CC BY
46
БИОЛОГИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 579.61:616-078
генотипический анализ карбапенем-устойчивого штамма acinetobacter baumannii
А. Е. Гончаров1, М. И. Еремеева2, Н. А. Зубарева3, А. П. Соломенный4
1 Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И. И. Мечникова,
г. Санкт-Петербург, 2 ООО «Лабораторные технологии», 3Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера, 4Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, г. Пермь
В отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) г. Перми выделен интегрон-позитивный штамм Асте1оЬШвг Ьаитати, устойчивый к имипенему и меропенему. С помощью анализа вариабельных тандемных повторов генома (МУА) доказано клональное родство пермского штамма с представителями всемирной эпидемической линии II А. Ьаитатп.
Ключевые слова: АстеЮЬааег Ьаитати, MLVA, карбапенемы, интегрон, ОРИТ.
Введение
Грамотрицательная коккобацилла Аств-¡оЬайвт Ьаитати является одним из лидирующих оппортунистических патогенов в современной клинике. В рамках проекта «РЕЗОРТ», проводимого в 2002-2004 гг. в 34 отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) России, обнаружено, что А. Ьаитати составлял 15,1% от числа грам-отрицательных возбудителей госпитальных инфекций [4]. При исследовании более 2000 образцов клинического материала из пяти ОРИТ г. Екатеринбурга данный микроорганизм был изолирован в 17,9% [6].
Если особенности физиологии рода АствШЬайвт достаточно хорошо изучены [1], то его популяционное разнообразие остается предметом дискуссии, поскольку при
вспышках госпитальной инфекции выделяется ограниченное число клональных линий A. baumannii [9]. Ранее в ряде российских ОРИТ был выделен штамм, устойчивость которого к аминогликозидам определяется ин-тегроном 1-го класса, известным среди зарубежных эпидемических клонов [3]. Несмотря на то, что сравнительный анализ состава элементов, посредством которых осуществляется обмен генетической информацией, представляет несомненную эпидемиологическую ценность, список пригодных для анализа ге-нотипических маркеров постоянно расширяется. Так для определения степени кло-нального родства микроорганизмов сегодня предложено использовать многолокусный анализ вариабельных тандемных повторов генома — MLVA (Multiple Locus Variable-Number Tandem Repeats Analysis) [10].
Карбапенем-резистентный штамм А. Ьаи-татп 60 (гемокультура в ОРИТ) был выделен 30 июня 2010 года в числе лекарственно-устойчивых ацинетобактеров в ходе проспективного исследования по проекту РФФИ-Урал «Особенности рекомбинаций и мутаций возбудителей нозокомиальных инфекций в многопрофильных стационарах» (Пермский край).
Цель данной работы — определить точное геносистематическое положение выделенного ацинетобактера в списке известных эпидемических штаммов.
Материалы и методы
ИССЛЕДОВАНИЯ
Хемотаксономическая идентификация штамма А. Ьаитапт 60 проведена с использованием общепринятых тестов [2]. Также проверена способность поддерживать рост при 44°С. Для генетического подтверждения в полимеразной цепной реакции (ПЦР) получали специфический фрагмент гена ^ рРНК размером 400 п. н. Чувствительность к имипенему и меропенему определяли диско-диффузионным методом (диски с имипенемом (10 мкг) и меропенемом (10 мкг) производства НИцФ (г. Санкт-Петербург). Чувствительность к теллуриту калия (категория х. ч.) была определена методом двукратных разведений в LB-агаре в диапазоне 0—128 мкг/мл.
Бактериальную ДНК получали методом «горячего лизиса» (при 95°С) клеточной суспензии в виде биомассы 2—3 колоний, выросших на LB-агаре с очисткой центрифугированием. В качестве метода генетического типирования применен MLVA по восьми хромосомным локусам при использовании наборов праймеров и режимов ПцР, предложенных С. Роигсе1 е1 а1. [10]. Кластерный анализ выполнен с построением дендрограммы
при помощи программного обеспечения, размещенного по URL-адресу: http://insilico. ehu.es/dice_upgma.
Дополнительно проведены реакции на наличие рекомбинационно-активной части интегрона 1-го класса (гена интегразы), а также интегрон-ассоциированных генов антимикробной устойчивости с помощью праймеров и в условиях, подробно изложенных ранее [5, 8, 12], с двумя видами Taq-полимеразы: обычной и пригодной для амплификации фрагментов ДНК более 6000 п. н. в «large-scale» ПЦР (производство ООО «СибЭнзим-М»).
Результаты и их обсуждение
Показано отсутствие антимикробного действия имипенема и меропенема в отношении штамма 60 (видимые зоны ингибиро-вания роста не определялись). Минимальная ингибирующая концентрация теллурита калия для изученного штамма составила 16 мкг/мл.
На матрице геномной ДНК амплифици-рован фрагмент гена интегразы 1-го класса размером 327 п. н., включающей интегрон-ный промотор. Однако в обнаруженном ин-тегроне отсутствует характерная последовательность детерминанты устойчивости к сульфамидам sull. Ни в условиях обычной, ни в условиях «large-scale» ПцР не получена амплификация участка ДНК, расположенного между геном интегразы и tni-модулем транспозона Tn402, возможная в sul-негативном варианте интегрона 1-го класса.
MLVA-профиль определен с помощью набора маркерных праймеров Abaum_3530, Abaum_3002, Abaum_2240, Abaum_1988, Abaum_0845, Abaum_0826, Abaum_2396, Abaum_3468, число тандемных повторов в типированных локусах составило 7, 7, 4, 9, 10, 17, 20 и 14 соответственно.
Пермский медицинский журнал
2011 том XXVIII № 6
На основании компьютерного анализа данных методом невзвешенного попарного среднего (UPGMA) построена дендрограмма, где пермский штамм 60 объединяется в единый кластер со штаммом A. baumannii RUH134 и наиболее тесно — со штаммом A. baumannii ACICU (см. рис.). Штамм RUH134 (выделен в Нидерландах в 1982 г.) признан прототипом эпидемической клональной линии II A. baumannii (International clonal lineage II) [10].
RYE -
RUH875 -
RUH134 --
HCICU --
бВрегп -
ПТСС17978 -
RUH5875 -
-1-1-1-Г
(1.1 0.2 (1.3 0.5
Рис. Кластеризация штамма 60 (обозначен 60perm) с помощью MLVA-генотипирования в сравнении с представителями эпидемических клональных линий A. baumannii II (в тексте), I (штаммы AYE и RUH875) и III (RUH5875 и штамм, депонированный в Американской коллекции типовых культур ATCC)
Карбапенем-устойчивый штамм ACICU был выделен в 2005 году при расследовании вспышки инфекции в ОРИТ госпиталя Сан Джованни-Аддолората» (Рим, Италия, www.hsangiovanni.roma.it/home.aspx). Другие штаммы эпидемической линии A. bauman-nii II известны по результатам исследований в Чехии, Великобритании, Китае и ряде других стран [9]. Эпидемические штаммы, относящиеся к данной линии, как правило, обладают множественной лекарственной устойчивостью (включая резистентность к кар-бапенемам), и выделяются, как правило, в ОРИТ [7].
Первичная нуклеотидная последовательность генома штамма ACICU полностью определена [13]. Анализ данных полномасштаб-
ного секвенирования показал, что устойчивость к карбапенемам связана с двукопийным геном Ыа0ХА_58, кодирующим высокоактивную оксациллиназу и расположенным на небольшой (по-видимому, трансмиссивной) плаз-миде размером около 28 тысяч пар нуклео-тидов (т. п. н.). В хромосоме штамма ACICU в составе «острова резистентности» присутствует интегрон 1-го класса sul-типа с генными кассетами устойчивости к аминогликози-дам (аасА4) и цефалоспоринам (Ыа0ХА_20). У штамма ACICU определены две детерминанты устойчивости к теллуриту хромосомной и плазмидной локализаций.
Различие в составе генетических элементов между близкородственными пермским и итальянским штаммами А. Ьаитапт проявляется на уровне потенциально мобильного генетического элемента — интегрона. Наблюдаемая вариабельность может быть объяснена особенностями микроэволюции возбудителя на локальном уровне, когда подвижные генетические элементы лекарственной устойчивости закрепляются в геноме в ответ на прессинг применяемых антимикробных препаратов. В последние 10 лет стало отчетливо ясно, что значимая часть возбудителей инфекции в ОРИТ является инте-грон-позитивной [3, 9].
Ранее исследователи из Франции с помощью пульс-электрофореза показали уникальный генотипический характер карбапе-нем-устойчивого штамма А. Ьаитати, выделенного от пациента кардиологического отделения в Москве в 2005 году [11]. Следует признать, что сравнительный генетический анализ может быть выполнен различными способами, и поиски «золотого стандарта» методики генотипирования продолжаются. Использованная в настоящем исследовании методика MLVA представляется перспективной для ее внедрения в систему эпидемиологического надзора за ацинетобактерной ин-
фекцией, учитывая сравнительную легкость выполнения и возможность сопоставления результатов, полученных в различных лабораториях. В любом случае, Уральский регион представляет несомненный интерес для мониторинга выделяемых резистентных штаммов, поскольку есть все основания рассматривать его в качестве «эпидемического моста» между Европой и Азией. Важнейшая цель исследований — предотвратить укоренение лекарственно-устойчивых штаммов в многопрофильных и специализированных медицинских стационарах, например перинатальных и кардиохирургических центрах.
Представленная работа поддержана грантом РФФИ-Урал № 10-04-96023 на 2010— 2012 гг., номер государственной регистрации 01201057541 и фЦп «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг., ГК № 16.740.11.0348.
Выводы
1. Обнаружение штамма клональной линии II в России, выделенного как гемокульту-ра, дополнительно подтверждает факт глобального распространения карбапенем-ус-тойчивого эпидемического генотипа A bau-mannii.
2. Возможность корректного генотипи-ческого сравнения штаммов, выделяемых в российских ОРИТ, сдерживается отсутствием стандартизованных систем регионального и национального мониторинга.
Библиографический список
1. Внутриклеточное концентрирование мономерных предшественников полифосфатов и полигидроксиалканоатов Acineto-bacter calcoaceticus и Escherichia coli/ А. И. Саралов, Д. В. Мольков, О. М. Банникова, А. П. Соломенный, С. М. Чикин//Микро-биология.— 2001.— № 6.— С. 737—744.
2. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных)//? Вейант, У. Мосс, Р. Уивер и др.- М.: Мир, 1999.— 791 с.
3. Появление интегрон-позитивного полирезистентного штамма Acinetobacter baumannii в российских стационарах/ А. П. Соломенный, А. Ю. Максимов, А И. Саралов, Р. Х. Яфаев и др.//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.— 2008.— № 4.— С. 89—91.
4. Резистентность к антибиотикам грамот-рицательных возбудителей нозокомиаль-ных инфекций в ОРИТ многопрофильных стационаров России/Г К. Решедько, Е. Л. Рябкова, О. И. Кречикова и др.//Клин. микробиол. антимикроб. химиотер.— 2008.— № 2.— С. 96—112.
5. Соломенный А. П. Генетическая вариабельность резистентных интегронов энтеро-бактерий/А. П. Соломенный, Я. Э. Ляпунов, Р. З. Кузяев//Бюлл. эксперим. биол. мед.— 2011.— № 5.— С. 556—559.
6. Этиология госпитальных инфекций в ОРИТ Екатеринбурга: тенденции 2007 года/С. М. Розанова, В. П Шилова, С. И. Пе-ревалова и др.//Журн. интенсив. терапии.— 2008.— № 2.— Режим доступа: http://www. id. ru/2008-02-01.html.
7. Changing carbapenemase gene pattern in an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii lineage causing multiple outbreaks in central Italy/5. DArezzo, L. Principe, A. Capone et al.//J. Antimicrob. Chemother.— 2011.— Vol. 66.— № 4.— P. 54—61.
8. Detection of gene cassettes in Tn402-like class 1 integrons/K Post, G. D. Recchia, R. M. Hall//Antimicrob. Agents Chemother.— 2007.— Vol. 51.— № 3.— P. 3467—3468.
9. Durante-Mangoni E. Global spread of drug-resistant Acinetobacter baumannii: molecular epidemiology of multidrug-resistant A. baumannii/E. Durante-Mangoni, R. Zar-
Пермский медицинский журнал
2011 том XXVIII № 6
rilli//Future Microbiol.- 2011.- Vol. 6— № 1.— P. 407—422.
10. Identification of variable-number tandem-repeat (VNTR) sequences in Acinetobacter baumannii and interlaboratory validation of an optimized multiple-locus VNTR analysis typing scheme/C. Pourcel, F. Minandri, Y. Hauck, S. D'Arezzo et al.//J. Clin Microbiol.— 2011.— Vol. 49.— № 4.— P. 539— 548.
11. Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii, Russia/I Naas, S. Kernbaum, S. Allali, P. Nordmann//Emerg Infect. Dis.— 2007.— Vol. 13.— № 1.— P. 669—671.
12. Sandvang D. Characterization of integrons and antibiotic resistance genes in Danish multiresistant Salmonella enterica Typhimu-rium DT104/D. Sandvang, F. M. Aarestrup, L B. Jensen//FEMS Microbiol. Lett.— 1997.— Vol. 157.— № 8.— P. 177—181.
13. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group/M. Iacono, L. Villa, D. Fortini et al.//Antimicrob. Agents Chemother.— 2008.— Vol. 52.— № 2.— P. 2616—2625.
A. E. Goncharov, M. I. Eremeeva, N. A. Zubareva, A. P. Solomennyi
GENOTYPING OF CARBAPENEM-RESISTANT ACINETOBACTER BAUMANNII STRAIN
Integron-positive imipenem-and merope-nem-resistant Acinetobacter baumannii strain was isolated at the Intensive Care Unit in Perm. By means of analysis of variable-number tandem genome repeats (MLVA) clonal relationship of Perm strain with representatives of International clonal lineage of A. baumannii has been postulated.
Keywords: Acinetobacter baumannii, MLVA, carbapenem, integron, ICU.
Контактная информация: Соломенный Александр Петрович, канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории водной микробиологии Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13, тел. 8 (342) 280-83-32
Материал поступил в редакцию 07.07.2011
