CC BY
62
УДК 576.895.421+591.52(571.1)
С.А. Рудакова1. A.A. Иатущенко1. Н.В. Фоменко2. А.Е. Тупикин2
ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОРРЕЛИЙ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ
1Омский НИИ природно-очаговых инфекций Минздрава России (Омск) 2ИХБФМ Сибирского отделения РАН (Новосибирск)
Проведено изучение с применением комплекса генетических методов геновидового состава боррелий, полученных на среде BSK-H из клещей I. persulcatus и. в индивидуальных экземплярах клещей D. reticulatus, собранных в различных ландшафтно-географических зонах. Определение нуклеотидных последовательностей межгенного спейсера 5S-23S РНК восьми изолятов боррелий, полученных из клещей I. persulcatus, показало, что они относятся к геновиду Borrelia garinii NT29, их нуклеотидные последовательности имеют, полное генетическое сходство. Впервые в клещах D. reticulatus выявлена ДНК боррелий новой геномной группы, близкой к B. afzelii. ДНК боррелий с нетипичной структурой межгенного спейсера в клещах D. reticulatus на юге Западной Сибири детектирована впервые. Вместе с тем. значение клещей этого вида в поддержании, циркуляции спирохет, комплекса B. burgdorferi s. l. требует, дальнейшего изучения.
Ключевые слова: боррелии, клещи, генотипирование
GENOTYPICAL CHARACTERIZATION OF BORRELIA SP. CIRCULATED IN NATURAL FOCI OF WEST SIBERIA
S.A. Rudakova1, A.A. Matuchenko1, N.Y. Fomenko2, A.E. Tupikin2
1Omsk Institute of Natural Foci Infections, Omsk 2Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of Siberian Branch of the Russian Academy
of Sciences, Novosibirsk
Isolates of Borrelia sp. which were deceted in BSK-H medium, from ticks Ixodes persulcatus and individual exeplars of Dermacentor reticulatus in different landscape geographical zones were examinated with complex of genotypical methods. Sequencing of 5s-23s rRNA spacer of 8 isolates of Borrelia sp. were obtained.
from I. persulcatus show it's membership to Borrelia garinii NT29 with 100 % gomology. Firstly in D. reticulatus ticks Borrelia sp. DNAs of new genomic group closely related, with. B. afzelii were detected. Firstly DNA of Borrelia sp. with, nontypical structure of intergenical spacer was detected, in D. reticulatus ticks in West Siberia. Meaning of this species of ticks in maintanance of spirochetes of B. burgdorferi sensu lato complex is needed in future study.
Key words: Borrelia sp., ticks, genotypical methods
Основным переносчиком боррелий в природных очагах иксодовых клещевых боррелиозов (ИКБ) на территории Западной Сибири является таежный клещ (Ixodes persulcatus) [1, 2, 14]. Ареал I. persuIcatus охватывает четыре ландшафтных подзоны: южную тайгу, осиново-березовые леса (подтайгу), северную лесостепь и участки южной лесостепи, подвергнутые антропогенной трансформации (хвойно-лиственные посадки). Зараженность основного вида переносчиков боррелий в Западной Сибири по данным микроскопии на различных территориях составляет от 11,9 до 58,0 % [4, 6, 9]. Установлена циркуляция двух гено-видов боррелий — B. afzelii и B. garinii в ЗападноСибирском регионе [3]. Инфицированность I. persuIcatus боррелиями по данным ПЦР на территории подзоны южной тайги составляет 47,4 %, в том числе B. afzelii — 43,9 %, B. garinii — 7,0 %, микстинфицированность боррелиями двух гено-видов выявлена в 3,5 % проб [7]. Лесостепные ландшафты юга Западной Сибири характеризуются наличием двух фоновых видов иксодовых клещей: I. persuIcatus и Dermacentor reticuIatus. Пастбищный клещ D. reticuIatus давно привлекает внимание исследователей, так как нападает на человека и активен не только в начале летнего сезона, но и в августе [5]. Участие этого вида иксодовых клещей в циркуляции возбудителей ИКБ до настоящего времени достоверно не доказано, хотя имеются данные о выявлении BorreIia spp. в клещах рода Dermacentor в Западной и Восточной Сибири [8, 10]. При исследовании клещей D. reticulatus методами иммунофлуоресценции была показана зараженность переносчиков данного вида боррели-ями в 5,8 % случаев [8]. Однако изолировать этих боррелий из клещей D. reticulatus на среде BSK-H не удалось. При исследовании переносчиков методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом полученных ампликонов показано наличие боррелий, близких к B. afzelii в 4,8 % случаев [7]. В последние годы появились новые возможности для генотипирования боррелий как изолированных на питательной среде, так и ампликонов, полученных из переносчиков [7, 13], что существенно расширяет возможности изучения очагов ИКБ.
Целью исследования являлось изучение уровня инфицированности боррелиями иксодовых клещей методами иммунофлуоресценции и ПЦР, с праймерами, соответствующими спейсеру 5S-23S рРНК и с последующим определением нуклеотидной последовательности этого участка из боррелий, полученных путем посева клещей I. persuIcatus на среду BSK-H и обнаруживаемых при микроскопии в клещах I. persulcatus и D. reticulatus.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
На территории Омской, Новосибирской и Томской областей при участии специалистов ЦГСЭН весной 2002 и 2003 гг. было собрано 180 экз. клещей I. persulcatus в зоне северной и южной лесостепи (Тюкалинский и Омский районы) Омской области и в Томском районе Томской области (зона южной тайги). Клещи D. reticulatus (294 клеща) были собраны в зоне южной лесостепи (пригородная зона г. Омска) и зоне северной и южной лесостепи (Новосибирский и Сузунский районы Новосибирской области). Часть клещей исследовали параллельно двумя методами. Первоначально проводилось исследование кишечника клещей на наличие борре-лий в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) с гипериммунной сывороткой кролика, затем клещи исследовались методом ПЦР. Суммарную ДНК из клещей выделяли методом фенольнохлороформной экстракции. Клещей I. persulcatus исследовали в однораундовой ПЦР, клещей других видов — методом гнездовой ПЦР. Амплификацию в однораундовой ПЦР проводили с использованием праймеров к гену р66 и локусу rrfA-rrlB-5'-CTGCGAGTTCGCGGGAGA-3' и 5'-TCCTAGGCATTCACCATA-3' (тест-система производства НПО «Omnix», г. Санкт-Петербург) и в двухраундовой ПЦР — с использованием праймеров, специфичных участкам генов 5S и 23S рРНК. Внешние праймеры: «NC1» (прямой) — 5‘-cctgttatcattccgaacacag-3‘ и «NC2» (обратный) — 5‘-tactccattcggtaatcttggg-3‘ в первом раунде, праймеры второго раунда соответствовали ранее опубликованным [12]. Изоляцию боррелий из клещей
I. persulcatus проводили путем посева суспензии индивидуальных экземпляров на среду BSK-H c добавлением комплекса антибиотиков. Всего было проведено 50 посевов. Получено 8 изолятов: 4 — из клещей, собранных в южной лесостепи, 3 — из клеща из северной лесотепи, 1 — из клеща из южной тайги. Генотипирование проводили на 2 пассаже. Для проведения типирования боррелий в изолятах использовали гнездовую ПЦР с праймерами, соответствующими участкам генов 5S и 23S РНК с последующим определением нуклеотидной последовательности полученного фрагмента ПЦР.
У 236 особей D. reticulatus исследовали кишечник на наличие боррелий в реакции непрямой иммунофлуоресценции (НРИФ) с гипериммунной сывороткой, 58 клещей D. reticulatus исследованы на зараженность возбудителями ИКБ методом ПЦР. Клещи до выделения ДНК хранились в 70o этиловом спирте. Изолировать боррелий из клещей D. reticulatus путем посева на среду BSK-H не удалось.
Определение нуклеотидных последовательностей вариабельных межгенных участков проводилось с использованием набора дидезоксинуклео-тидов Big DyeTM Terminator Kit согласно инструкции изготовителя. Нуклеотидные последовательности анализировали на приборе ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer Applied Biosystems, USA). Сравнение нуклеотидных последовательностей изолятов B. burgdorferi s.l. из D. reticulatus с зарегистрированными в GenBank проведено с использованием метода CLUSTALW (http:// www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании клещей I. persulcatus, собранных в таежной зоне Томской области, методом иммунофлуоресценции уровень инфициро-ванности в среднем составил 26,6 %, методом ПЦР ДНК боррелий выявляли в 51,7 % случаев. Уровень инфицированности боррелиями клещей D. reticulatus, собранных в зоне южной лесостепи Омской области составил 6,7 %. Методом гнездовой ПЦР в клещах D. reticulatus ДНК боррелий выявляли в 18,9 %. Разницу в показателях зараженности можно объяснить более высокой чувствительностью метода ПЦР по сравнению с методом микроскопии. Результаты ПЦР проб ДНК, выделенных из различных видов клещей на территории Западной Сибири представлены в таблице 1.
Изучение геновидового состава изолятов боррелий, полученных на среде BSK-H с применением комплекса генетических методов показало, что все восемь изолятов из клещей I. persulcatus относятся к геногруппе Borrelia garinii NT29, их нуклеотидные последовательности имеют полное генетическое сходство. Последовательности трех из них депонированы в GenBank (AY583238, AY583237, AY583358).
Методом непрямой иммунофлуоресценции с гипериммунной сывороткой кролика и гнездовой ПЦР получены результаты, подтверждающие присутствие ДНК боррелий в голодных имаго D. reticulatus. При иммунофлуоресцентной микроскопии боррелии детектированы в среднем отделе кишечника у 6,7 ± 1,6 % клещей D. reticulatus. Методом гнездовой ПЦР с праймерами, соответствующими участкам генов 5S и 23S рРНК, ДНК боррелий была выявлена в 11 пробах, что составило 18,9 ± 5,3 % от числа исследованных данным методом. Разницу в показателях зараженности можно объяснить более высокой чувствительностью метода гнездовой ПЦР. Для уточнения видо-
вой принадлежности проведено определение нуклеотидных последовательностей межгенного спейсера 5S-23S семи образцов ДНК. Три последовательности депонированы в GenBank (AY540051, AY540052 - Borrelia sp., а AY603350 -Borrelia garinii NT29).
Результаты анализа полученных нуклеотидных последовательностей пяти исследуемых проб ДНК из клещей D. reticulatus, собранных в Омском, Новосибирском и Сузунском районах (лесостепная зона) показали, что они относятся к комплексу Borrelia burgdorferi sensu lato и имеют высокую степень генетического сходства по межгенному спей-серу 5S-23S с пробами ДНК, выделенными от клещей I. ricinus в Нидерландах [11, 13] и на Украине (AF497994). ДНК боррелий с подобной структурой межгенного спейсера 5S-23S была детектирована в изоляте из кожного биоптата пациента с эритемной формой ИКБ [15]. Нуклеотидные последовательности двух исследуемых проб ДНК из клещей D. reticulatus, собранных в Сузунском районе Новосибирской области (лесостепная зона) относятся к подгруппе Borrelia garinii NT29. Нахождение ДНК этих боррелий методом ПЦР позволяет говорить о способности клещей D. reticulatus воспринимать боррелий этой группы, а возможность сохранения и передачи боррелий данным видом иксодид требует дополнительного изучения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, определение нуклеотидных последовательностей межгенного спейсера 5S-23S РНК показало, что в клещах рода Ixodes выявлена ДНК не только широко распространенной генетической группы B. garinii NT29, но и ДНК боррелий генотипа, еще не отнесенного ни к одному из известных геновидов. ДНК боррелий с нетипичной структурой межгенного спейсера в клещах
D. reticulatus на юге Западной Сибири детектирована впервые. Вместе с тем значение клещей этого вида в поддержании циркуляции спирохет комплекса B. burgdorferi s.l. требует дальнейшего изучения. Полученные данные существенно дополняют материалы о видовом разнообразии переносчиков боррелий на территории Западной Сибири.
ЛИТЕРАТУРА
1. Балашов Ю.С. Иксодовые клещи — паразиты и переносчики инфекций / Ю.С. Балашов. — СПб., 1998. - 94 с.
2. Коренберг Э.И. Первые итоги и задачи изучения болезни Лайма в СССР / Э.И. Коренберг,
Таблица 1
Уровни инфицированности клещей боррелиями по данным ПЦР
Административная территория Вид клеща Всего исследовано Обнаружена ДНК боррелий % ± m
Томская область I. persulcatus 68 36 52,9 ± 6,0
Омская область I. persulcatus 33 9 27,3 ± 7,8
D. reticulatus 58 11 18,9 ± 5,1
Новосибирская область D. reticulatus 42 3 7,1 ± 3,9
B.Н. Крючечников, Ю.В. Ковалевский // Вестник АН СССР. - 1990. - №6. - С. 52-57.
3. Коренберг Э.И. Резервуарные хозяева и переносчики боррелий - возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов России / Э.И. Коренберг,
Н.Б. Горелова, Д. Постик // Журн. микробиол., эпи-демиол. и иммунобиол. - 1997. - №6. - С. 36-38.
4. Матущенко А.А. К характеристике природных очагов болезни Лайма в отдельных ландшафтных зонах Западной Сибири / А.А. Матущенко,
C.А. Рудакова // Проблемы клещевых боррелиозов. - Москва, 1993. - С. 133-136.
5. Олсуфьев Н.Г. К экологии лугового клеща Dermacentor pictus Herm., о происхождении его очагов и путях их ликвидации в средней полосе Европейской части РСФСР / Н.Г. Олсуфьев // Вопросы краевой, общей, экспериментальной паразитологии и медицинской зоологии. - М., 1953.
- Т. 8. - С. 49-98.
6. Померанцев Б.И. Фауна СССР. Паукообразные / Б.И. Померанцев. - М.-Л., 1950.
7. Рудакова С.А. Новые данные о генотипиро-вании возбудителей иксодовых клещевых борре-лиозов в Азиатской части России и Казахстане / С.А. Рудакова, Н.В. Рудаков, Н.К. Токаревич и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2002. - Т. 2, №4. - С. 99-101.
8. Рудакова С.А. О возможном участии клещей D. reticulatus в циркуляции боррелий в природных очагах / С.А. Рудакова, А.А. Матущенко / / Тезисы докл. Международ. науч. конференции.
- Иркутск, 1996. - С. 95.
9. Рудакова С.А. Результаты изучения природных очагов клещевого боррелиоза в районах юга
Западной Сибири / С.А. Рудакова, А.А. Матущенко // Природно-очаговые болезни человека. — Омск, 1996. - С. 169-173.
10. Сунцова О.В. Результаты исследования иксодовых клещей на клещевой боррелиоз в Восточной Сибири / О.В. Сунцова, О.З. Горин, Б.В. Шихарбеев и др. // Тезисы докл. Международ. науч. конференции. — Иркутск, 1996. — С. 97.
11. Characterization of Borrelia burgdorferi sensu lato from Novosibirsk Region (West Siberia, Russia) based on direct PCR / N.N. Livanova, O.V. Morozova, I.V. Morozov, A.B. Beklemishev at al. // Europ. J. Epidemiol. — 2003. — Vol. 18, N12. — P. 1155—1158.
12. Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato evidenced by restriction fragment length polymorphism of rrf(5S)-rrl(23S) intergenic spacer amplicons / D. Postic, M.V. Assous, D. Grimont, G. Baranton // Int. J. Syst. Bacteriol. — 1994. — Vol. 44. — Р. 743 — 752.
13. Genetic variability within Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies established by PCR-strand conformation polymorphism analysis of the rrlA-rrlB intergenic spacer in Ixodes ricinus ticks from the Czech republic / M. Derdakova, L. Beati, B. Petko, M. Stanko et al. // Appl. Environ. Microbiol. — 2003.
— Vol. 69, N 1. — P. 509 — 516.
14. Korenberg E.I. Lyme Borreliosis: Biology, Epidemiology and Control / E.I. Korenberg // eds. J. Gray et al. — Oxford, 2002.
15. Phenotypic and genetic characterization of a novel Borrelia burgdorferi sensu lato isolate from a patient with Lyme Borreliosis / G. Wang, A. van Dam,
I. Schwartz, J. Dankert // J. Clin. Microbiol. — 1999.
— Vol. 37, N 9. — P. 3025 — 3028.
