CC BY
42МОЛЕКУЛЯРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
О.Ю.Борисова1, Н.В.Воложанцев2, В.Г. Мельников3, И.К.Мазурова1, С.Ю.Комбарова1, В.А.Алешкин1
ГЕНОТИПИЧЕСКИЕ РАЗЛИЧИЯ МЕЖДУ ШТАММАМИ CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE БИОВАРОВ GRAVIS И MITIS
Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского;
2ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, пос. Оболенск, Московская обл.;
3Международный научно-технический центр, Москва
Цель: Изучение структуры генетической детерминанты амилазной активности (ген amy) у штаммов C.diphtheriae биоваров gravis и mitis. Материалы и методы. Для выявления структурных особенностей штаммов C.diphtheriae разных биоваров проанализировано 87 штаммов C.diphtheriae (31 штамм биовара gravis и 56 штаммов биовара mitis), а также штамм C.diphtheriae PW8. В ПЦР использовано 10 пар праймеров, фланкирующих взаи-моперекрывающиеся области в пределах локуса DIP0357, а также дополнительные прай-меры, фланкирующие локусы DIP0353 — DIP0354, DIP0357 и DIP0358. Результаты. Установлено, что все штаммы C. diphtheriae биовара gravis содержат полноразмерный локус DIP0357 (ген amy), в то время как у всех штаммов биовара mitis этот фрагмент генома отсутствует. Все исследованные штаммы C. diphtheriae биовара gravis не имеют существенных изменений в пределах локусов DIP0354 — DIP0357 (amy ген), в то время как в геноме 57 исследованных штаммов C. diphtheriae биовара mitis большая часть этого фрагмента, в том числе, вся нуклеотидная последовательность гена amy, отсутствует. Заключение: Штаммы C. diphtheriae биовара gravis обладают генетически детерминированной способностью продуцировать амилазу, что можно рассматривать как дополнительный фактор патогенности, дающий микроорганизмам более широкие возможности колонизировать слизистую оболочку ротоглотки.
Журн. микробиол., 2013, № 3, С. 24—31
Ключевые слова: Corynebacterium diphtheriae, штаммы, биовары gravis и mitis
0.Yu.Borisova1, N.V.Volozhantsev2, V.G.Melnikov3,
1.K.Mazurova1, S.Yu.Kombarova1, V.A.Aleshkin1
GENOTYPIC DIFFERENCES BETWEEN CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE BIOVAR GRAVIS AND MITIS STRAINS
1Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology; 2State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow region; international Scientific-Technical Centre, Moscow, Russia
Aim. Study structure of a genetic determinant of amylase activity (amy gene) in Corynebacterium diphtheriae biovar gravis and mitis strains. Materials and methods. 87 C. diphtheriae strains (31 gravis biovar strains and 56 mitis biovar strains) as well as C. diphtheriae PW8 strain were analyzed to detect structural features of C. diphtheriae strains of various biovars. 10 pairs of primers were used in PCR that flank mutually overlapping regions within DIP0357 locus as well as additional primers that flank DIP0353 — DIP0354, DIP0357 and DIP0358 loci. Results. All the C. diphtheriae biovar gravis strains were established to contain a full-size DIP0357 locus (amy gene) whereas in all the mitis biovar strains this genome fragment is absent. All the studied C. diphtheriae biovar gravis strains do not have significant changes within DIP0354 — DIP0357 loci (amy gene)
whereas in genome of 57 studied C. diphtheriae biovar mitis strains the major part of this fragment including the complete nucleotide sequence of amy gene is absent. Conclusion. C. diphtheriae biovar gravis strains have a genetically determined ability to produce amylase that can be viewed as an additional pathogenicity factor giving microorganisms wider capabilities to colonize the mucous membrane of oropharynx.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 3, P. 24-31
Key words: Corynebacterium diphtheriae, strains, gravis and mitis biovars
ВВЕДЕНИЕ
Возбудителем дифтерийной инфекции являются токсигенные Corynebacterium diphtheriae, продуцирующие дифтерийный токсин, который играет ведущую роль в патогенезе заболевания. Значительным достижением в изучении биологии возбудителя дифтерии явились исследования, проведенные английскими учеными под руководством J.Parkhill по расшифровке генома токсигенного штамма C. diphtheriae NCTC13129 [12]. В настоящее время хорошо известна структура генетических детерминант, ответственных за экспрессию основных факторов патоген-ности возбудителя дифтерии. Показано, что ген tox, кодирующий синтез дифтерийного токсина, является консервативным. Однако в проведенных нами исследованиях выявлены единичные мутации в В-субъединице гена tox, приводящие к изменениям аминокислотной последовательности дифтерийного токсина. Также установлено, что штаммы C.diphtheriae биовара gravis, циркулировавшие в период последнего эпидемического подъема заболеваемости дифтерией, обладали повышенным уровнем токсинообразования, что, в свою очередь, может быть связано с мутациями в гене dtxR, кодирующем регуляторный белок-репрессор DtxR [2, 3, 5, 7].
Патологический процесс при дифтерии начинается с колонизации возбудителем слизистых оболочек в месте входных ворот инфекции, и дальнейшее его течение определяется свойствами возбудителя и уровнем защищенности макроорганизма. Процесс колонизации слизистых оболочек осуществляется при помощи таких факторов патогенности, как адгезины (фимбрии и другие поверхностные структуры бактерий), связывающие железо белки-сидерофоры, различные ферменты. Изучение этих факторов, обусловливающих колонизацию слизистых оболочек, позволит разработать средства профилактики и лечения дифтерии и дифтерийного бактерионосительства.
По способности продуцировать фермент амилазу и, следовательно, разлагать крахмал коринебактерии дифтерии подразделяются на биовары. Штаммы биовара gravis способны разлагать крахмал, а штаммы биоваров mitis, intermedius и belfanti (подвариант mitis) крахмала не разлагают. Такое подразделение уже многие годы является одним из индикаторных признаков при наблюдении за штаммами возбудителя дифтерии в комплексной системе микробиологического мониторинга дифтерийной инфекции [2, 3, 5 — 7]. Способность к расщеплению крахмала под действием амилолитических ферментов (полисахараз) широко распространена среди микроорганизмов [11, 13 — 15]. Известно, что углеводы являются источниками энергии для микроорганизмов, поэтому способность утилизировать сложные сахара создает им конкурентное преимущество. Поскольку с амилазой способны связываться бактерии полости рта [15], есть основания полагать, что этот поверхностный белок также участвует в мультикомпонентной адгезии и формировании биопленки, что является пусковым механизмом инфекционного процесса. Можно полагать, что способность продуцировать амилазу дает дополнительную возможность штаммам C. diphtheriae биовара gravis быстро колонизи-
ровать слизистые оболочки ротоглотки человека. Целью данного исследования явилось изучение структуры генетической детерминанты амилазной активности (ген amy) у штаммов C.diphtheriae биоваров gravis и mitis.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования явились 87 штаммов C.diphtheriae (из них 31 штамм биовара gravis и 56 штаммов биовара mitis как токсигенные, так и нетоксигенные); вакцинный штамм C.diphtheriae биовара mitis PW8 из коллекции Научного центра экспертизы средств медицинского применения (ГИСК им. Л. А. Тарасевича); токсигенный контрольный штамм C.diphtheriae биовара gravis 665 и штамм C.diphtheriae биовара gravis 61-03 риботипа «S.Peterburg/Rossija» (из коллекции МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского). Все штаммы были идентифицированы с определением их токсигенной и биохимической (способность разлагать глюкозу, сахарозу, крахмал, цистиназу) активности согласно МУ 4.2.698-98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции».
Выделение ДНК осуществляли стандартным методом кипячения. ПЦР-смесь содержала 1,5 mM MgCb, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.0 мкМ каждого праймера, по 200 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1 мкл ДНК и 1 ед. Taq DNA-полимеразы в окончательном объеме 25 мкл. Последовательности оли-гонуклеотидных праймеров приведены в табл. 1. Нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК штаммов C.diphtheriae определяли с помощью ABI PRISM Big Terminator cycling sequencing ready reaction kit на ABI DNA секвенаторе. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программ BLAST и базы данных EMBL/GenBank на сайте Национального центра биотехнологической информации США, NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ нуклеотидных последовательностей генома бактерий С. diphthe-riae NCTC13129 (EMBL/GenBank accession no. BX248353) показал, что ген amy (локус DIP0357), детерминирующий синтез амилазы, расположен в так называемом островке патогенности, включающем локусы DIP0334 — DIP0357 (рис. 1). Для выявления предполагаемых структурных отличий генов amy в штаммах С. diphtheriae биоваров gravis и mitis проанализировали 10 взаимно-перекрывающихся фрагментов в пределах локуса DIP0357, размер которых варьировал от 749 до 840 п.н. (рис. 1). В результате проведенных исследований установлено, что фрагменты расчетного размера нарабатываются в ПЦР только с ДНК-матрицы C. diphtheriae биовара gravis (33 штамма) и ни один из 10 фрагментов не выявляется при использовании ДНК-матрицы C. diphtheriae биовара mitis (57 штаммов) (табл. 1). Для уточнения полученных результатов провели секвенирование всех 10 фрагментов гена amy двух штаммов C. di-phtheriae биовара gravis 665 и 61-03 риботипа «S.Peterburg/Rossija». Анализ полученных нуклеотидных последовательностей показал их полное соответствие с опубликованной в базе данных EMBL/GenBank последовательностью штамма C. diphtheriae NCTC13129 (acc. no. BX248353). Таким образом, все штаммы C. diphtheriae биовара gravis содержат полноразмерный локус DIP0357 (ген amy), в то время как у всех штаммов биовара mitis этот фрагмент генома отсутствует, что дает основание полагать наличие достаточно протяженной делеции в этой области генома у штаммов биовара mitis.
С целью установления размера обнаруженной делеции провели анализ нуклеотидных последовательностей, прилегающих к локусу DIP0357 (DIP0353, DIP0354 и DIP0358) с использованием дополнительных праймеров DIP03531F/ DIP03541R, DIP03532F/DIP03532R, фланкирующих локусы DIP0353-DIP0354, и
Рис. 1. Фрагмент генома штамма C.diphtheriae биовара gravis и схема расположения оли-гонуклеотидных праймеров, используемых в работе.
Пунктирной линией обозначен фрагмент генома, отсутствующий в штаммах C.diphtheriae биовара mitis.
Таблица 1. Последовательности праймеров и результат амплификации фрагментов гена amy С. diphtheriae
Положение Размер Наличие в геноме
Праймер Последовательность праймеров (5'-3') в пределах
ампликона mitis
гена amy gravis
Amy1 ATGAGAGATTCTGCTCTTCC CTCTTCGATCAAGCGCTTGA 1840- 20 820 840 п.н. + -
Amy2 TTGATCCGCACCTCGGTTCC GTACCTTGTCATCATTATCA 7911630- 811 1610 839 п.н. + -
Amy3 TGATGTGGGCCGTATCGGTT GCATCTACGGTAACCGTACG 15812420- -1601 2400 839 п.н. + -
Amy4 GACCTTAAACCTGGCACGAT TAATTCGTGCTTGTTCTCAT 23713150- 2391 -3120 779 п.н. + -
Amy5 GTAAAGATCACAGATAGCGG CGGCTTGAGCTCAGGATCGT 30913930- 3111 3910 839 п.н. + -
Amy6 ATTCGAAGTACTCGGTCATG GGTAGATCGAGCTGCCGTCG 38814720- 3901 4700 839 п.н. + -
Amy7 CTCTGAACTGACGGTAGAAA TCCTTGGCCATGTCGTTGGC 46715510- -4691 5490 839 п.н. + -
Amy8 CTCAAAGCAAAACCAGAGGA AATGGTGGCTTTCTTCGCCG 54016240- -5421 6220 839 п.н. + -
Amy9 AGGACGCGCACTTCACGCTC CGTCGGCCGTCAAAGTCAAC 61917030- -6211 7010 839 п.н. + -
Amy10 GTGGGCAACGTTTGATCAGA CAATTCTTAAACCACGTGCA 69817730- 7001 7710 749 п.н. + -
DIP03571F/DIP0358R, DIP03582F/DIP03582R, фланкирующих фрагмент локуса DIP0357 и локус DIP0358, кодирующий синтез ацил-СоА-синтетазы (рис. 1). Результаты ПЦР с использованием указанных праймеров, представленные на рис. 2 и в табл. 2, свидетельствуют в пользу того, что все исследованные штаммы С. diphtheriae биовара gravis не имеют существенных изменений в пределах локусов DIP0354 — DIP0357 (amy ген), в то время как в геноме 57 исследованных штаммов С. diphtheriae биовара mitis большая часть этого фрагмента, в том числе вся ну-клеотидная последовательность гена amy, отсутствует, размер делеции составляет около 11000 п.н.
ОБСУЖДЕНИЕ
Процессы адгезии и колонизации возбудителя дифтерии на слизистых оболочках ротоглотки являются важнейшими этапами инициации инфекционного
Таблица 2. Амплификация фрагментов ДНК локусов Б1Р0353—Б1Р0354 и Б1Р0357—Б1Р0358 С. diphtheгiae
Праймеры
Размер ампликона
Наличие в геноме С. diphtheriae
gravis
mitis
DIP03531F/DIP03541R 285 п.н. +
DIP03532F/DIP03532R 225 п.н. + +
DIP03571F/DIP0358R 307 п.н. +
DIP03582F/DIP03582R 210 п.н. + +
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР с использованием праймеров DIP03531F/ DIP03541R (A) и DIP03532F/DIP03532R (Б).
L — маркер молекулярных масс 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas, Литва); 1, 3 — ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 2, 4, 5 — ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis. Представлены данные одного типичного эксперимента. Аналогичные результаты получены со всеми анализируемыми штаммами биоваров mitis и gravis.
процесса. Способность бактерий продуцировать амилазу и утилизировать углеводы, являющиеся дополнительными источниками энергии, а также ко-аггрегировать с другими микроорганизмами дает им возможность закрепляться и размножаться на слизистых оболочках. Такой дополнительной способностью обладают штаммы C. diphtheriae биовара gravis, которые несут генетическую детерминанту, определяющую эту активность. В отличие от них, штаммы C. diphthe-riae биовара mitis не продуцируют амилазу, что связано с отсутствием в геноме соответствующего гена. Можно полагать, что штаммы биовара gravis, обладающие амилазной активностью, имеют возможность эффективнее колонизировать ротоглотку человека.
Доказательством такого предположения являются многолетние наблюдения за возбудителем дифтерии, которые проводятся в МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского. Показано [1 — 3, 5 — 7, 9] варьирование удельного веса токсигенных штаммов C. diphtheriae биоваров gravis и mitis в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции. Выявлено, что в периоды подъемов заболеваемости дифтерией циркулировали штаммы преимущественно одного биовара: в 1983, 1984 гг. преобладали штаммы биовара mitis (70,4; 80,3%, соответственно), а на пике эпидемического подъема (1994, 1995 гг.) — штаммы биовара gravis (78,6; 79,3%, соответственно). Такой закономерности не наблюдали в периоды низкой заболеваемости. Доминирование штаммов биовара gravis в 1940 — 1970-е годы, а также в течении последних 20 лет позволяет предположить, что для данного биовара характерен более продолжительный период распространенности. Это свидетельствует о том, что штаммы биовара gravis, по сравнению со штаммами биовара mitis, обладают более выраженной способностью преодолевать колонизационную резистентность и персистировать на слизистых оболочках рото- и носоглотки человека.
Между штаммами биоваров gravis и mitis при культивировании in vitro имеются и другие различия, которые могут отразиться на их вирулентности. Например, время генерации штаммов биовара gravis составляет 60 минут, а у биовара mitis — 180 минут. Штаммы C. diphtheriae gravis образуют на питательной среде более крупные колонии. К тому же, уровень продукции токсина у штаммов C. diphthe-riae биовара gravis в период подъема заболеваемости дифтерией в два — четыре
раза превышал таковой у штаммов биовара mitis [1 — 3, 5 — 7]. Следовательно, быстрорастущие штаммы биовара gravis имеют возможность более активного захвата железа из инфицированных тканей, приводя, тем самым, к более ранней и высокой продукции дифтерийного токсина.
Исследования [9] подтверждают взаимосвязь между принадлежностью возбудителя дифтерии к тому или иному биовару и особенностями клинической картины заболевания у непривитых детей. В 1980-е годы, т.е. в период спорадической заболеваемости и при преимущественной циркуляции биовара mitis, различий в степени токсичности форм дифтерийной инфекции, в зависимости от биовара возбудителя, не наблюдали. В период эпидемического подъема заболеваемости дифтерией 1990-х годов на фоне формирования генетически однородной высокотоксигенной популяции C. diphtheriae биовара gravis наблюдали утяжеление клинической картины дифтерии. Так, в 1990-е годы в 98,4% случаев у больных с тяжелыми формами дифтерии выделяли штаммы C. diphtheriae биовара gravis и регистрировали гипертоксическую форму заболевания, а при комбинированных формах в 80% случаях преобладало сочетание токсической дифтерии ротоглотки II, III степени тяжести. На основании этого нами сделано заключение, что ток-сигенные штаммы C. diphtheriae биовара gravis являются более вирулентными, чем штаммы биовара mitis. Такое положение подкрепляется данными других авторов, которые указывали на более тяжелую клиническую картину у больных дифтерией при выделении у них штаммов C. diphtheriae биовара gravis [4, 8, 10]. Таким образом, можно сделать вывод, что генетически детерминированную способность C.diphtheriae биовара gravis продуцировать амилазу следует рассматривать как дополнительный фактор патогенности, дающий микроорганизмам более широкие возможности колонизировать слизистые оболочки ротоглотки, формировать бактерионосительство и утяжелять заболевание у человека.
ЛИТЕРАТУРА
1. Борисова О.Ю. Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики при этих инфекциях. Автореф. дисс. д-ра. мед. наук. 2009.
2. Комбарова С.Ю. Микробиологический молекулярно-генетический мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции. Автореф. дисс. д-ра. биол. наук. 2007.
3. Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мельников В.Г. и др. Наблюдение за циркуляцией штаммов C.diphtheriae, различающихся по признаку токсигенности. Медицинский альманах. 2009, 2: 108-111.
4. Корженкова М.П. Клиника дифтерии в период высокой и низкой заболеваемости. Вакцинация. 2006, 1 (43): 4-6.
5. Мазурова И.К. Комплексная система лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерии. Автореф. дисс. д-ра. мед. наук. 1993.
6. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю. др. Некоторые особенности циркуляции биоваров gravis и mitis токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphtheriae. В: Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика). 2000, с. 52-55.
7. Мазурова И.К. Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю. и др. Мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2009, 3: 17-22.
8. Нисевич Н.И. Течение дифтерии в связи с типом дифтерии. Педиатрия. 1947, 3: 4451.
9. Платонова Т.В., Мазурова И.К., Борисова О.Ю. и др. Биологические свойства C.diphtheriae и их влияние на клинику дифтерии у непривитых детей в условиях различной интенсивности эпипроцесса. В: Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика). 2000, с. 55-59.
10. Хрущева В.А., Меклер С.С. Микробиологическая характеристика возбудителя дифтерии в послевоенные годы. В.Дифтерия. 1964, с.45-48.
11. Bosch J.A., Turkenburg M., Nazmi K. ct al. Stress as a determinant of saliva-mediated adherence and coadherence of oral and nonoral microorganisms. Psychosom. Med. 2003, 65 (4): 604-612.
12. Cerdeno-Tarraga A.M., Dover L/G., Holden M.T.G. d; al. The complete genome sequence and analysis of C.diphtheriae NCTC 12129. Nucleic Acids Res. 2003, 31 (22): 6516-6523.
13. Funke G., Altwegg M., Frommelt L. е; al. Emergence of related nontoxigenic C.diphtheriae biotypes mitis strains in Western Europe. J. Emerg. Infect. Diseases. 1999, 5 (3): 983-989.
14. Kirchherr J.L., Bowden G.H., Cole M.F. е; al. Physiological and serological variation in S.mitis biovar1 from the human oral cavity during the first year of life. Arch. Oral Biology. 2007, 52 (1): 90-99.
15. Rogers J.D., Palmer R.J. Jr., Kolenbrander P.E., Scannapieco F.A. Role of Streptococcus gordonii amylase-binding protein A in adhesion to hydroxyapatite, starch metabolism, and biofilm formation. Infect. Immun. 2001, 69: 7046-7056.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Борисова Ольга Юрьевна, д.м.н.,
125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, р.т. (495)459-21-46
ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 М.А.Юрова1, В.И.Пушкарева1, В.Ю.Поляков2
СУЩЕСТВОВАНИЕ YERSINIA ENTEROCOLITICA В УСЛОВИХ АГРОКОМПЛЕКСА
1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, 2НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, Москва
Цель. Выявление длительности существования Yersinia enterocolitica в субстратах агро-комплекса и формирования возбудителем биопленки при искусственном обсеменении кормов и мясных продуктов. Материалы и методы. Использован штамм Y.enterocolitica O9 и его рифампицинрезистентный (Rmr) мутант. Микробный пейзаж образцов исследовали путем высева на селективные среды (HiMedia), биохимические свойства изолятов контролировали на тест-системах API (Bio-Merieux). Наличие гена yopA, локализованного на плазмиде вирулентности pCad, определяли в ПЦР. Витальную окраску биопленок проводили красителем Live/Dead (Invitrogen, США). Визуализацию данных регистрировали с помощью микроскопа с цифровой камерой GMS-510 (США) с программным обеспечением Skope Photo (США). Формирование бактериальных биопленок иерсиний подтверждали с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM6380 (Япония). Результаты. Выявлено длительное существование Y.enterocolitica в субстратах агроком-плекса с сохранением возбудителем плазмиды вирулентности pCad. СЭМ продемонстрировала стадии формирования биопленок при искусственном обсеменении кормов для животных, на мясных продуктах и материалах пищевого оборудования в широком диапазоне температуры от 10 до 30°C, а витальный краситель выявил жизнеспособных иерсиний в зрелых биопленках. Заключение. Агрокомплексы являются вариантами техногенных очагов, где формируются экологические условия для длительного существования возбудителей сапронозов.
Журн. микробиол., 2013, № 3, С. 31—38
Ключевые слова: Yersinia enterocolitica, субстраты агрокомплекса, биопленки, техногенные очаги
