CC BY
68
УДК 618.14-002-007.274-06-092 Кубанский научный медицинский вестник № 6 (129) 2011
10. Свистунов Б. Д., Андреев В. Г., Макарова Г. В. и др. Применение оксида азота в комплексном лечении больных туберкулезом легких // Проблемы туберкулеза и болезней легких. -2009. - № 6. - С. 50-52.
11. Строев Ю. И., Чурилов Л. П. Эндокринология подростков. - СПб: ЭЛБИ-СПб, 2004. - 384 с.
12. Цветкова Л. Н., Филин В. А., Нечаева Л. В. и др. Достижения и перспективы развития детской гастроэнтерологии // Материалы XVI Конгресса детских гастроэнтерологов России и стран СНГ «Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей». -М., 2009. - С. 8-16.
13. Щербаков П. Л. Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь у детей // Болезни органов пищеварения. - 2007. - Том 9. № 2. - С. 42-47.
14. Casselbrant A., Pettersson A., Ruth M. et al. Sources of intra-oesophageal nitric oxide production following intraluminal acid
exposure // Scandinavian journal of gastroenterology.- 2002. - V. 37. № 6. - P. 631-637.
15. Forstermann U., Munzel T. Endothelial nitric oxide synthase in vascular disease: from marvel to menace // Circulation. - 2006. -V. 113. № 1708. - P. 14.
16. Kuiken S. D., Vergeer M., Heisterkamp S. H. et al. Role of nitric oxide in gastric motor and sensory functions in healthy subjects // Gut. - 2002. - № 51. - P. 212-218.
17. Konturek S. J., Konturek P. C., BrzozowskaI et al. Localization and biological activities of melatonin in intact and diseased gastrointestinal tract (GIT) // Journal of physiology and pharmacolog: an official journal of the Polish physiological society. - 2007. - V. 58. № 3. - P. 381-405.
18. Modlin I. M., Sachs G., Wright N., Kidd M. Edkins and a century of acid suppression // Digestion. - 2005. - V. 72. № 2. - P. 129-145.
Поступила 15.10.2011
и. д. евтушенко1, к. с. кублинский1, и. о. наследникова2, в. в. новицкий2, в. н. ткачев1, н. с. Меньшикова1, е. б. ильяди2, а. с. юрченко1
генитальный эндометриоз И спаечный ПРОЦЕСС: возможная роль трансформирующего фактора роста-бетта
Кафедра акушерства и гинекологии,
2кафедра патофизиологии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет»
Минздравсоцразвития России,
Россия, 634050, г. Томск, ул. Московский тракт, 2.
E-mail: [email protected], тел. +7 (913) 884-38-32
Течение генитального эндометриоза сопровождается повышением содержания TGF-P в сыворотке крови и перитонеальной жидкости. Риск подверженности генитальному эндометриозу ассоциирован с аллелем Т и генотипом ТТ локуса C-509T гена TGFB. Наиболее выраженный спаечный процесс обнаруживается при наличии генотипа ТТ полиморфизма C-509T гена TGFB.
Ключевые слова: генитальный эндометриоз, спаечный процесс, трансформирующий фактор роста-бетта.
I. D. EVTUSHENKO1, К. S. KUBLINSKY1, I. O. NASLEDNIKOVA2, V. V. NOVITSKY2,
V. N. TKACHEV', N. S. MENSHIKOVA1, E. B. ILIADI2, A. S. JURCHENCO1
GENITAL ENDOMETRIOSIS AND ADHESIVE PROCESS: PROBABLE ROLE OF THE TRANSFORMING FACTOR OF GROWTH-BETTA
1 Chair of obstetrics and gynecology,
2chair of pathological physiology Siberian state medical university,
Russia, 634050, Tomsk, str. Moskovskij trakt, 2.
E-mail: [email protected], tel. +7 (913) 884-38-32
Abstract. The current of genital endometriosis is accompanied by increase TGF-P content in blood and peritoneal liquid. The risk of susceptibility to genital endometriosisis is associated with allele T and a genotype of a TT of locus C-509T of gene TGFB. The most expressed adhesive process was found out in the presence of a genotype of a TT of polymorphism C-509T of gene TGFB.
Key words: genital endometriosis, adhesive process, transforming factor of growth-betta.
Введение
Многие годы врачи всего мира ведут упорную борьбу со спаечным процессом. На основании изучения различных аспектов данной проблемы выдвинута масса гипотез об этиологии и патогенезе образования спаек. Согласно классической теории травма брюши-
ны приводит к экссудации фибриногена с последующим образованием фибринозных сращений в брюшной полости, в которые проникают фибробласты и превращают сращения в фиброзные спайки. Однако травмирование брюшины не всегда приводит к образованию фиброзных спаек, а большие травмированные
поверхности заживают в те же сроки, что и маленькие участки [3].
Проблема особенно актуальна в гинекологии, что связано с высокой частотой наступления трубно-перитонеального бесплодия, обусловленного образованием спаек [3]. Генитальный эндометриоз остается одним из самых распространенных гинекологических заболеваний, при котором за пределами полости матки происходит доброкачественное разрастание ткани, по морфологическим и функциональным свойствам подобной эндометрию [1, 2]. Данная патология практически в каждом случае связана со спаечным процессом. Многие исследователи обнаруживали эндометриоид-ные образования в основании спаек при рассечении брюшины. Хирургическое лечение эндометриоза также может сопровождаться образованием послеоперационных спаек различной локализации и плотности.
Имеются данные о том, что трансформирующий фактор роста-бетта (TGF-p) является ключевым медиатором фиброгенеза [5, 6, 9], с чем связывают возможную роль данного цитокина в патогенезе эндометриоза и сопутствующего ему спаечного процесса. В связи с этим целью настоящего исследования явился анализ распределения аллельных вариантов гена TGFB, а также поиск ассоциации с уровнем продукции соответствующего цитокина (TGF-p) в патогенезе эндометриоза и спаечного процесса.
Методика исследования
В программу исследования были включены 135 пациенток репродуктивного возраста: от 19 до 43 лет (средний возраст 30,6±1,2 года), которые были госпитализированы в гинекологическую клинику ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России в 2009-2010 гг. для выполнения лечебно-диагностической и оперативной лапароскопии и гистероскопии. Лапароскопию и гистероскопию выполняли по стандартной методике с использованием аппаратуры фирмы «Каг^оге» (Германия).
Основную группу составили 92 женщины с генитальным эндометриозом. Диагноз эндометриоза был поставлен в результате осмотра брюшины и органов малого таза на наличие эндометриоидных очагов в ходе эндоскопических методов исследования с последующим гистологическим подтверждением. При поступлении в клинику пациентки предъявляли жалобы на бесплодие (средняя продолжительность 3,6±1,1 года), которое у 61 пациентки (66%) было первичным, а у 31 женщины (34%) - вторичным. Кроме того, 68 пациенток (74%) данной группы предъявляли жалобы на болевой синдром, 68 (74%) - на дисменорею, 35 (38%) - на дис-пареунию, 33 (36%) - на нарушение менструального цикла по типу мено- и метроррагии. Наиболее часто, в 85% случаев (у 78 пациенток), во время лапароскопии диагностировались малые формы эндометриоза, в то время как эндометриоидные кисты - в 64% (59 пациенток), из них двусторонние - в 30% случаев. Частота ретроцервикального эндометриоза не превышала 13% (12 пациенток).
В группу сравнения вошли 43 женщины, у которых при проведении эндоскопического исследования был исключен генитальный эндометриоз. Показанием для вмешательства были бесплодие (продолжительность 2,5±1,1 года, первичное - в 40% (17 женщин), вторичное - в 60% [26 женщин]), жалобы на нарушение менструального цикла по типу мено- и метроррагии - 13,3%
(6 пациенток), болезненные менструации - 13,3% (6 пациенток) и синдром тазовых болей - 20% (9 пациенток). Объем оперативного вмешательства для всех пациенток данной группы был одинаков и представлен гистероскопией и диагностической лапароскопией.
У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор и использование крови для проведения исследований. Кровь для молекулярно-генетических методов исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром в день операции. стабилизированные образцы крови хранили при -70° С до момента исследования. Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия). Исследование полиморфного участка С-509Т гена TGFВ (М800469) проводили с использованием аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «АмплиСенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф» путём ПЦР, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе при использовании амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). После проведения ПЦР 8 мкл амплификата разделяли в 2%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида, при напряжении 150 В в течение нескольких минут для последующей визуализации в ультрафиолетовом свете, подтверждающей наличие продукта амплификации. В качестве маркера размера ДНК использовали плазми-дур иС19, расщепленную рестриктазой Мер! («Сибэн-зим», Россия).
Содержание TGF-p в сыворотке крови и перитонеальной жидкости оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией, прилагаемой производителем тест-систем («Суйттипе», США). Оптическую плотность растворов регистрировали на микропланшетном фотометре «МиШекапЕХ» («ThermoLabSystems», Финляндия). Концентрацию рассчитывали по калибровочной кривой.
Для проверки нормальности распределения показателей использовали критерий Колмогорова-Смирнова; равенство выборочных средних проверяли по ^крите-рию Стьюдента (в случае нормального распределения) и и-критерию Манна-Уитни (при отклонении распределения от нормального). Для анализа ассоциации маркеров исследуемого гена с эндометриозом сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах женщин, используя критерий х2 с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации разных генотипов и аллелей с заболеванием судили по величине отношения шансов (oddsratio [OR]) с расчетом для него 95%-ного доверительного интервала (С!).
Результаты исследования
При исследовании уровня TGF-p с помощью им-муноферментного анализа было установлено, что у пациенток с генитальным эндометриозом содержание изучаемого цитокина в сыворотке крови (7120 пг/мл) и перитонеальной жидкости (5439 пг/мл) значимо превышало таковое у женщин без данной патологии (4087 пг/ мл, р<0,05 и 3243 пг/мл, р<0,005 соответственно).
Проведенное нами иммуногенетическое исследование показало, что среди пациенток с эндометриозом
Кубанский научный медицинский вестник № 6 (129) 2011
Кубанский научный медицинский вестник № 6 (129) 2011
Таблица 1
Распределение генотипов и аллелей полиморфизма С-509Т гена TGFB (абс., %) среди обследованных женщин
Регистрируемый показатель Женщины без эндометриоза (п=43) Женщины с эндометриозом (п=92) X2 OR (95% СІ)
Аллель С 49 (57%) 71 (39%) 8,03 р<0,005 0,47 (0,28-0,80)
Т 37 (43%) 113 (61%) 2,11 (1,25-3,55)
Генотип СС 21 (49%) 30 (33%) 4,64 р<0,05 0,51 (0,24-1,06)
СТ 7 (16%) 11 (12%) 0,70 (0,25-1,95)
ТТ 15 (35%) 51 (55%) 2,32 (1,10-4,92)
Примечание: здесь и в таблице 2: х2 - стандартный критерий Пирсона для сравнения частот генотипов и аллелей генов; OR - критерий отношения шансов, отражающий относительный риск развития заболевания при определенном генотипе с 95%-ным доверительным интервалом.
Таблица 2
Распределение генотипов и аллелей полиморфизма С-509Т гена TGFB (абс., %) среди пациенток с генитальным эндометриозом в зависимости от выраженности спаечного процесса
Регистрируемый показатель Спаечный процесс 1-11 степени (п=36) Спаечный процесс Ш-М степени (п=17) X2 OR (95% СІ)
Аллель С 49 (58%) 41 (41%) 2,73 р>0,05 0,50 (0,22-1,14)
Т 37 (42%) 113 (59%) 2,00 (0,87-4,58)
Генотип СС 16 (44%) 5 (29%) 2,00 р<0,05 0,52 (0,15-1,79)
СТ 10 (28%) 4 (24%) 0,80 (0,21-3,05)
ТТ 10 (28%) 8 (47%) 2,31 (0,70-7,67)
статистически значимо преобладали гомозиготы с генотипом ТТполиморфизма С-509Т гена TGFB (55% против 35% у женщин без эндометриоза), а реже встречались носительницы генотипа СС (33% против 49% у женщин без данной патологии). Анализ распределения аллелей позволил установить, что среди больных эндометриозом достоверно преобладал аллельТ (х2=8,03, р<0,005) полиморфизма С-509Т гена TGFB (табл. 1).
На следующем этапе было проведено изучение распределения генотипов и аллельных вариантов гена TGFBC-509T среди 53 пациенток (58%), у которых при ревизии органов малого таза были диагностированы эндометриоз и спаечный процесс. В зависимости от степени выраженности спаечного процесса в малом тазу (по классификации Hulkaetal., 1978) женщины были разделены на 2 группы: в первую вошли 36 пациенток (68%) с умеренно выраженным спаечным процессом (1-11 степень), во вторую группу - 17 женщин (32%) с выраженным спаечным процессом (III-
IV степень). Генотипирование образцов ДНК по гену TGFBC-509T у больных эндометриозом показало, что частота встречаемости генотипа ТТ у пациенток со спаечным процессом Ш-М степени (47%) статистически значимо превышала таковую у женщин со спаечным процессом органов малого таза Ш степени (28 %), при этом частота генотипа СС полиморфизма С-509Т гена TGFB имела обратную зависимость (29% и 44% соответственно) (х2=2,00, р<0,05) (табл. 2).
Таким образом, проведенное нами исследование показало, что течение генитального эндометриоза сопровождается повышением содержания TGF-p в сыворотке крови и перитонеальной жидкости. Риск подверженности генитальному эндометриозу оказался ассоциирован с аллелем Т (OR=2,11) и генотипом ТТ ^=2,32) локуса С-509Т гена TGFB (табл. 1). Наиболее выраженный спаечный процесс обнаруживался при наличии генотипа ТТ (OR=2,31) полиморфизма С-509Т гена TGFB (табл. 2).
Обсуждение
Вопрос об этиологии и патогенезе эндометрио-за, несмотря на большое число концепций, в которых делается попытка дать объяснение причинам и механизмам данного заболевания, остается открытым. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о существенной роли в патогенезе эндометриоза нарушений иммунного гомеостаза [1, 2, 6]. Иммунная система играет ключевую роль в регулировании событий, таких как клеточная адгезия, миграция, выживание трансформированных клеток [7]. Пролиферация эндометриоидных клеток в других тканях возможна в результате повышения уровня эстрогенов, которые стимулируют секрецию кортикостероидов. Последние, в свою очередь, являясь депрессантами, подавляют местный клеточный и гуморальный иммунитет, тем самым обеспечивая благоприятные условия для инвазии и развития жизнеспособных клеток эндометрия [1, 8].
TGF-p также является цитокином с супрессорным влиянием на динамику иммунного ответа, обладающим противовоспалительным эффектом, защищающим организм от избыточной продукции макрофагами и другими клетками воспаления цитотоксических соединений [5, 9]. Поэтому обнаруженное нами повышение уровня TGF-p в сыворотке крови и перитонеальной жидкости у пациенток с эндометриозом следует расценивать как иммуносупрессорный фактор, способствующий формированию и распространению эндометриоидных гетеро-топий, позволяющий клеткам эктопического эндометрия «ускользать» от иммунного надзора организма.
TGF-p экспрессируется во всех клетках организма, которые одновременно являются мишенями его действия, и, как правило, находится в латентной форме и активируется лишь при физиологической необходимости [5]. ГиперпродукцияTGF-p и/или повышенная экспрессия гена TGFB может быть генетически детерминированной, в связи с этим изучение транскрипционного контроля гена TGFB представляет особенный интерес.
Имеются данные, что присутствие аллельного варианта Т-509 ассоциировано с увеличением продукции ТGF-p [4]. Проведенный нами анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма C-509T гена TGFB показал, что среди пациенток с генитальным эндометриозом статистически значимо чаще встречались гомозиготы с генотипом ТТ, с которым оказался ассоциирован риск подверженности генитальному эн-дометриозу (табл. 1).
Аналогичная тенденция была обнаружена нами при анализе распределения аллелей и генотипов полиморфизма C-509T гена TGFB в зависимости от распространенности спаечного процесса: генотип ТТ чаще выявлялся у пациенток с наиболее выраженным спаечным процессом (Ш-М степени) в малом тазу (табл. 2).
Установлено, что ген TGF индуцирует увеличение экспрессии мРНК для цепей коллагена в клетках человека. TGF-p может влиять на метаболизм белков
матрикса как непосредственно, так и опосредованно, через синтез других регуляторных молекул, однако механизм этого процесса окончательно не выяснен [4]. Имеются сведения, что под действием TGF-ß возрастает продукция таких белков матрикса, как фибронектин итенасцин, у лабораторных животных в эксперименте [5, 9]. Таким образом, благодаря своей полифункциональности TGF-ß играет важную роль в фиброгенезе при генитальном эндометриозе.
В заключение хотелось бы отметить, что роль TGF-ß в патогенезе генитального эндометриоза и спаечного процесса окончательно не установлена. Возможно, этот многофункциональный цитокин задействован и в других механизмах формирования и распространения эндометриоидных гетеротопий. В частности, обнаружено, что активированные рецепторы TGF-ß фосфо-риллируют специфические сигнальные эффекторы -белки семейства Smad. Образующиеся комплексы транслоцируются из цитоплазмы в ядро и регулируют транскрипцию специфических генов, что способствует росту и пролиферации как нормальных, так и опухолевых клеток. Таким образом, TGF-ß может действовать не только как иммуносупрессор, но и как стимулятор пролиферации, ангиогенеза и синтеза внеклеточного матрикса [9]. Поиск новых молекулярных мишеней образования спаек при генитальном эндометриозе позволит не только глубже понять сущность проблемы, но и оптимизировать лечение и уменьшить частоту рецидивов этого тяжелого заболевания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Адамян Л. В., Кулаков В. И., Андреева Е. Н. Эндометриозы. -М.: Медицина, 2006. - 416 с.
2. Ищенко А. И., Кудрина Е. А. Эндометриоз: диагностика и лечение. - М.: МИА, 2008. - 176 с.
3. Кулаков В. И., Адамян Л. В., Мынбаев О. А. Послеоперационные спайки (этиология, патогенез и профилактика). - М.: Медицина, 1998. - 528 с.
4. Симбирцев А. С., Громова А. Ю. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления // Иммунология. -2005. - № 1. - С. 67-72.
5. Фильченков А. А., Залесский В. Н., Стойка Р. С. TGFB: про-атерогенный или антиатерогенный цитокин? // Цитокины и воспаление. - 2002. - № 1. - С. 12-17.
6. Bright J. J., Sriram S. TGF-ß inhibits IL-12-induced activation of Jak-STAT pathway in T-lymphocytes // J. of immunology. - 1998. -V. 161. № 4. - P. 1772-1777.
7. Harada T., Iwabe T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis // Fertil. steril. - 2001. - V. 76. № 1. - Р. 1-10.
8. Iwabe T., Harada T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis-associated infertility // Gynec. obstet. invest. - 2002. -V. 53. № 1. - Р. 19-25.
9. PonceletA.-G., SchnaperH. W. Regulation of human mesangial cell collagen expression bytransforming growth factor-beta1 // Am. j. physiol. - 1998. - V. 275. - P. 458-466.
Поступила 13.10.2011
Кубанский научный медицинский вестник № 6 (129) 2011
