CC BY
37
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ DROSOPHILA MELANOGASTER
Мелащенко Елена Сергеевна
лаборант лаборатории молекулярно-генетических технологий инновационного парка БФУ им. И. Канта, студентка Балтийского Федерального Университета им. И. Канта, РФ, г. Калининград
E-mail: [email protected]
GENOTYPING OF DROSOPHILA MELANOGASTER
Melashchenko Elena
lab technician laboratory of molecular- genetic technologies innovation park BFU,
student of Baltic Federal University, Russia, Kaliningrad
АННОТАЦИЯ
Целью работы являлось генотипирование Drosophila melanogaster основанное на различии генотипов ее бактерии Wolbachia. Для достижения цели использовались методы: выделение ДНК, ПЦР и электрофорез. Был определен генотип Wolbachia, а так же выявлена видовая принадлежность дрозофил.
ABSTRACT
The main work objective was Drosophila melanogaster genotyping based on the distinction between genotypes of its bacterium Wolbachia. With that end in view, such methods were used: DNA extraction, PCR and electrophoresis. The genotype of Wolbachia was defined as well as species of drosophilas was identified.
Ключевые слова: генотип; Drosophila melanogaster; Wolbachia; выделение ДНК; ПЦР; электрофорез.
Keywords: genotype; Drosophila melanogaster; Wolbachia; DNA extraction; PCR; electrophoresis.
Плодовая мушка Drosophila melanogaster — насекомое семейства Drosophiliadae из отряда Diptera. Популярный модельный объект биологии, в частности генетики и биологии развития. Это связано с простотой и удобством культивирования в лабораторных условиях, коротким жизненным циклом,
возможностью получения большого количества потомства от одного скрещивания.
В популяциях БгоБорЬИа me1anogasteг широко распространена бактерия Шо1ЬасЫа [1, с. 404]. Особенности этого эндопаразита заключаются в таких малоизученных симбиотических проявлениях, как увеличение плодовитости, выживаемости и даже адаптивности. Она размножается в женских половых путях и передается по материнской линии, что объясняет меньшую важность самцов при ее распространении [7, с. 587]. И с этого момента начинаются паразитические проявления Шо1ЬасЫа: феминизация, партеногенез, цитоплазматическая несовместимость и андроцид [3, с. 1].
Для содержания линий Dгosophi1a me1anogasteг в лабораторных условиях использовалась среда на основе спрессованных дрожжей.
Таблица 1.
Протокол варки среды _
Кипятить 20 мин. Вода, л 500
Агар-агар,г 3,2
Дрожжи сухие, г 12
Добавить и еще 20 мин. кипятить Крупа манная, г 18
Сахар, г 18
После варки, чтобы предохранить от прорастания плесени, в среду добавлялся нипангин растворенный в 96 %-ном спирте из расчета 10 мл раствора на 1 л среды, что в конечном пересчете на сухой нипангин составляет 0,1 % [2, с. 46]. Далее среда произвольно разливалась по пробиркам (использовались фалконы на 50 мл) и закрывалась ватной пробкой. Вата должна быть в пробирке почти всегда, за исключением момента перевода культуры на новый субстрат, это делается для избегания заползания в пробирку мух другой линии или дикого типа [2, с. 50].
Объектом выделения нуклеиновой кислоты был организм самки дрозофилы. Выполнялась поставленная задача двумя методами, базирующимися на осаждении ДНК при центрифугировании:
1. «Колоночный» метод. Использование набора колонок с силикой ^Ю2).
2. Выделение ДНК с помощью Proteinase K и деинсталлирующего буфера (DB).
Контролем выхода нуклеиновой кислоты, после экстракции было измерение концентрации ДНК с помощью электрофотометра.
Для получения достаточного количества детектируемого материла проведено 40 циклов ПЦР, состоящих из трех температурных стадий: 95° С, 55° С, 72° С и добавочный цикл с 72° С — 2 мин. обеспечивающий более результативную элонгацию. Так же в постановку ПЦР включался отрицательный контрольный образец, имеющий все компоненты для реакции, кроме ДНК. В ПЦР смесь входят: Н2О 15 мкл; Mix 5 мкл; праймеры F+R 2+2 мкл; ДНК 1 мкл. Праймеры, использованные в работе, специфичны к двум локусам встройки инсерционной последовательности бактерии (IS5 — WD0516/7 и IS5 — WD1310) и двум минисателлитным повторам (VNTR — 141 и VNTR — 105) [1, с. 415].
С наработанными фрагментами проводился горизонтальный гель-электрофорез. Брался 1,5 % агарозный гель, состоящий из: агарозы, TAE и бромистого этидия. Гель помещался в камеру, заполненную буферным раствором, в него добавлялось ДНК, смешанное с загрузочным буфером, и молекулярный маркер, содержащий фрагменты известной длины. Камера закрывалась и к образцам прикладывалось электрическое поле 3 V/см 35-60 мин. ДНК, имея отрицательный заряд, двигалось от катода к аноду.
При анализе электрофоретического разделения продуктов визуализация происходит под действием ультрафиолета. Размер фрагмента ДНК сравнивается с линейкой и положением относительно других фрагментов. Полученные данные о скорости прохождения ДНК фрагментом агарозного геля имело узнаваемое соответствие с каким либо генотипом Wolbachia [4, с. 2].
Таблица 2.
Генотипы Wolbachia.
IS5 - IS5 - Номер Номер
Генотип WD1310 WD0516/7 VNTR — VNTR —
генотипа 141 105
локус локус
CS wMelCS Да Нет 6 4
wMelCS2 Да Нет 6 5
MEL wMel Нет Да 7 5
Сравнивая полученную электрофоретическую картину и табличные данные, можно подтвердить видовую принадлежность данной особи или установить к какой лабораторной линии она относится, так как при постоянном поддержании не исключена ошибка с переносом генетического материала из одной линии в другую. Тогда процедура генотипирования может заменить контроль качества этих линий.
Список литературы:
1. Илинский Ю.Ю., Быков Р.А., Захаров И.К. Цитотипы мутантных линий Drosophila melanogaster фонда лаборатории генетики популяций института цитологии и генетики со ран: генотипы эндосимбионта Wolbachia и митотипы вида-хозяина // Вавиловский журнал генетики и селекции — 2013 — том 17, — № 3 — С. 407—415.
2. Медведев Н.Н. Практическая генетика // Академия Науки СССР — 1968 — № 2. — С. 46—47.
3. Ilinsky Yu. Coevolution of Drosophila melanogaster mtDNA and Wolbachia Genotypes // PLoS ONE 8(1): e54373. doi:10.1371/journal.pone.0054373
4. Ilinsky Yu, Zakharov I (2007) Infection of the Uman' population of Drosophila melanogaster with the cytoplasmic endosymbiont Wolbachia // Dokl Biol Sci 413: 166—168. doi: 10.1134/s0012496607020238.
5. Ilinsky Yu, Zakharov I (2007) The endosymbiont Wolbachia in Eurasian populations of Drosophila melanogaster // Russ J Genet 43: 748—756. doi: 10.1134/s102279540707006x.
6. Pieter A. Arnold, Karyn N. Johnson and Craig R. White Physiological and metabolic consequences of viral infection in Drosophila melanogaster // The Journal of Experimental Biology 1 September 2013: 3350—3357.
1. Werren J.H. (1991) Biology of Wolbachia II Annu Rev Entomol 42: 581-609. doi: 10.114 6lannurev. ento .42.1.581
