CC BY
444
обзоры
Генная и клеточная терапия заболеваний сетчатки глаза
В.В. Максимов 1, М.А. Лагарькова 1, СЛ. Киселев 1 2 1 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва 2Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва
Gene and cell therapy of retinal diseases
V.V. Maximov1, M.A. Lagarkova 1, S.L. Kiselev12
1 Vavilov Institute of General Genetics of RAS, Moscow
2 National Research Centre «Kurchatov Institute», Moscow
Генная и клеточная терапия заболеваний — это тесно взаимосвязанные и быстро развивающиеся области биомедицины, целью которых является разработка методов лечения заболеваний, в основе которых лежат генетические дефекты и(или) гибель определённых клеточных типов. В этом обзоре проанализировано современное состояние методов генной и клеточной терапии заболеваний сетчатки глаза. Особое внимание уделено развитию генно-терапевтических подходов к лечению 2-й формы врождённого амавроза Лебера и других заболеваний сетчатки, а также сравнению терапевтического потенциала плюрипотентных стволовых клеток и стволовых клеток сетчатки глаза взрослого человека. Терапевтический потенциал плюрипотентных клеток представляется предпочтительней вследствие их способности к неограниченной экспансии и органогенезу.
Ключевые слова: генная терапия, клеточная терапия, врождённый амавроз Лебера, плюрипотентные стволовые клетки.
Gene and cell therapy are tightly associated and quickly developing areas of biomedicine, which purpose is development of methods to cure diseases caused by genetic defects and/or death of certain cell types. Current state of methods of retinal diseases gene and cell therapy is analyzed in this review. We reviewed development of gene therapeutic approaches to treatment of the 2-nd form of Leber’s congenital amaurosis and other retinal diseases. We also compared therapeutic potential of pluripotent stem cells and human adult retinal stem cells. Therapeutic potential of pluripotent stem cells seems to be better due to their ability for unlimited expansion and organogenesis.
Key words: gene therapy, cell therapy, Leber's congenital amaurosis, retinal disease, pluripotent stem cells.
История генной терапии началась в 80-х годах прошлого века. Ее развитие сопровождали как значительные успехи, так и целый ряд неудач, связанных с низкой эффективностью генетических векторов и их побочным действием.
Мишенями для генной терапии, скорее всего, станут заболевания, связанные с утратой функции из-за дефекта в конкретном гене или генах. Как правило, такие заболевания являются наследственными. Ряд заболеваний, связанных с гибелью определённых клеточных типов, будут, скорее всего, требовать применения методов клеточной терапии. В ее основе лежит использование клеток, выращенных вне организма, для последующей трансплантации. Клеточная терапия начала интенсивно развиваться лишь в последние десять лет, однако, уже достигла определенных успехов. В недалеком будущем генная и клеточная терапии будут использоваться в комбинации для достижения максимального эффекта. Основные проблемы, сдерживающие сегодня развитие этих двух видов терапии, — ограниченная возможность мониторинга генов или клеток, доставленных в организм, для обеспечения максимальной безопасности и оценка эффективности выбранных подходов.
e-mail: [email protected]
Выбор заболеваний, допускающих такой мониторинг, имеет первостепенное значение для применения разработанных терапевтических подходов. За последние годы значительно возросло число исследований, связанных с генной и клеточной терапией патологии органов зрения. Разработан целый ряд малоинвазивных технологий, которые обеспечивают наблюдение и оценку восстановления зрительной функции.
Существует множество заболеваний, связанных с возрастной или с генетически обусловленной потерей зрения и не имеющих эффективного медикаментозного лечения. Разработка методов генной и клеточной терапии заболеваний глаз, таким образом, очень актуальна и востребована.
Вобзоренами рассмотреныгенно-терапевтические подходы к лечению заболеваний сетчатки глаза, которые находятся на стадии доклинических или клинических исследований. В частности, наиболее разработанный метод генной терапии врождённого амавроза Лебера. В той части обзора, которая посвящена клеточной терапии заболеваний сетчатки глаза, мы сравнили терапевтический потенциал плю-рипотентных стволовых клеток и стволовых клеток
сетчатки глаза взрослых. Мы уделили особое внимание трансплантации клеток пигментного эпителия сетчатки глаза, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, поскольку это первый метод клеточной терапии на основе плюрипотентных стволовых клеток человека, который достиг стадии клинических исследований.
Генная терапия
врождённого амавроза Лебера
Врождённый амавроз Лебера — это наследственное заболевание с поражением сетчатки глаза, которое возникает сразу или в первые месяцы после рождения, встречающееся, по разным данным, с частотой приблизительно 1:81 000 или 33 000 рождённых детей [1, 2]. Доля этой патологии составляет более 5% от всех наследственных заболеваний сетчатки. Заболевание, как правило, приводит к серьёзной потере зрения вплоть до полной слепоты. Характерным признаком врождённого амавроза Лебера является не детектируемая или очень слабая электрорети-нограмма. Кроме того, обычно наблюдаются нистагмы, амавротический (не реагирующий на свет) зрачок и пигментная ретинопатия [1]. Врождённый амавроз Лебера наследуется преимущественно по аутосомно-рецессивному типу; известно 15 генов и локусов, мутации в которых вызывают данную болезнь [3]. Таким образом, врождённый амавроз Лебера — это гетерогенная группа клинически сходных заболеваний сетчатки глаза. Врождённый амавроз Лебера 2-го типа обусловлен мутациями в гене RPE65 и составляет 6—8% всех случаев врождённого амавроза Лебера [2, 3]. Особенностью этого наследственного заболевания является то, что болезнь не носит системного характера и страдает только сетчатка. Последнее обстоятельство, а также то, что врождённый амавроз Лебера — это, в подавляющем большинстве случаев, моногенное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования, сделало возможным использование генной терапии для его лечения. Другим важным фактором, определяющим использование генной терапии для лечения 2-го типа врождённого амавроза Лебера, является длительное сохранение структуры сетчатки при существенной потере её функции [2]. Таким образом, в сетчатке больного длительное время остаются все необходимые для зрения типы клеток, функцию которых можно восстановить, доставив функциональный вариант повреждённого гена RPE65.
Успешно развивается генно-терапевтический подход, заключающийся во введении в клетки сетчатки глаза функционального гена RPE65 с помощью адено-ассоциированного вирусного вектора. Адено-ассоциированный вирус (ААВ) представляет собой одноцепочечную ДНК размером 4—5 тыс. нуклеотидов, заключённую в белковую капсулу с 8 известными серотипами: AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 и AAV9 [4]. После проникновения в клеточное ядро и образования двухцепочечной формы вирусной ДНК ААВ для репликации нужны либо один из вирусов-помощников (аденовирус, вирус простого герпеса, вирус вакцинии или вирус папилломы человека), либо клеточный стресс. В отсутствии этих факторов вирусная двухцепочечная ДНК ААВ долгое время сохраняется в инфицированной клетке в виде эписомы или интегрирует в геном [4]. Важно отметить, что вирусная ДНК ААВ интегрирует исклю-
чительно в строго определённый участок области q13.4 хромосомы 19 человека [5, 6]. Уникальная специфичность интеграции ААВ делает его одним из самых безопасных векторов для генной терапии. Относительным недостатком этого вектора является его маленькая ёмкость. ААВ способен нести не более 4,4—4,7 тыс. нуклеотидов, а само-комплементарная форма ААВ с улучшенной эффективностью образования двуцепочечной формы имеет вдвое меньшую ёмкость [4]. Таким образом, ААВ векторы подходят только для доставки относительно небольших генов. Размер транслируемого участка гена RPE65 человека составляет всего 1599 нуклеотидов, что делает возможным его доставку с помощью ААВ.
Первое успешное доклиническое испытание генной терапии врождённого амавроза Лебера 2-го типа с использованием ААВ вектора, несущего функциональный ген RPE65, было проведено на собаках [7]. Для экспериментов использовали собак породы бри-ар с естественно возникшей наследственной ретинопатией, вызванной 4-нуклеотидной делецией в гене RPE65 [8]. Исследователи наблюдали практически полное восстановление зрения после однократной субретинальной инъекции ААВ вектора с функциональным геном RPE65 [7]. Высокая эффективность этого метода генной терапии для лечения 2-го типа врождённого амавроза Лебера у той же породы собак была позднее подтверждена как теми же, так и другими исследователями [9—11]. K. Narfstróm с соавт. (2003) отметили один побочный эффект — воспаления сосудистой оболочки глазного яблока в 75% случаев [9, 10]. Позднее эта модель 2-го типа врождённого амавроза Лебера была использована, чтобы определить оптимальное количество вируса для проведения клинических исследований безопасности и эффективности [12].
Эксперименты по генной терапии врождённого амавроза Лебера были проведены и на мышиной модели, однако, результаты были не столь однозначными [13—15]. Одна из групп не добилась никакого терапевтического эффекта, кроме небольшого и временного увеличения максимальной амплитуды b-волн [13]. Другая группа исследователей достигла значительного терапевтического эффекта — появления электроретинограммы и улучшения остроты зрения у 40-80% мышей [14, 15]. В недавних публикациях отмечено, что, наряду с фоторецепторами-палочками, происходит восстановление функции фоторецепторов-колбочек, если генную терапию начать до их дегенерации [16, 17].
Доклинические испытания безопасности генной терапии, использующей субретинальную инъекцию ААВ вектора с геном RPE65, были также проведены на здоровых обезьянах Macaca fascicularis. Никаких побочных эффектов, кроме кратковременного (неделя и меньше) небольшого воспаления, связанного с инъекцией в субретинальную область или стекловидное тело, обнаружено не было [18].
В связи с многообещающими результатами, полученными на экспериментальных моделях, 3 независимые группы ученых начали клинические исследования генной терапии 2-го типа врождённого амавроза Лебера с использованием ААВ вектора, несущего функциональный ген RPE65 [19—22]. Основной целью их первого этапа является доказательство безопасности выбранного метода терапии. Никаких системных токсических эффектов или следов иммунного ответа,
которые могли быть вызваны использованием ААВ-RPE65 вируса, в этих исследованиях обнаружено не было. Осложнения были связаны с самой процедурой субретинальной инъекции. Так, в результате ее выполнения осталась повреждённой центральная часть сетчатки одного из трёх пациентов в одном из исследований, которая, впрочем, не помешала некоторому улучшению зрения этого пациента даже в условиях слабого освещения [20]. В другой группе у одного из 3 пациентов обнаружили истончение центральной ямки макулы [21]. Эти данные говорят о важности выбора точного места для субретинальной инъекции, оптимального с точки зрения безопасности и эффективности процедуры [21].
Несмотря на то, что начальный этап клинических исследований был нацелен на проверку безопасности процедуры, наблюдали также положительное воздействие на зрение пациентов. Две группы исследователей отметили улучшение зрения в условиях слабого освещения у всех пациентов [20, 21], а одна из этих групп подтвердила данное наблюдение с помощью теста на световую чувствительность после темновой адаптации [21]. Третья группа врачей зафиксировала достоверное увеличение световой чувствительности после темновой адаптации только у одного из трёх пациентов [19]. Необходимо отметить, что сравнение эффективности генной терапии в разных клинических исследованиях затруднено тем, что использовались различные генетические конструкции и, на момент проведения этих клинических испытаний, методы определения титра ААВ не были стандартизованы. Для экспрессии гена ИРЕВ5 в составе вектора были использованы различные регуляторные элементы: промотор RPE65 [19], промотор куриного р-актина [20] и гибридный промотор, состоящий из цитомега-ловирусного раннего энхансера и промотора куриного Р-актина, включающего 1-й экзон и часть 1-го интро-на [12, 21]. Относительную силу и специфичность этих промоторов никогда не сравнивали. Проблема стандартизации определения титра ААВ 2-го серотипа в настоящее время решена [23].
Одна из исследовательских групп провела более детальное изучение восстановления функции фоторецепторов после генной терапии. А^. Ме^уап с соавт. (2008) сравнили световую чувствительность фоторецепторов в месте инъекции со световой чувствительностью фоторецепторов в остальной сетчатке и обнаружили, что светочувствительность фоторецепторов-колбочек увеличивается до 50 раз, светочувствительность фоторецепторов-палочек — до 63 тыс. раз. Исследователи пришли к выводу, что возможно почти полное восстановление зрительной функции, если распространить терапевтическое воздействие на всю сетчатку глаза [22]. Таким образом, требуется решение проблемы равномерной доставки терапевтического вирусного вектора по всей площади сетчатки.
Дальнейшие наблюдения за пациентами подтвердили долговременную безопасность и длительное сохранение терапевтического эффекта, а у одного из больных даже наблюдалось дополнительное улучшение светочувствительности через год после применения генной терапии [24—26]. На следующем этапе клинических исследований, нацеленном на подбор оптимальной терапевтической дозы ААВ-RPE65, были получены ещё более обнадёживающие результаты: наблюдалось стабильное улучшение по
всем критериям, в том числе электроретинограмме и остроте зрения у ряда пациентов [27, 28]. Было также проведено клиническое исследование повторного применения генной терапии во 2-м, ранее не леченом глазу [29]. Ожидалось, что первичное введение вируса может привести к снижению безопасности и эффективности лечения вследствие предполагаемого усиления иммунного ответа на вирус после первоначального введения терапевтического вектора. Однако было показано, что повторная генная терапия имеет такую же безопасность и эффективность, как и первая [29].
В настоящее время проходят 8 клинических исследований генной терапии врождённого амавроза Лебера 2-го типа при помощи ААВ вектора несущего функциональный ген ИРЕВ5 [30]. Несмотря на то, что все клинические испытания находятся на 1/2 фазах, можно ожидать более широкого использования этого метода генной терапии в обозримом будущем.
Генная терапия других заболеваний сетчатки
глаза, находящаяся на стадии клинических
испытаний
В США проходит клиническое исследование генная терапия неоваскулярной формы возрастной дегенерации макулы сетчатки глаза с помощью адено-ассоциированного вируса AAV2-sFLT01 [30]. Химерный рекомбинантный белок sFLT01 является растворимым рецептором сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), который связывает и ингибирует действие ростового фактора, препятствуя тем самым избыточной пролиферации и росту кровеносных сосудов [31]. Вирус инъецируется в стекловидное тело, что технически проще субрети-нальной инъекции. Эффективность и безопасность данного геннотерапевтического метода были предварительно продемонстрированы на животных моделях [31—33].
Ранее в США уже проходило клиническое исследование генной терапии неоваскулярной формы возрастной дегенерации макулы сетчатки глаза аденовирусным вектором AdGVPEDF.11D, несущим ген pedf [30, 34]. PEDF — сильный естественный ингибитор ангиогенеза в сосудистой оболочке глаза [35]. Инъекции так же, как и в предыдущем случае, были произведены в стекловидное тело. Эффективность метода была предварительно продемонстрирована на животных моделях [36—40]. Результаты клинических исследований AdGVPEDF.11D были очень обнадёживающими, и из них можно было сделать вывод о существенном анти-ангиогенном эффекте при дозах выше 108 вирусных частиц [34]. Это обеспечило доказательство принципиальной возможности данного подхода. Однако принципиальным отличием аденовирусного вектора от ААВ является то, что аденовирус не интегрирует в геном и через некоторое время теряется клеткой. С одной стороны, это повышает безопасность геннотерапевтического воздействия, но небольшая продолжительность экспрессии аденовирусных векторов ограничивает практическое применение этого метода.
Другое клиническое исследование генной терапии хориоидермии (прогрессирующей атрофии сосудистой оболочки глаза) с использованием ААВ вектора гAAV2.REP1 проходит в Великобритании [30]. Хориоидермия — это наследственное Х-сцепленное рецессивное заболевание, вызванное мутациями
в гене CHM/REP-1 или его делецией, ведущее к постепенной дегенерации сосудистой оболочки и сетчатки глаза и встречающееся с частотой 1:50000 человек[41]. Клиническое исследование, очевидно, ставит целью остановить прогрессирование заболевания, доставив функциональный ген REP-1 в соответствующий тип клеток глаза. Однако в этом случае удивляет полное отсутствие опубликованных данных по доклиническим исследованиям.
Следует отметить, что 2-я форма врождённого амавроза Лебера встречается с частотой один на один миллион, в то время как хориоидермия встречается в 20 раз чаще, а возрастная дегенерация макулы сетчатки глаза является причиной примерно 47% всех случаев слепоты и 20% всех случаев слабого зрения в США среди населения старше 40 лет, что составляет ориентировочно 420— 430 тыс. и 480 тысяч населения, соответственно [42]. Таким образом, несмотря на впечатляющие успехи в генной терапии 2-й формы врождённого амавроза Лебера, генная терапия хориоидермии и возрастной дегенерации макулы сетчатки глаза имеет большее практическое значение, хотя в последнем случае необходимо оценить преимущество генной терапии по сравнению с другими методами лечения.
Клеточная терапия заболеваний
сетчатки глаза
Для заболеваний сетчатки глаза, вызванных гибелью каких-либо клеточных типов, разработка методов получения и трансплантации этих клеток, т.е. клеточной терапии, является на сегодняшний день наиболее реалистичным подходом к поиску способов лечения таких заболеваний. В качестве источника клеток сетчатки можно использовать как стволовые клетки сетчатки глаза взрослых, так и дифференцированные производные плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК)).
Клинический потенциал стволовых клеток
сетчатки глаза взрослых
Первые работы, в которых были получены стволовые клетки сетчатки глаза млекопитающих, были опубликованы в 2000 г. двумя независимыми научными группами [43, 44]. В обоих случаях самообновляющиеся мультипотентные клетки были найдены в цилиарном теле глаза мыши [43] и крысы [44]. У мышей было продемонстрировано отсутствие стволовых клеток в центральной и периферической областях пигментного эпителия сетчатки [43]. Стволовые клетки сетчатки глаза были также выделены из кадаверной сетчатки глаза тремя независимыми группами [45—49]. Любопытно, что одна из групп нашла стволовые клетки сетчатки глаза человека не только в цилиарном теле, но и в самой сетчатке, хотя в центральной области сетчатки их оказалось меньше, чем на периферии [46]. Другая группа обнаружила их исключительно в цилиарном теле [45]. Было также показано, что стволовые клетки сетчатки человека находятся в популяции Сй133+-кпеток сетчатки [49]. Эти клетки можно было короткое время поддерживать в недифференцированном состоянии при добавлении LIF. Важно отметить, что не было получено доказательств возможности их неограниченного культивирования и экспансии in vitro. Напротив, показано, что потенциал самообновления стволовых
клеток сетчатки глаза взрослого человека падает при продолжительном культивировании in vitro, предположительно, из-за увеличения доли ассиметричных делений [47]. Ограничения, связанные с долговременным культивированием и экспансией стволовых клеток сетчатки глаза взрослого человека, делают их использование в клинике непрактичным в настоящее время, т.к. кадаверная сетчатка глаза малодоступна.
Другими проблемами, возникающими при рассмотрении возможности использования любых стволовых клеток для клеточной терапии сетчатки глаза, являются их способность дифференцироваться в функциональные клеточные типы сетчатки глаза и способность полученных клеточных типов правильно интегрироваться в сетчатку после трансплантации. В большинстве первоначальных экспериментов мультипотентность стволовых клеток сетчатки глаза взрослого организма доказывалась наличием в полученных из них нейросферах клеток, экспрессирующих маркеры различных клеточных типов сетчатки [43, 44, 46—49]. Важно отметить, что экспрессия отдельных маркеров зрелых фоторецепторов не свидетельствует об их функциональности [50]. Тем не менее, в одной из работ была изучена способность стволовых клеток сетчатки глаза человека встраиваться в сетчатку глаза им-мунодефицитной мыши на 1-й постнатальный день и в эмбриональную сетчатку глаза курицы после инъекции в стекловидное тело глаза. Выбор ранней постнатальной и эмбриональной сетчатки глаза был обусловлен относительно высокой эффективностью интеграции трансплантированных клеток в сетчатку на этой стадии её развития. В этих экспериментах была показана способность стволовых клеток сетчатки глаза взрослого человека интегрироваться в сетчатку модельного организма и формировать некоторые клеточные типы, такие как фоторецепторы и, реже, клетки Мюллера. Функциональность полученных клеток не была проверена [45]. В этой связи интересна работа T. Inoue с соавт. (2010), которая доказала функциональность фоторецепторов, возникших в результате интеграции и дифференциров-ки стволовых клеток сетчатки взрослого человека в сетчатку глаза мыши с инактивированным геном трансдуцина. Фоторецепторы-палочки такой мыши не гибнут, но они абсолютно не функциональны; эта модель позволяет проверить интеграцию и функциональность трансплантированных фоторецепторов. При вспышках света низкой интенсивности на рети-ноэлектрограмме мышей с трансплантированными фоторецепторами можно было видеть b-волны, свидетельствующие об активности биполярных клеток, со значительно большей амплитудой, чем у мышей, не подвергшихся трансплантации. Это подтвердило функциональность фоторецепторов-палочек человека и их способность образовывать функциональные контакты с биполярными клетками мыши [51]. Другой интересной особенностью этой работы было использование трансдукции человеческих взрослых стволовых клеток сетчатки лентивирусами, несущими химерный ген chx10vp16 (ген chx10, слитый с геном транскрипционного активационного домена vp16) и гены otx2 и crx, чтобы направить дифферен-цировку этих клеток в сторону фоторецепторов. Стволовые клетки сетчатки человека, трансдуцированные контрольным вирусом, интегрировали в сетчатку
мыши существенно хуже и имели амплитуду b-волн при низких интенсивностях световых вспышек даже меньше, чем мыши без трансплантации, что, вероятно, связано с повреждениями сетчатки при трансплантации [51]. Подход, связанный с переносом генов с целью повышения эффективности диффе-ренцировки, не выглядит более опасным, чем генная терапия в целом и может оказаться перспективным в будущем.
Интересными также являются работы, доказывающие возможность получения функциональных фоторецепторов из стволовых клеток сетчатки глаза взрослого человека in vitro. В них также использовался перенос генов для повышения эффективности дифференцировки в фоторецепторы in vitro. В этом случае использовался ген crx. Функциональные фоторецепторы были получены из стволовых клеток сетчатки глаза взрослой мыши [52] и взрослого человека [53]. Функциональность фоторецепторов была показана через свето-индуцированное расщепление циклического ГМФ [52, 53]. Стоит отметить, что стволовые клетки роговицы глаза взрослого человека не удалось дифференцировать в функциональные фоторецепторы, несмотря на перенос гена crx, хотя и удалось добиться экспрессии маркеров зрелых фоторецепторов, включая родопсин и голубой опсин [53]. Это указывает на существенные отличия в потенциале дифференцировки стволовых клеток роговицы и сетчатки глаза взрослого человека и лишний раз подчёркивает, что экспрессия маркеров зрелых фоторецепторов не гарантирует функциональности полученных фоторецепторов. В целом стволовые клетки сетчатки глаза взрослого организма несут достаточный потенциал дифферен-цировки для их использования в клеточной терапии заболеваний сетчатки глаза. Единственное, но очень серьёзное ограничение связано с отсутствием методов, которые позволили бы культивировать эти клетки долгое время и нарабатывать в больших количествах.
Клинический потенциал плюрипотентных
стволовых клеток человека
Плюрипотентные стволовые клетки человека, которые включают в себя ЭСК и иПСК, способны к дифференцировке в любые клетки организма и, как следствие, имеют огромный потенциал для терапии всех заболеваний, связанных с потерей или дисфункцией определённых клеточных типов. Первые ЭСК млекопитающих были получены 31 год назад из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты [54, 55]. ЭСК человека были получены значительно позднее из бластоцист, невостребованных при экстракорпоральном оплодотворении [56]. Эти клетки обладают свойством плюрипотентности — то есть, способностью к дифференцировке во все три зародышевых листка,. Плюрипотентность ЭСК мыши была полностью доказана методом тетрапло-идной комплементации [57]. ЭСК человека оказались способными к практически неограниченным культивированию и экспансии с сохранением нормального кариотипа и плюрипотентности [56], что даёт им серьёзное преимущество по сравнению со стволовыми клетками взрослого организма с точки зрения использования в клинике. Сравнительно недавно была продемонстрирована возможность перепрограммировать соматические клетки мыши
и человека в плюрипотентное состояние с помощью эктопической экспрессии генов oct 3/4, sox2, klf4 и c-myc или oct 3/4, sox2, nanog и lin28. Полученные плюрипотентные клетки по всем признакам очень схожи с ЭСК из соответствующих видов и были названы иПСК [58—60]. иПСК можно получить при необходимости для каждого человека из фибробла-стов кожи или лимфоцитов, что позволит проводить клеточную терапию генетически идентичными клетками и снижает вероятность иммунного ответа на трансплантированные клетки.
Для того чтобы получить терапевтически пригодные для трансплантации клетки, ведутся интенсивные разработки протоколов дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в специализированные типы клеток. Многочисленные независимые научные группы опубликовали способы получения предшественников и зрелых типов клеток сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток животных и человека [61—70]. В большинстве работ получение зрелых клеточных типов сетчатки подтверждали экспрессией соответствующих маркеров. Как уже отмечалось выше, в случае фоторецепторов экспрессия их отдельных маркеров не свидетельствует о функциональности этих фоторецепторов [50, 53]. Только одна группа продемонстрировала возможность получения функциональных фоторецепторов из плюрипотентных стволовых клеток человека и принципиальную возможность их использования для лечения заболеваний сетчатки. D.A. Lamba с соавт. (2009) субретинально инъецировали полученные из ЭСК человека клетки сетчатки в сетчатку 4—6 недельных мышей с гомозиготно инактивированным геном crx. Эти мыши представляют собой модель врождённого амавроза Лебера и, соответственно, не имеют детектируемой ретиноэлектрограммы. Трансплантация клеток сетчатки, полученных из ЭСК человека, приводила к появлению b-волн на ретиноэлектрограмме, что свидетельствовало о появлении функциональных фоторецепторов, образовавших правильные контакты с биполярными клетками [63].
Отдельно следует отметить работы, в которых была продемонстрирована возможность получения глазного пузыря или даже глазного бокала из плю-рипотентных стволовых клеток [69, 71—74], что есть не что иное, как способность плюрипотентных клеток (в том числе — плюрипотентных клеток человека) к органогенезу. Способность к органогенезу уникальна для плюрипотентных стволовых клеток и даёт им несомненное преимущество перед стволовыми клетками сетчатки глаза взрослых. Формирование многослойной сетчатки в глазном бокале открывает возможность использовать эту сетчатку для целей трансплантации. Трансплантация сетчатки обладает рядом преимуществ по сравнению с трансплантацией одиночных клеток или клеточных агрегатов: 1) все типы клеток после трансплантации будут находиться в правильной пространственной ориентации; 2) трансплантация возможна при практически полной дегенерации сетчатки; 3) не возникает проблем с интеграцией трансплантированных клеток в сетчатку; 4) наиболее эффективный тип трансплантации с точки зрения восстановления зрения; 5) вызывает существенно меньший иммунный ответ, чем трансплантация одиночных клеток. До сих пор для целей трансплантации использовалась сетчатка глаза из
абортивного материала, которая доступна в ограниченном количестве [75]. Использование сетчатки, полученной из плюрипотентных стволовых клеток, может решить проблему ограниченности донорской сетчатки и, тем самым, ускорить развитие методов ее трансплантации. Это направление выглядит наиболее перспективным в настоящее время, хотя оно довольно далеко от своего практического осуществления. Справедливости ради, следует отметить риск образования тератом, как возможный побочный эффект клеточной терапии с использованием плюрипотентных стволовых клеток. Действительно, образование тератом наблюдали при трансплантации предшественников клеток сетчатки, полученных из ЭСК обезьян и человека, в глаз мыши [67, 76], что свидетельствует о наличии в препаратах трансплантируемых клеток недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток. Проблема, связанная с риском образования тератом, будет, скорее всего, надёжно решена увеличением продолжительности дифференцировки и, возможно, сортировкой клеток. Действительно, увеличение продолжительности дифференцировки в одной из работ привело к тому, что опухоли перестали возникать после трансплантации [76]. На сегодняшний день нет серьёзных оснований считать, что эта проблема может значительно повлиять на развитие методов клеточной терапии, связанных с использованием плюрипотентных стволовых клеток.
Подход, связанный с трансплантацией пигментного эпителия сетчатки, полученного из ЭСК человека, уже дошёл до стадии клинических исследований [77]. Пигментный эпителий сетчатки (рис.) может быть легко получен при направленной дифферен-цировке ЭСК человека и отобран на основании морфологических критериев и накопления коричневых гранул пигмента [78]. В отличие от фоторецепторов, проблем с функциональностью пигментного эпителия сетчатки, по-видимому, не возникает. Предварительно были проведены экспериментальные исследования по трансплантации пигментного эпителия сетчатки, полученного из ЭСК человека, в сетчатку глаза крыс RSC (Royal College of Surgeons) и мышей
с фоторецептор-специфической сверхэкспрессией мутантного гена elovl4 [79, 80]. Для предотвращения иммунного отторжения пересаженных клеток использовали иммуносупрессанты. Безопасность трансплантации была подтверждена на всех моделях, в том числе и на иммуннодефицитных мышах, использованных специально для того, чтобы проверить вероятность возникновения опухолей при трансплантации. Были также показаны интеграция и долговременное выживание трансплантированных клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из ЭСК человека, в сетчатке глаза модельных животных. Наиболее выраженный и долговременный терапевтический эффект, заключающийся в предотвращении дегенерации фоторецепторов и ухудшения зрения, был продемонстрирован на крысах RSC [79, 80]. Крысы RSC несут мутацию в гене те^к, приводящую к неспособности клеток пигментного эпителия фагоцитировать сброшенные фрагменты внешних сегментов фоторецепторов, и, как следствие, к гибели фоторецепторов и потере зрения [81]. Это значит, что дефект, ведущий к потере зрения в крысах RSC, локализован специфически в клетках пигментного эпителия сетчатки. Таким образом, успех клеточной терапии, которая заключается в трансплантации полученных из ЭСК человека клеток пигментного эпителия сетчатки в сетчатку больного глаза крыс RSC, служит хорошим подтверждением принципиальной возможности такой терапии.
Гораздо сложнее обстоят дела в случае мыши с фоторецептор-специфической сверхэкспрессией мутантного гена е^14 [82]. Это модель редкой атусомно-доминантной формы болезни Штаргардта. Болезнь Штаргардта — наследственное заболевание, приводящее к дегенерации макулы сетчатки глаза и потере центрального зрения, и встречающееся с частотой 1 на 8—10 тыс. человек. От «сухой» формы возрастной дегенерации макулы сетчатки это заболевание отличается, главным образом, возрастом, в котором оно проявляется. При болезни Штаргардта первые признаки дегенерации макулы сетчатки проявляются на первом-втором десятилетиях жизни. Заметная потеря центрального зрения может отставать еще на несколько десятилетий. В подавляющем большинстве случаев заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу и связано, в основном, с мутациями в гене аЬсг (другое название гена — аЬса4). Мутации в этом гене влияют на зрительный цикл (цикл витамина А), а именно — приводят к ухудшению эффективности транспорта ^ретинил-фосфатидилэтаноламина за пределы дисков внешних сегментов фоторецепторов-палочек. Это приводит к повышению концентрации ^ретинил-фосфатидилэтаноламина в дисках внешних сегментов фоторецепторов-палочек и к возрастанию вероятности присоединения 2-й молекулы транс-ретинальдегида с образованием молекулы А2РЕ. После фагоцитирования внешних сегментов фоторецепторов клетками пигментного эпителия сетчатки молекула А2РЕ превращается в неметаболизируемый токсин А2Е и его производные. А2Е и его производные являются основными компонентами липофусциновых гранул, которые накапливаются в сетчатке пациентов с болезнью Штаргардта или с сухой формой возрастной дегенерации макулы сетчатки. Эти токсины вызывают дегенерацию пигментного эпителия и последующую гибель фоторецепторов макулы сетчатки, сопровождающуюся
Пигментный эпителий сетчатки, полученный из эмбриональных стволовых клеток человека: гексагональные клетки, образующие плотные межклеточные контакты. Фазовый контраст. Масштабная линейка - 100 мкм
потерей центрального зрения [83]. Таким образом, хотя клетки пигментного эпителия сетчатки гибнут первыми, дефект, вызывающий заболевание, локализован в фоторецепторах. В связи с этим, настораживает, что были предоставлены данные только по кратковременному, хотя и значительному, терапевтическому эффекту трансплантации клеток пигментного эпителия в сетчатку глаза мышей с фоторецептор-специфической сверхэкспрессией мутантного гена evovl4 [80]. Основываясь на механизмах заболевания, можно предположить, что со временем пересаженный пигментный эпителий тоже гибнет и терапевтический эффект пропадает.
В ходе проводимых компанией «Advanced Cell Technology» клинических исследований, которые начались в США в прошлом году, 50 тыс. клеток пигментного эпителия, полученных из человеческих ЭСК человека, вводили субретинально в тщательно выбранные области макулы сетчатки 2 пациентам. У одного пациента была «сухая» форма возрастной дегенерации макулы сетчатки, у другого — болезнь Штаргардта. Первые результаты были опубликованы по итогам первых 4-х послеоперационных месяцев. Доказательства интеграции пересаженных клеток пигментного эпителия были получены только для пациента с болезнью Штаргардта. Второй пациент не проявил пунктуальность в приёме иммунносупрес-санта, концентрация которого в крови падала ниже терапевтического уровня, с чем, возможно, связана худшая интеграция трансплантированных клеток. Тем не менее, улучшение зрения в прооперированном глазу было отмечено у обоих пациентов. Несмотря на это, исследователи считают, что нельзя с уверенностью утверждать, связано ли это улучшение зрения с клеточной терапией или с использованием иммун-носупрессантов, или это эффект плацебо. Никаких осложнений ни у одного из пациентов по истечении 4 мес. не наблюдалось [77]. Таким образом, результаты первого использования дифференцированных производных человеческих плюрипотентных клеток в клинике обнадёживают. Тем не менее, целью данного метода клеточной терапии является не полное
излечение заболевания, а только поддержание функционирования не деградировавших фоторецепторов на ранних этапах заболевания. Кроме того, исходя из механизмов заболевания, можно предвидеть, что терапевтический эффект будет носить относительно кратковременный характер.
Заключение
Методы генной и клеточной терапии заболеваний, ведущих к дегенерации сетчатки глаза, развиваются на протяжении последних полутора-двух десятилетий. Некоторые из этих методов находятся на стадии клинических исследований. В ряде тяжёлых, в том числе наследственных, заболеваний сетчатки глаза, таких, как возрастная дегенерация макулы сетчатки глаза, болезнь Штаргардта, хориоидермия и врождённый амавроз Лебера, методы генной и/или клеточной терапии являются наиболее перспективными способами лечения.
Для клеточной терапии заболеваний сетчатки использование плюрипотентных стволовых клеток человека имеет преимущества перед использованием взрослых стволовых клеток сетчатки глаза. Плюри-потентные стволовые клетки человека, в отличие от стволовых клеток сетчатки глаза взрослого организма, способны к неограниченному делению с сохранением своих свойств. Кроме того, плюрипотентные стволовые клетки имеют уникальную способность к органогенезу in vitro [72, 74], что даёт потенциальную возможность получать сетчатку для трансплантации, как ткань, на любом этапе её созревания.
Появления первых методов генной и(или) клеточной терапии в офтальмологической практике можно ожидать уже в этом десятилетии. Полное же раскрытие потенциала этих подходов приведёт к появлению методов лечения целого спектра раннее неизлечимых заболеваний сетчатки глаза.
Благодарности
Работа финансировалась государственным контрактом с Министерством образования и науки Российской Федерации № 16.512.11.2159.
ЛИТЕРАТУРА
1. Koenekoop R.K. An overview of Leber congenital amaurosis: a model to understand human retinal development. Surv. Ophthalmol. 2004; 49(4): 379-98.
2. Stone E.M. Leber congenital amaurosis — a model for efficient genetic testing of heterogeneous disorders: LXIV Edward Jackson Memorial Lecture. Am. J. Ophthalmol. 2007; 144(6): 791—811.
3. Chung D.C., Traboulsi E.I. Leber congenital amaurosis: clinical correlations with genotypes, gene therapy trials update, and future directions. AAPOS 2009; 13(6): 587—92.
4. Grieger J.C., Samulski R.J. Adeno-associated virus vectorology, manufacturing, and clinical applications. Methods Enzymol. 2012; 507: 229—54.
5. Kotin R.M., Siniscalco M., Samulski R.J. et al. Site-specific integration by adeno-associated virus. PNAS USA 1990; 87(6): 2211—15.
6. Samulski R.J., Zhu X., Xiao X. et al. Targeted integration of adeno-associated virus (AAV) into human chromosome 19. EMBO 1991; 10(12): 3941—50.
7. Acland G.M., Aguirre G.D., Ray J. et al. Gene therapy restores vision in a canine model of childhood blindness. Nat. Genet. 2001; 28(1): 92—5.
8. Aguirre G.D., Baldwin V., Pearce-Kelling S. et al. Congenital stationary night blindness in the dog: common mutation in the RPE65 gene indicates founder effect. Mol. Vis. 1998; 4: 23—9.
9. Narfstrom K., Katz M.L., Ford M. et al. In vivo gene therapy in young and adult RPE65-/- dogs produces long-term visual improvement. J Hered. 2003; 94(1): 31—7.
10. Narfstrom K., Katz M.L., Bragadottir R. et al. Functional and structural recovery of the retina after gene therapy in the RPE65 null mutation dog. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003; 44(4): 1663—72.
11. Acland G.M., Aguirre G.D., Bennett J. et al. Long-term restoration of rod and cone vision by single dose rAAV-mediated gene transfer to the retina in a canine model of childhood blindness. Mol. Ther. 2005; 12(6): 1072—82.
12. Jacobson S.G., Acland G.M., Aguirre G.D. et al. Safety of recombinant adeno-associated virus type 2-RPE65 vector delivered by ocular subretinal injection. Mol. Ther. 2006; 13(6): 1074—84.
13. Lai C.M., Yu M.J., Brankov M. et al. Recombinant adeno-associated virus type 2-mediated gene delivery into the Rpe65-/-knockout mouse eye results in limited rescue. Genet. Vaccines Ther. 2004; 2(1): 3.
14. Dejneka N.S., Surace E.M., Aleman T.S. et al. In utero gene therapy rescues vision in a murine model of congenital blindness. Mol. Ther. 2004; 9(2): 182—8.
15. Bennicelli J., Wright J.F., Komaromy A. et al. Reversal of blindness in animal models of leber congenital amaurosis using optimized AAV2-mediated gene transfer. Mol. Ther. 2008 ; 16(3): 458—65.
16. Pang J., Boye S.E., Lei B. et al. Self-complementary AAV-mediated gene therapy restores cone function and prevents cone degeneration in two models of Rpe65 deficiency. Gene Ther. 2010; 17(7): 815—26.
17. Li X., Li W., Dai X. et al. Gene therapy rescues cone structure and function in the 3-month-old rd12 mouse: a model for midcourse RPE65 leber congenital amaurosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2011; 52(1): 7—15.
18. Jacobson S.G., Boye S.L., Aleman T.S. et al. Safety in nonhuman primates of ocular AAV2-RPE65, a candidate treatment for blindness in Leber congenital amaurosis. Hum. Gene Ther. 2006; 17(8): 845-58.
19. Bainbridge J.W., Smith A.J., Barker S.S. et al. Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. N. Engl. J. Med. 2008; 358(21): 2231-9.
20. Maguire A.M., Simonelli F., Pierce E.A. et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N. Engl. J. Med. 2008; 358(21): 2240-8.
21. Hauswirth W.W., Aleman T.S., Kaushal S. et al. Treatment of leber congenital amaurosis due to RPE65 mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: short-term results of a phase I trial. Hum. Gene Ther. 2008; 19(10): 979-90.
22. Cideciyan A.V., Aleman T.S., Boye S.L. et al. Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. PNAS USA 2008; 105(39): 15112-7.
23. Moullier P., Snyder R.O. Recombinant adeno-associated viral vector reference standards. Methods Enzymol. 2012; 507: 297311.
24. Cideciyan A.V., Hauswirth W.W., Aleman T.S. et al. Vision 1 year after gene therapy for Leber's congenital amaurosis. N. Engl. J Med. 2009; 361(7): 725-7.
25. Cideciyan A.V., Hauswirth W.W., Aleman T.S. et al. Human RPE65 gene therapy for Leber congenital amaurosis: persistence of early visual improvements and safety at 1 year. Hum. Gene Ther. 2009; 20(9): 999-1004.
26. Simonelli F., Maguire A.M., Testa F. et al. Gene therapy for Leber's congenital amaurosis is safe and effective through 1.5 years after vector administration. Mol. Ther. 2010; 18(3): 643-50.
27. Maguire A.M., High K.A., Auricchio A. et al. Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet 2009; 374(9701): 1597-605.
28. Jacobson S.G., Cideciyan A.V., Ratnakaram R. et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 2012; 130(1): 9-24.
29. Bennett J., Ashtari M., Wellman J. et al. AAV2 gene therapy readministration in three adults with congenital blindness. Sci. Transl. Med. 2012; 4(120): 120ra15.
30. http://www.clinicaltrials.gov
31. Pechan P., Rubin H., Lukason M. et al. Novel anti-VEGF chimeric molecules delivered by AAV vectors for inhibition of retinal neovascularization. Gene Ther. 2009; 16(1): 10-6.
32. Lukason M., DuFresne E., Rubin H. et al. Inhibition of choroidal neovascularization in a nonhuman primate model by intravitreal administration of an AAV2 vector expressing a novel anti-VEGF molecule. Mol. Ther. 2011; 19(2): 260-5.
33. Maclachlan T.K., Lukason M., Collins M. et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Mol. Ther. 2011; 19(2): 326-34.
34. Campochiaro P.A., Nguyen Q.D., Shah S.M. et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Hum. Gene Ther. 2006; 17(2): 167-76.
35. Dawson D.W., Volpert O.V., Gillis P. et al. Pigment epithelium-derived factor: a potent inhibitor of angiogenesis. Science 1999; 285(5425): 245-8.
36. Mori K., Duh E., Gehlbach P. et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits retinal and choroidal neovascularization. J. Cell Physiol. 2001; 188(2): 253-63.
37. Mori K., Gehlbach P., Ando A. et al. Regression of ocular neovascularization in response to increased expression of pigment epithelium-derived factor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002; 43(7): 2428-34.
38. Gehlbach P., Demetriades A.M., Yamamoto S., et al. Periocular injection of an adenoviral vector encoding pigment epithelium-derived factor inhibits choroidal neovascularization. Gene Ther. 2003; 10(8): 637-46.
39. Saishin Y., Silva R.L., Saishin Y. et al. Periocular gene transfer of pigment epithelium-derived factor inhibits choroidal neovascularization in a human-sized eye. Hum. Gene Ther. 2005; 16(4): 473-8.
40. Mori K., Gehlbach P., Yamamoto S. et al. AAV-mediated gene transfer of pigment epithelium-derived factor inhibits choroidal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002; 43(6): 19942000.
41. MacDonald I.M., Sereda C., McTaggart K. et al. Choroideremia gene testing. Expert. Rev. Mol. Diagn. 2004; 4(4): 478-84.
42. Congdon N., O'Colmain B., Klaver C.C. et al.; Eye Diseases Prevalence Research Group. Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States. Arch. Ophthalmol. 2004; 122(4): 477-85.
43. Tropepe V., Coles B.L., Chiasson B.J. et al. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science 2000; 287(5460): 2032-6.
44. Ahmad I., Tang L., Pham H. Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 270(2): 517-21.
45. Coles B.L., Angenieux B., Inoue T. et al. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. PNAS USA 2004; 101(44): 15772-7.
46. Mayer E.J., Carter D.A., Ren Y. et al. Neural progenitor cells from postmortem adult human retina. Br. J. Ophthalmol. 2005; 89(1): 102-6.
47. Xu H., Sta Iglesia D.D., Kielczewski J.L. et al. Characteristics of progenitor cells derived from adult ciliary body in mouse, rat, and human eyes. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007; 48(4): 1674-82.
48. Carter D.A., Mayer E.J., Dick A.D. The effect of postmortem time, donor age and sex on the generation of neurospheres from adult human retina. Br. J. Ophthalmol. 2007; 91(9): 1216-8.
49. Carter D.A., Dick A.D., Mayer E.J. CD133+ adult human retinal cells remain undifferentiated in Leukaemia Inhibitory Factor (LIF). BMC Ophthalmol. 2009; 9: 1.
50. Bradford R.L., Wang C., Zack D.J. et al. Roles of cell-intrinsic and microenvironmental factors in photoreceptor cell differentiation. Dev. Biol. 2005; 286(1): 31-45.
51. Inoue T., Coles B.L., Dorval K. et al. Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells. Stem Cells 2010; 28(3): 489-500.
52. Jomary C., Jones S.E. Induction of functional photoreceptor phenotype by exogenous Crx expression in mouse retinal stem cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2008; 49(1): 429-37.
53. Jomary C., Jones S.E., Lotery A.J. Generation of light-sensitive photoreceptor phenotypes by genetic modification of human adult ocular stem cells with Crx. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 2010; 51(2): 1181-9.
54. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981; 292(5819): 154-6.
55. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. PNAS USA. 1981; 78(12): 7634-8.
56. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282(5391): 1145-7.
57. Wang Z.Q., Kiefer F., Urbanek P. et al. Generation of completely embryonic stem cell-derived mutant mice using tetraploid blastocyst injection. Mech. Dev. 1997; 62(2): 137-45.
58. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126(4): 663-76.
59. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131(5): 861-72.
60. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007; 318(5858): 1917-20.
61. Lamba D.A., Karl M.O., Ware C.B. et al. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. PNAS USA 2006; 103(34): 12769-74.
62. Osakada F., Ikeda H., Mandai M. et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2008; 26(2): 215-24.
63. Lamba D.A., Gust J., Reh T.A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell 2009; 4(1): 73-9.
64. Hirami Y., Osakada F., Takahashi K. et al. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci. Lett. 2009; 458(3): 126-31.
65. Meyer J.S., Shearer R.L., Capowski E.E. et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. PNAS USA 2009; 106(39): 16698-703.
66. Lamba D.A., McUsic A., Hirata R.K. et al. Generation, purification and transplantation of photoreceptors derived from human induced pluripotent stem cells. PLoS One 2010; 5(1): e8763.
67. Yue F., Johkura K., Shirasawa S. et al. Differentiation of primate ES cells into retinal cells induced by ES cell-derived pigmented cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010; 394(4): 877-83.
68. Parameswaran S., Balasubramanian S., Babai N. et al. Induced pluripotent stem cells generate both retinal ganglion cells and photoreceptors: therapeutic implications in degenerative changes in glaucoma and age-related macular degeneration. Stem Cells 2010; 28(4): 695-703.
69. Meyer J.S., Howden S.E., Wallace K.A. et al. Optic vesiclelike structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells 2011; 29(8): 1206—18.
70. Hambright D., Park K.Y., Brooks M. et al. Long-term survival and differentiation of retinal neurons derived from human embryonic stem cell lines in un-immunosuppressed mouse retina. Mol. Vis. 2012; 18: 920-36.
71. Лагарькова М.А., Шилов A.r., Губанова Н.И. и др. Гистогенез эмбриональных стволовых клеток человека in vitro в компоненты сетчатки глаза. Клеточные технологии в биологии и медицине 2011; (4): 203—5.
72. Eiraku M., Takata N., Ishibashi H. et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature 2011; 472(7341): 51—6.
73. Phillips M.J., Wallace K.A., Dickerson S.J. et al. Blood-derived human iPS cells generate optic vesicle-like structures with the capacity to form retinal laminae and develop synapses. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2012; 53(4): 2007—19.
74. Nakano T., Ando S., Takata N. et al. Self-Formation of Optic Cups and Storable Stratified Neural Retina from Human ESCs. Cell Stem Cell 2012; 10(6): 771—85.
75. Seiler M.J., Aramant R.B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Prog. Retin. Eye Res. 2012 Jul 4. Epub ahead of print.
76. West E.L., Gonzalez-Cordero A., Hippert C. et al. Defining the integration capacity of embryonic stem cell-derived photoreceptor precursors. Stem Cells 2012; 30(7): 1424—35.
77. Schwartz S.D., Hubschman J.P., Heilwell G. et al. Embryonic
stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet 2012; 379(9817): 713-20.
78. Klimanskaya I., Hipp J., Rezai K.A. et al. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells 2004; 6(3): 217-45.
79. Lund R.D., Wang S., Klimanskaya I. et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells 2006; 8(3): 189-99.
80. Lu B., Malcuit C., Wang S. et al. Long-term safety and function of RPE from human embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration. Stem Cells 2009; 27(9): 2126-35.
81. D'Cruz P.M., Yasumura D., Weir J. et al. Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat. Hum. Mol. Genet. 2000; 9(4): 645-51.
82. Karan G., Lillo C., Yang Z. et al. Lipofuscin accumulation, abnormal electrophysiology, and photoreceptor degeneration in mutant ELOVL4 transgenic mice: a model for macular degeneration. PNAS USA. 2005; 102(11): 4164-9.
83. Deutman A. Stargardt's disease. Orphanet Encyclopedia. January 2003. http://www.orpha.net/data/patho/GB/uk-Stargardt.pdf
Поступила:17.07.2012
