Beijing), характеризующихся множественной лекарственной устойчивостью (88,2 % изолятов в данной выборке). Также использованный метод позволил определить один предполагаемый случай смешанной инфекции.
Ключевые слова: Mycobacterium tuberculosis, генотипирование, филогенетика, эпидемиология, Beijing, MIRU-VNTR
Финансирование: работа выполнена в рамках двустроннего проекта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 13-04-91444 «Токсины-антитоксины и RpsA в лекарственной устойчивости и персистенции микобактерий туберкулеза»).
Благодарности: авторы благодарят коллектив отдела микробиологии Центрального научно-исследовательского института туберкулеза (Москва) и, в частности, д. б. н. Ларису Черноусову за помощь в создании коллекции клинических изолятов M. tuberculosis.
[ЯЗ Для корреспонденции: Даниленко Валерий Николаевич ул. Губкина, д. 3, г Москва, 119333; [email protected]
Статья получена: 01.02.2017 Статья принята к печати: 24.02.2017
MIRU-VNTR GENOTYPING OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS CLINICAL ISOLATES FROM MOSCOW REGION
Shur KV, Maslov DA, Bekker OB, Danilenko VN H
Laboratory of Bacterial Genetics, Department of Genetics and Biotechnology, Vavilov Institute of General Genetics of RAS, Moscow, Russia
Antibiotic selection pressure, genetic polymorphism as well as diversity of the immune status of the host and other selection factors continuously prompt Mycobacterium tuberculosis, the tuberculosis causative agent, to evolve. Significant or insignificant mutations shape new (sub)lineages of the pathogen whose evolution can be understood only through analyzing and monitoring its genotypic diversity and properties of its lineages. In our study we used a set of 46 M. tuberculosis clinical isolates from Moscow region. The samples were typed using the standard 24-loci MIRU-VNTR technique. Beijing family isolates were shown to prevail in the collection (60.9 %), as well as Beijing-B0/W148 subtype (60.7 % of total Beijing type samples); most of them (88,2 %) were multidrug-resistant resistant. The applied technique allowed us to detect one case of a mixed-strain infection.
Keywords: Mycobacterium tuberculosis, genotyping, phylogenetics, epidemiology, Beijing, MIRU-VNTR
Funding: this work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (Grant No. 13-04-91444 Toxin-antitoxins and RpsA in TB drug resistance and persistence).
Acknowledgements: the authors thank the research team of the Department of Microbiology of the Central TB Research Institute (Moscow) for their assistance in preparing a collection of M. tuberculosis isolates, with special thanks going to Larisa Chernousova, D. Sci. (Biol).
Ex] Correspondence should be addressed: Valery Danilenko ul. Gubkina, d. 3, Moscow, Russia, 119333; [email protected]
Received: 01.02.2017 Accepted: 24.02.2017
Приобретение лекарственной устойчивости штаммами возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis — одна из самых значимых проблем фтизиатрии, в том числе в России, где ежегодно фиксируется 115 тыс. случаев заболевания туберкулезом (80 случаев на 100 тыс. человек), а 20 % всех впервые выявленных и 50 % ранее получавших противотуберкулезную терапию пациентов инфицированы штаммами с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) [1]. Таким образом, для совершенствования
схем терапии, критически важным является поиск и определение особенностей наиболее распространенных на территории России штаммов M. tuberculosis.
Изоляты микобактерий туберкулеза относят к различным линиям, каждая из которых имеет определенное географическое происхождение [2] и характеризуется набором филогенетических маркеров, влияющих также на фенотип штамма [3]. В России наиболее часто встречаются представители линии Beijing, которая характеризуется
повышенной трансмиссивностью, вирулентностью, частотой мутаций в геноме и другими свойствами, способствующими их распространению [4].
В недавних исследованиях, проведенных в России [5], были обнаружены штаммы сублинии Beijing-B0/W148. Они характеризуются повышенной (по отношению к родительской линии Beijing) вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью (практически полным отсутствием лекарственно-чувствительных штаммов в данной сублинии). Mokrousov и соавт. назвали Beijing-B0/W148 «успешным клоном» M. tuberculosis [5].
Для определения принадлежности штамма/изолята M. tuberculosis к какой-либо линии применяют различные методы генотипирования: метод полиморфизма длин ре-стрикционных фрагментов мобильного элемента IS6110 (IS6110 restriction fragment lengh polymorphism, RFLP), сполиготипирование [6], методы, основанные на маркерных однонуклеотидных полиморфизмах (single nucleotide polymorphism, SNP) генов «домашнего хозяйства» (housekeeping genes) [7] и систем токсин-антитоксин II типа [8]. Все эти методы различаются по стоимости и трудоемкости исследования, а также по своей дискриминирующей способности. Одним из наиболее быстрых, дешевых, но в то же время обладающих наибольшей дискриминирующей способностью является молекулярный метод ге-нотипирования, основанный на анализе количества распределенных по геному M. tuberculosis повторов — MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repetitive units - variable number of tandem repeats) [9].
Ранее нами была проанализирована коллекция ДНК из 64 изолятов M. tuberculosis выделенных от пациентов Центрального НИИ туберкулеза (Москва). Изоляты были типированы методом сполиготипирования, показавшим, что 70,3 % из них относятся к линии Beijing [10]. Для определения доли «успешных клонов» Beijing-B0/W148 среди штаммов линии Beijing, а также для более детального анализа филогенетической структуры коллекции нами проведено типирование доступных для анализа 46 образцов ДНК коллекции по 24 локусам MIRU-VNTR. Результаты представлены в этой работе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Коллекция ДНК клинических изолятов M. tuberculosis
В работе использовали коллекцию ДНК клинических изолятов M. tuberculosis, ранее детально описанную Maslov и соавт. [10]. В частности, были установлены сполиготи-пы изолятов и их профиль лекартсвенной устойчивости к 8 противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда. На основании этого изоляты были разделены на две группы: 1) изоляты, устойчивые хотя бы к одному противотуберкулезному препарату (41 изолят); 2) контрольная группа лекарственно-чувствительных изолятов (23 изоля-та). В данной работе для анализа были доступны 46 изо-лятов, из которых к каждой группе относилась половина.
Генотипирование клинических изолятов M. tuberculosis
Генотипирование клинических изолятов проводили по 24 локусам MIRU-VNTR согласно стандартному протоколу [11]. Синтез праймеров для амплификации, описанных в [9], выполнила компания «Синтол» (Россия). Амплификацию проводили в 96-луночных планшетах с объемом лу-
нок 0,2 мл (Bio-Rad, США) с набором для проведения ПЦР «Амплификация» (Dialat, Россия) по протоколу, описанному в [9], на амплификаторе T100 (Bio-Rad, США). Полученные фрагменты разделяли в 2 % агарозном гель-электрофорезе в 1x трис-ацетат-EDTA (TAE) буфере (трис-ацетат — 40 мМ, EDTA — 1 мМ, pH 7,6). Полученные результаты интерпретировали с помощью веб-приложения MIRU-VNTRp/us [9, 12].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Итоговое распределение изолятов M. tuberculosis по профилю MIRU-VNTR с использованием программы MIRU-VNTRp/us было следующим: 60,9 % изолятов относятся к линии Beijing, 13,0 % — к LAM, 13,0 % — к T1 и T2, 4,3 % — к URAL, по одному изоляту (2,2 %) — к линиям Cameroon, S и NEW-1. Для одного изолята не удалось определить принадлежность к определенной линии. В изоляте 13-2078 были обнаружены два аллеля локуса QUB26 — 1 и 7, что может быть свидетельством смешаной инфекции [13].
На основе полученных MIRU-VNTR профилей мы построили дендрограмму (рисунок). На ней четко кластеризуются 17 изолятов, относящихся к сублинии B0/W148 (изолят 13-2078 представляет собой смесь двух штаммов, но оба относятся к сублинии B0/W148), составляя, таким образом, 60,7 % всех изолятов линии Beijing. Стоит отметить, что все они относятся к группе А — лекарственно-устойчивым изолятам, при этом 15 из них (88,2 %) обладают МЛУ, из которых, в свою очередь, 3 (20,0 %) обладают широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В предыдущей работе [10] мы провели генотипирование изолятов M. tuberculosis с использованием сполиготипи-рования. В результате изоляты разделились на 6 групп: 60,9 % изолятов принадлежат к линии Beijing, 21,7 % — к T1 и T2, 6,5 % — к LAM9, 6,5 % — к H4 (доли указаны для 46 изолятов, исследованных в данной работе). Пять изолятов имели уникальный генотип [10]. Это могло произойти в связи со случайной делецией или инсерцией спейсеров, что является довольно частым явлением из-за высокой вариабельности данного региона.
Проведенный анализ 24 локусов MIRU-VNTR позволил уточнить ранее полученные данные. Так, удалось отнести к различным линиям 4 изолята, ранее отнесеннные к Т-кластеру (два — к LAM, по одному — к S и Cameroon), и 3 изолята линии H4 (два — к Ural, один — к NEW1). В то же время удалось выявить представителей сублинии Beijing B0/W148 среди изолятов линии Beijing. Таким образом, MIRU-VNTR являтся более предпочтительным методом генотипирования M. tuberculosis в сравнении со спо-лиготипированием за счет более высокой разрешающей способности и возможности установления случаев смешанной инфекции, хотя наилучшие результаты могут быть получены только при комбинировании различных методик генотипирования.
Все изоляты сублинии Beijing-B0/W148 оказались лекарственно-устойчивыми, преимущественно МЛУ (88,2 %), что характерно для этой группы и согласуется с данными, полученными ранее [5, 14]. Этот факт дополнительно подтверждает «успешность» данной сублинии. Открытым остается вопрос о факторах, способствующих отбору
ВЕСТНИК РГМУ I 1, 2017 | VESTNIKRGMU.RU
49
NJ-TVee, MIRU-VNTR [24]: Categorical (1 >, Spoligo: Categorical (1)
MIRU-VNTR профиль по 24 локусам
22333626 52333626
6 2 3 3 3 6 2 4 2 3 3 3 6 2
4 2 3 3 3 6 2 4 2 3 3 3 6 2
42343626 4 2 3 3 3 6 16
42333626 42333626
4 2 3 3 3 6 2 4 2 3 3 3 6 2
4 2 3 3 3 6 2 4 2 3 3 3 6 2
4 2 3 3 3 6 2 4 2 3 3 3 6 2
42333626 42333626
4 2 3 3 3 6 2 4 2 3 3 3 6 2
4 2 3 3 3 6 2 4 2 3 3 3 6 2
4 2 3 3 3 6 2 4 2 3 3 3 6 2
4 2 3 3 3 6 2 4 2 3 3 3 6 2
4 2 3 3 3 6 2 4 2 3 3 3 6 2
4 2 3 3 3 6 2 3 2 2 3 3 2 2
3 4 2 2 6
4232362234216 2 1 3 14 2 2 6
22334226 22224226
22324226 22224226
22334225 4243321534225
3 2 3 4 3 4 2
2 4 4 2 6
422 И 232244425 5268132244426
2264332224126 2244232224126
2244332224125 2244332224125
2244332224125 2255332224126
6 3 3 6 3 6 3 3 5 3
6 3 3 6 3 6 3 3 5 3
6 3 3 6 3 6 3 3 5 3
6 3 3 5 3 5 3 3 6 3
6 3 3 5 3 6 2 6 3 3 6 3 6 2
63363723 3 3 6 3 1 2 3
3 3 6 3 7 2 3
3 3 5 3 7 2 3 3 3 6 3 7 2 3
3 3 6 3 7 2 3 3 3 5 3 7 2 3
3 3 5 3 7 2 3 3 3 6 3 7 2 3
3 3 6 3 7 2 3 3 3 6 3 7 2 3
3 3 5 3 7 2 3 3 3 6 3 7 2 3
3 3 5 3 7 2 3 3 3 6 3 7 2 3
3 3 6 3 7 2 3 53333322
53233822 53333522
53333322
6 3 3 3 5 6 0 1 63435622
53333522 43333832
1 3 3 2 3 8 3 2 1 3 3 2 S 7 3 2
5 3 3 2 2 5 3 3 2 2
53322422 53322522
53322522
Филогенетическое NJ-древо изолятов M. tuberculosis, выделенных в Московском регионе. Древо построено с использованием данных профиля MIRU-VNTR24 для каждой филогенетической группы. Красным выделена сублиния Beijing-B0/W148
именно этой филогенетической группы. Видимо, повышенная мутационная изменчивость привела к функциональным перестройкам, позволившим повысить вирулентность и выживаемость данной группы [4]. Ответы на эти вопросы предстоит получить в будущих исследованиях.
ВЫВОДЫ
Оценка и эпидемиологический контроль за распространением успешных линий M. tuberculosis являются важней-
шейшими задачами в рамках организации эффективной диагностики и лечения больных туберкулезом. Результаты, полученные в исследовании, позволяют говорить о тенденции распространения штаммов сублинии Beijing-B0/ W148, для которых характерен МЛУ-фенотип, дополняют существующие эпидемиологические данные для центрального региона России, а также подчеркивают важность применения различных методик генотипирования для наиболее полной характеристики клинических изолятов M. tuberculosis.
Литература
World Health Organization. Global tuberculosis control: WHO report 2015. Vol. 1. Geneva, Switzerland; 2015. Homolka S, Niemann S, Russell DG, Rohde KH. Functional genetic diversity among Mycobacterium tuberculosis complex clinical isolates: delineation of conserved core and lineage-specific transcriptomes during intracellular survival. PLoS Pathog. 2010 Jul; 6 (7): e1000988. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000988. Mitchison DA, Wallace JG, Bhatia AL, Selkon JB, Subbaiah TV, Lancaster MC. A comparison of the virulence in guinea-pigs of South Indian and British tubercle bacilli. Tubercle. 1960 Feb; 41: 1-22.
Villellas C, Aristimuno L, Vitoria M-A, Prat C, Blanco S, Garcia de Viedma D, et al. Analysis of mutations in streptomycin-resistant strains reveals a simple and reliable genetic marker for identification of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype.
J Clin Microbiol. 2013 Jul; 51 (7): 2124-30. DOI: 10.1128/ JCM.01944-12.
Mokrousov I, Narvskaya O, Vyazovaya A, Otten T, Jiao WW, Gomes LL, et al. Russian "successful" clone B0/W148 of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: A multiplex PCR assay for rapid detection and global screening. J Clin Microbiol. 2012; 50 (11): 3757-9. DOI: 10.1128/JCM.02001-12. van Soolingen D, Qian L, de Haas PE, Douglas JT, Traore H, Portaels F, et al. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of east Asia. J Clin Microbiol. 1995 Dec; 33 (12): 3234-8.
Homolka S, Projahn M, Feuerriegel S, Ubben T, Diel R, Nubel U, et al. High resolution discrimination of clinical Mycobacterium tuberculosis complex strains based on single nucleotide polymorphisms. PLoS One. 2012; 7 (7): e39855. DOI:
10.1371/journal.pone.0039855.
8. Zaychikova MV, Zakharevich NV, Sagaidak MO, Bogolubova NA, Smirnova TG,Andreevskaya SN, et al. Mycobacterium tuberculosis Type II Toxin-Antitoxin Systems: Genetic Polymorphisms and Functional Properties and the Possibility of Their Use for Genotyping. PLoS One. 2015 Dec 14; 10 (12): e0143682. DOI: 10.1371/journal.pone.0143682.
9. Weniger T, Krawczyk J, Supply P, Niemann S, Harmsen D. MIRU-VNTRplus: a web tool for polyphasic genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria. Nucleic Acids Res. 2010 Jul; 38 (Web Server issue): W326-31. DOI: 10.1093/nar/gkq351. Epub 2010 May 10.
10. Maslov DA, Zaichikova MV, Chernousova LN, Shur KV, Bekker OB, Smirnova TG, et al. Resistance to pyrazinamide in Russian Mycobacterium tuberculosis isolates: PncA sequencing versus Bactec MGIT 960. Tuberculosis (Edinb). 2015 Sep; 95 (5): 608-12. DOI: 10.1016/j.tube.2015.05013.
11. Supply P, Allix C, Lesjean S, Cardoso-Oelemann M, Rüsch-Gerdes S, Willery E, et al. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-
number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2006 Dec; 44 (12): 4498-510. DOI: 10.1128/ JCM.01392-06. Epub 2006 Sep 27.
12. Allix-Beguec C, Harmsen D, Weniger T, Supply P, Niemann S. Evaluation and strategy for use of MIRU-VNTRplus, a multifunctional database for online analysis of genotyping data and phylogenetic identification of Mycobacterium tuberculosis complex isolates. J Clin Microbiol. 2008 Aug; 46 (8): 2692-9. DOI: 10.1128/JCM.00540-08. Epub 2008 Jun 11.
13. Cohen T, van Helden PD, Wilson D, Colijn C, McLaughlin MM, Abubakar I, et al. Mixed-strain Mycobacterium tuberculosis infections and the implications for tuberculosis treatment and control. Clin Microbiol Rev. 2012 Oct; 25 (4):708-19. DOI: 10.1128/CMR.00021-12.
14. Mokrousov I. Mycobacterium tuberculosis phylogeography in the context of human migration and pathogen's pathobiology: Insights from Beijing and Ural families. Tuberculosis (Edinb). 2015 Jun; 95 Supple 1: S167-76. DOI: 10.1016/j.tube.2015.02.031. Epub 2015 Feb 24.
References
1. World Health Organization. Global tuberculosis control: WHO report 2015. Vol. 1. Geneva, Switzerland; 2015.
2. Homolka S, Niemann S, Russell DG, Rohde KH. Functional genetic diversity among Mycobacterium tuberculosis complex clinical isolates: delineation of conserved core and lineage-specific transcriptomes during intracellular survival. PLoS Pathog. 2010 Jul; 6 (7): e1000988. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000988.
3. Mitchison DA, Wallace JG, Bhatia AL, Selkon JB, Subbaiah TV, Lancaster MC. A comparison of the virulence in guinea-pigs of South Indian and British tubercle bacilli. Tubercle. 1960 Feb; 41: 1-22.
4. Villellas C, Aristimuno L, Vitoria M-A, Prat C, Blanco S, Garcia de Viedma D, et al. Analysis of mutations in streptomycin-resistant strains reveals a simple and reliable genetic marker for identification of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype. J Clin Microbiol. 2013 Jul; 51 (7): 2124-30. DOI: 10.1128/ JCM.01944-12.
5. Mokrousov I, Narvskaya O, Vyazovaya A, Otten T, Jiao WW, Gomes LL, et al. Russian "successful" clone B0/W148 of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: A multiplex PCR assay for rapid detection and global screening. J Clin Microbiol. 2012; 50 (11): 3757-9. DOI: 10.1128/JCM.02001-12.
6. van Soolingen D, Qian L, de Haas PE, Douglas JT, Traore H, Portaels F, et al. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of east Asia. J Clin Microbiol. 1995 Dec; 33 (12): 3234-8.
7. Homolka S, Projahn M, Feuerriegel S, Ubben T, Diel R, Nubel U, et al. High resolution discrimination of clinical Mycobacterium tuberculosis complex strains based on single nucleotide polymorphisms. PLoS One. 2012; 7 (7): e39855. DOI: 10.1371/journal.pone.0039855.
8. Zaychikova MV, Zakharevich NV, Sagaidak MO, Bogolubova NA, Smirnova TG,Andreevskaya SN, et al. Mycobacterium tuberculosis Type II Toxin-Antitoxin Systems: Genetic Polymorphisms and Functional Properties and the Possibility of Their Use for
Genotyping. PLoS One. 2015 Dec 14; 10 (12): e0143682. DOI: 10.1371/journal.pone.0143682.
9. Weniger T, Krawczyk J, Supply P, Niemann S, Harmsen D. MIRU-VNTRplus: a web tool for polyphasic genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria. Nucleic Acids Res. 2010 Jul; 38 (Web Server issue): W326-31. DOI: 10.1093/nar/gkq351. Epub 2010 May 10.
10. Maslov DA, Zaichikova MV, Chernousova LN, Shur KV, Bekker OB, Smirnova TG, et al. Resistance to pyrazinamide in Russian Mycobacterium tuberculosis isolates: PncA sequencing versus Bactec MGIT 960. Tuberculosis (Edinb). 2015 Sep; 95 (5): 608-12. DOI: 10.1016/j.tube.2015.05013.
11. Supply P, Allix C, Lesjean S, Cardoso-Oelemann M, Rüsch-Gerdes S, Willery E, et al. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2006 Dec; 44 (12): 4498-510. DOI: 10.1128/ JCM.01392-06. Epub 2006 Sep 27.
12. Allix-Beguec C, Harmsen D, Weniger T, Supply P, Niemann S. Evaluation and strategy for use of MIRU-VNTRplus, a multifunctional database for online analysis of genotyping data and phylogenetic identification of Mycobacterium tuberculosis complex isolates. J Clin Microbiol. 2008 Aug; 46 (8): 2692-9. DOI: 10.1128/JCM.00540-08. Epub 2008 Jun 11.
13. Cohen T, van Helden PD, Wilson D, Colijn C, McLaughlin MM, Abubakar I, et al. Mixed-strain Mycobacterium tuberculosis infections and the implications for tuberculosis treatment and control. Clin Microbiol Rev. 2012 Oct; 25 (4):708-19. DOI: 10.1128/CMR.00021-12.
14. Mokrousov I. Mycobacterium tuberculosis phylogeography in the context of human migration and pathogen's pathobiology: Insights from Beijing and Ural families. Tuberculosis (Edinb). 2015 Jun; 95 Supple 1: S167-76. DOI: 10.1016/j.tube.2015.02.031. Epub 2015 Feb 24.
BECTHMK PrMy | 1, 2017 | VESTNIKRGMU.RU
51
