CC BY
29
НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК
дифференциальной среде с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, далее накапливали культуру и выделяли плазмидную ДНК. В результате работы были сконструированы ПКО к каждому локусу, выявляемому в мультиплексной ПЦР с 4 парами праймеров.
При оценке чувствительности и специфичности ПЦР с выбранными праймерами использовали ПКО в концентрациях от 1х 102 до 1х 105 ГЭ/мл и кДНК вирусов Денге (1-ГУ типов) в разведении 10-3, 10-4, 10-5. Исследования показали, что праймеры обеспечивают специфичную амплификацию фрагмента нуклеотид-ной последовательности соответствующего вируса с чувствительностью 1*104 ГЭ/мл, в случае с кДНК вирусов Денге чувствительность составила 10-4. Для проверки специфичности использовали образцы крови и сыворотки здоровых доноров, суспензии печени и селезенки мелких млекопитающих, не содержащие генетиче-
ский материал вирусов Денге, а также два препарата ДНК бактерий (Legionella pneumophila, Yersinia pestis) (в концентрации 1*106 мк/мл) и семь препаратов к ДНК гетерологичных вирусов (Западного Нила, ККГЛ, желтой лихорадки, клещевого энцефалита, Дугбе, Батаи, Чикунгунья) (разведения вирусов - 10-4). Во всех случаях в ПЦР получен отрицательный результат. Данные по специфичности и чувствительности ПЦР с выбранными праймерами свидетельствовали о возможности их использования для разработки ПЦР-тест-системы.
Таким образом, проведенная проверка сконструированной мультиплексной ПЦР-системы показала отсутствие неспецифических реакций с гетерогенными нуклеиновыми кислотами (ДНК бактерий и кДНК вирусов). Чувствительность системы, оцененная по ПКО, составила 1*104 ГЭ/мл.
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА НА ТЕРРИТОРИИ НОВОСИБИРСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА
С.Е. Ткачев, В.Ю. Боргояков, Е.Д. Чикова, В.В. Панов*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
*Институт систематики и экологии животных СО РАН
В настоящее время большинство исследователей выделяют три основных генетических типа вируса клещевого энцефалита (ВКЭ): дальневосточный (с прото-типным штаммом Софьин), западноевропейский, или западный (прототипный штамм Найдорф), и сибирский, или урало-сибирский (с прототипными штаммами Васильченко и Заусаев) (Ecker et al., 1999; Hayasaka et al., 1999, 2001; Злобин и др., 2001, 2003; Погодина и др., 2002, 2004). В последние годы были также выявлены и охарактеризованы возможные новые генотипы ВКЭ - генотип, представленный одиночным штаммом 178-79, и генотип, представленный группой штаммов, сходных со штаммом 886-84. Оба этих штамма были изолированы на территории Иркутской области и отвечают критериям выделения в самостоятельные генотипы, установленным на основании степени геномных отличий (Демина и др., 2009а, 2009б; Demina et al., 2010).
Цель работы - исследование генетического разнообразия ВКЭ в образцах индивидуальных иксодовых клещей, собранных на территории лесопарковой зоны Новосибирского научного центра (ННЦ).
Материалы и методы. Сбор образцов. Голодных имаго иксодовых клещей собирали флагированием с растительности в природном очаге лесопарковой зоны Новосибирского научного центра в эпидемиологические сезоны 2007-2010 гг. на участках: 1) ботанический сад, окрестности ННЦ, смешанный березово-осиновый лес; 2) пойма реки Шадрихи, 8 км к юго-востоку от ННЦ, сосновый лес; 3) пост ГАИ, окрестности ННЦ, сосновый лес; 4) смешанный березово-осиновый лес за Инсти-
тутом катализа СО РАН, окрестности ННЦ. Проводили сбор образцов клещей с людей, обращающихся в пункт вакцинопрофилактики ЦКБ СО РАН по поводу укусов как на территории ННЦ, так и его окрестностей, в эпид-сезоны 2009-2010 гг.
Выделение суммарных РНК. Суммарные нуклеиновые кислоты из иксодовых клещей выделяли с использованием наборов «Проба НК» («ДНК-технология», Москва) согласно инструкциям производителя.
Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция. Получение кДНК, соответствующих фрагментам генома ВКЭ, проводили методом обратной транскрипции (ОТ) с применением наборов «РевертаЬ» в соответствии с инструкциями изготовителя («АмплиСенс», ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ). В качестве матрицы использовали образцы суммарных нуклеиновых кислот, выделенных из клещей. Двухраундовую полиме-разную цепную реакцию (ПЦР) проводили с праймерами, соответствующими З'-концу гена Е (позиции 2199-2219 и 2214-2238 н.о.) и 5'-концу гена NS1 (позиции 2402-2424 и 2517-2539 н.о.) ВКЭ.
Определение нуклеотидных последовательностей и молекулярно-генетический анализ. Определение нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР, соответствующих фрагментам генома ВКЭ, проводили с помощью наборов BigDye Terminators Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems, США) с применением автоматического анализатора ДНК модели ABI 310 (Applied Biosystems, США) в Центре секвенирования ДНК СО РАН. Полученные последовательности вы-
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ И ТИПИРОВАНИИ ПАТОГЕНОВ
равнивали с использованием программы ClustalW (Larkin et al., 2007). Поиск гомологии полученных нукле-отидных последовательностей с уже известными последовательностями фрагментов геномов ВКЭ проводили с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/). Для сравнения использовали последовательности генов E и NS1 штаммов ВКЭ, относящихся к различным генетическим типам, из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html). Филогенетический анализ проводили с помощью программы MEGA 5 (Tamura et al., 2011). Оценку достоверности построенных филогенетических древ осуществляли с помощью бутстрэп-анализа.
Определение видов клещей молекулярно-гене-тическими методами. Для молекулярно-генетического определения клещей видов I.persulcatus Schulze, 1930 и I.pavlovskyi Pomerantsev, 1946 использовали разработанные системы видоспецифичных праймеров, соответствующих последовательностям фрагмента гена субъединицы 1 цитохром-оксидазы, полученных из базы данных GenBank. В качестве матрицы использовали смеси ОТ.
Результаты и обсуждение. Выявляли вирусные РНК и генотипирование положительных образцов из индивидуальных клещей, собранных на территории ННЦ в 2007-2010 гг. либо с людей, обратившихся по поводу укуса в пункт вакцинопрофилактики ЦКБ СО РАН в 2009-2010 гг.
Положительные по ВКЭ образцы выявляли методом двухраундовой ПЦР с праймерами, соответствующими фрагментам генов E-NS1, причем было показано, что вирус обнаруживается как в самках, так и в самцах иксодовых клещей. Затем для ряда образцов были определены нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов генов E-NS1 ВКЭ длиной 341 п.н. Анализ последовательностей, соответствующих вариантам вируса, выявленным в индивидуальных клещах, показал доминирование ВКЭ сибирского генетического типа с уровнем гомологии 89-98 % последовательностям прототипных штаммов Васильченко и Заусаев на территории ННЦ; также сибирский генотип выявлялся в иксодовых клещах, собранных с людей после укуса.
Далее проводили филогенетический анализ полученных последовательностей. Методом UPGMA было
показано, что исследуемые варианты ВКЭ, относящиеся к сибирскому генотипу, разделяются на 3 подтипа -подтипы Васильченко, Заусаев и подтип, не описанный ранее, что наблюдалось прежде и в коллекции штаммов ВКЭ, собранных на территории ННЦ в 1981-2011 гг. (Ткачев и др., 2010, 2011). Два образца ВКЭ, выявленные в индивидуальных иксодовых клещах с территории лесопарковой зоны Новосибирского научного центра, относились к дальневосточному генотипу и один - к западноевропейскому. Ранее нами было показано, что в крови пациентов, госпитализированных после укусов клещей, с различными формами клещевого энцефалита, несмотря на доминирование сибирского генотипа в клещах, выявлялся дальневосточный генотип ВКЭ (Tka-chev et al., 2008), что, вероятно, может быть связано с особенностями патогенеза различных вирусных генотипов.
Интересен факт единичного обнаружения за последние несколько лет исследований западноевропейского генотипа ВКЭ на территории ННЦ. Ранее данный генотип в Западной Сибири был найден на территории Алтая (Demina et al., 2010) и, по всей видимости, может встречаться и на соседних территориях либо заноситься на них в силу активного перемещения населения в результате туристической деятельности.
С использованием систем праймеров, соответствующих фрагменту гена субъединицы 1 цитохром-окси-дазы иксодовых клещей, было показано, что ВКЭ выявлялся как в клещах I.persulcatus, так и в клещах I.pav-lovskyi, причем как в клещах, собранных флагированием, так и в снятых после укусов людей, что, вероятно, может указывать на вовлеченность обоих видов клещей в перенос вируса.
Таким образом, на территории Новосибирского научного центра и прилегающих к нему областей были выявлены преимущественно сибирский (подтипы Заусаев, Васильченко и подтип, не описанный ранее) генотип и, в единичных случаях, дальневосточный и западноевропейский генетические типы ВКЭ. Показано, что вирус выявляется как в самках и самцах клещей I.persulcatus, так и I.pavlovskyi.
Работа поддержана междисциплинарным интеграционным проектом СО РАН № 63 и заказным интеграционным проектом СО РАН № 6.
ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ ДНК КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ
О.С. Шкода, Н.В. Фоменко, Е.Д. Чикова, Е.С. Морозкин, В.А. Милейко, В.В. Власов, П.П. Лактионов, Е.Ю. Рыкова
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск
Цель работы. Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) характеризуется различными формами развития и опасен тем, что его хроническое течение может приводить к серьезным осложнениям. Поэтому актуальным является выявление маркеров, пригодных как для ранней диагностики заболевания с целью приня-
тия решения о назначении своевременного лечения, так и в качестве маркеров хронизации процесса. Одним из критериев постановки диагноза ИКБ является возникновение мигрирующей эритемы (МЭ) в месте укуса клеща. Однако встречаются безэритемные формы ИКБ, что затрудняет правильную постановку диагноза. В таких
