CC BY
38
https://doi.org/l0.17816/ecogen17143-51
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МИКРОСИМБИОНТОВ ТЕРМОПСИСА ЛАНЦЕТНОГО (THERMOPSIS LANCEOLATA), ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО В МОНГОЛИИ
© Д.С Карлов ', А.Л. Сазанова ', И.Г. Кузнецова ', В.И. Сафронова ', Н.Ю. Тихомирова ', Ж.П. Попова ', Ю.С. Оследкин ', А.В. Верхозина 2, А.А. Белимов 1
1 ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии», Санкт-Петербург;
2 ФГБУН «Сибирский институт физиологии и биохимии растений» СО РАН, Иркутск
Для цитирования: Карлов Д.С., Сазанова А.Л., Кузнецова И.Г., и др. Генетическое разнообразие микросимбионтов термопсиса ланцетного (Thermopsis lanceolata), произрастающего в Монголии // Экологическая генетика. - 2019. - Т. 17. - № 1. - С. 43-51. https:// doi.org/10.17816/ecogen17143-51.
Поступила: 13.10.2018 Одобрена: 04.12.2018 Принята: 25.03.2019
Ш Впервые были выделены и идентифицированы бактерии из клубеньков дикорастущего лекарственного бобового растения термопсиса ланцетного (Thermopsis lanceolata), произрастающего в Монголии. В результате секвенирования 16S рДНК (rrs) и гена «домашнего хозяйства» atpD определено таксономическое положение 14 изолятов. Показано значительное биоразнообразие микросимбионтов термопсиса, которые относились к трем родам порядка Rhizobiales: Phyllo-bacterium (сем. Phyllobacteriaceae), Rhizobium (сем. Rhizobiaceae) и Bosea (сем. Bradyrhizobiaceae). Видовая принадлежность была определена для девяти изолятов: шесть изолятов были идентифицированы как Phyllobacterium zundukense и Phyllobacterium trifolii (100 и 99,9 % rrs гомологии с типовыми штаммами P. zundukense Tri-48T и P. trifolii PETP02T соответственно), три изолята — как Rhizobium anhuiense (99,8 % rrs гомологии с типовым штаммом R. anhuiense CCBAU 23252T). Два медленнорастущих изолята Tla-534 и Tla-545, отнесенных к роду Bosea, могут потенциально принадлежать к новым видам, поскольку их сходство по гену rrs с ближайшими типовыми штаммами B. massiliensis LMG 26221T, B. lathyri LMG 26379T и B. vaviloviae Vaf18T составляло 98,5-99,0 %. Неризобиальных штаммов из клубеньков выделено не было. Создание коллекции микросимбионтов термопсиса ланцетного и их изучение является одной из необходимых предпосылок для промышленного возделывания этой ценной лекарственной культуры.
Ш Ключевые слова: лекарственные бобовые растения; термопсис ланцетный Thermopsis lanceolata; клубеньковые бактерии; гены 16S рРНК и atpD.
THE GENETIC DIVERSITY OF MICROSYMBIONTS FROM THERMOPSIS LANCEOLATA GROWING IN MONGOLIA
© D.S. Karlov ', A.L. Sazanova ', I.G. Kuznetsova ', V.I. Safronova ', N.Y. Tikhomirova ', Zh.P. Popova ', Yu.S. Osledkin A.V. Verkhozina 2, A.A. Belimov 1
1 All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, Saint Petersburg, Russia;
2 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry (SIPPB), Irkutsk, Russia
For citation: Karlov DS, Sazanova AL, Kuznetsova IG, et al. The genetic diversity of microsymbionts from Thermopsis lanceolata growing in Mongolia. Ecological genetics. 2019;17(1):43-51.
https://doi.org/l0.17816/ecogen17143-51.
Received: 13.10.2018 Revised: 04.12.2018 Accepted: 25.03.2019
& For the first time, bacteria were isolated and identified from the root nodules of a wild-growing medicinal legume plant Thermopsis lanceolata, originated from Mongolia. The taxonomic position of 14 isolates obtained was determined using of sequencing of the 16S rRNA (rrs) and atpD genes. It was shown a significant biodiversity of the isolates from T. lanceolata, which belonged to three genera of the order Rhizobiales: Phyllobacterium (family Phyllobacteriaceae), Rhizobium (family Rhizobiaceae) and Bosea (family Bradyrhizobiaceae). Six isolates belonged to the species Phyllobacterium zundukense and Phyllobacterium trifolii (100 u 99,9% rrs similarity with the type strains P. zundukense Tri-48T and P. trifolii PETP02T, respectivelly), three isolates were identified as Rhizobium anhuiense (99,8% rrs similarity with the type strain R. anhuiense CCBAU 23252T). Two slow-growing isolates of the genus Bosea Tla-534 and Tla-545 may potentially belong to new species, since their rrs-similarity to the closest type strains B. massiliensis LMG 26221T, B. lathyri LMG 26379T and B. vaviloviae Vaf18T was 98,5-99,0%. Non-rhizobial strains were not isolated. The isolation and future investigation of the rhizobial microsymbionts of the valuable medicinal legume Thermopsis lanceolata is one of the necessary prerequisites for its industrial cultivation.
& Keywords: medicinal legume plants; Thermopsis lanceolata; root nodule bacteria; 16S rRNA and atpD genes.
Бобово-ризобиальный симбиоз — уникальное и широко распространенное явление среди бобовых растений. Клубеньковые бактерии (ризобии), как неотъемлемая
часть такого симбиоза, служат объектом пристального изучения при создании коллекций и выявлении механизмов растительно-микробных взаимодействий. Известно,
что бобовые растения, обладая высоким морфофизио-логическим и экологическим разнообразием, вносят решающий вклад в азотный баланс многих наземных экосистем и агроценозов. Такая возможность достигается за счет расширения биохимических функций у обоих симбиотических партнеров и приобретения растениями новых адаптивных способностей [1]. В связи с этим изучение бобово-ризобиального симбиоза имеет огромное экологическое и практическое значение.
Термопсис ланцетный (Thermopsis lanceolata, R.Br.) — многолетнее дикорастущее бобовое растение, встречающееся в Западной и Восточной Сибири, Байкальском регионе, Средней Азии, на севере Монголии и Китая [2]. Растение содержит ряд алкалоидов и обладает ценными фармакологическими свойствами. Одним из главных биологически активных алкалоидов является цитизин, содержащийся преимущественно в семенах [3] и применяющийся в медицинских целях для лечения никотиновой зависимости (препарат Табекс) [4], а также в качестве отхаркивающего средства (препараты Термопсол и Коделак Бронхо); широко используется в ветеринарии (препарат Цититон) [5]. О попытках выделения клубеньковых бактерий из T. lanceolata в литературных источниках не упоминается. Вместе с тем для эффективного введения в культуру этого растения (особенно в условиях интродукции) необходимо создание коллекции его микросимбионтов с целью производства на их основе ростостимулирующих биопрепаратов. При этом на первом этапе исследования штаммов-микросимбионтов необходимо проведение их идентификации с использованием современных молеку-лярно-генетических методов, таких как секвенирование последовательности 16S рДНК и генов «домашнего хозяйства».
Таким образом, цель нашей работы состояла в создании коллекции ризобиальных микросимбионтов дикорастущего лекарственного бобового растения T. lanceolata, произрастающего в Северной Монголии, и определении таксономического положения штаммов с помощью секвенирования последовательностей 16S рДНК и гена «домашнего хозяйства» atpD.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования были 14 бактериальных изолятов, выделенных по стандартной методике [6] из корневых клубеньков бобового растения T. lanceolata, собранного в горно-таежной области Монголии (окрестности озера Хубсугул, правый берег реки Эгийн-Гол, пос. Алаг-Эрденэ). Бактерии выращивали на модифицированном маннитно-дрожже-вом агаре YMSA с добавлением 0,5 % сукцината [7]. Из каждого клубенька было отобрано по одному изо-ляту. Видовую принадлежность изолятов определяли с помощью амплификации и секвенирования гена 16S рРНК, как было описано ранее [7]. Для уточнения
таксономического положения изолятов использовали амплификацию и секвенирование гена atpD, кодирующего в-субъединицу АТФ-синтазного комплекса, с применением праймеров atpD-273F/atpD-771R [8] и atpD352F/atpD871R [9]. Полученный ПЦР-про-дукт выделяли из геля и очищали, как было описано ранее [10], для последующего секвенирования на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl (Applied Biosystems, США). Поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью базы данных NCBI GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) и программы BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Для конструирования филогенетических деревьев использовали программу MEGA7 и метод Neighbor-Joining [11]. Нуклеотидные последовательности, полученные в работе, депонированы в базе данных GenBank под номерами MH779890-MH779903, MK135051-MK135064.
Все полученные изоляты депонированы в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) и размещены на Станции низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов (Liconic Instruments, Лихтенштейн) [12]. Информация об изолятах доступна в интернет-базе данных ВКСМ (http://www.amam. spb.ru.).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В окрестностях озера Хубсугул, где был проведен отбор растений для последующего выделения бактерий из корневых клубеньков, климат резко континентальный и почвы функционируют в условиях криодизации и аридизации [13]. Почву непосредственно в месте отбора можно охарактеризовать как литозем серогумусо-вый [14], реакция почв кислая или нейтральная [15]. В результате анализа клубеньков, собранных с разных растений T. lanceolata одной популяции, было выделено 14 бактериальных изолятов: два из них формировали колонии на 5—6-е сутки, три — на 3-и сутки и девять — на 4 — 5-е сутки.
Анализ последовательностей гена 16S рРНК (rrs) позволил отнести полученные изоляты к трем родам порядка Rhizobiales: Phyllobacterium (сем. Phyllo-bacteriaceae), Rhizobium (сем. Rhizobiaceae) и Bosea (сем. Bradyrhizobiaceae). На рис. 1 показано, что штаммы, относящиеся к родам Phyllobacterium и Rhizobium, формируют две обособленные группы. Штаммы Phyllobacterium, в свою очередь, разделились на три кластера. В Rrs-кластер I вошли изоляты Tla-531, Tla-536, Tla-538, Tla-546 и Tla-549, а также типовые штаммы P. trifolii PETP02T и P. loti S658T при уровне поддержки 100 % (см. рис. 1). Сходство изолятов по гену rrs с указанными типовыми штаммами составляло 99,9 и 100 % соответственно, при этом последовательности гена у изолятов были идентичны (табл. 1). Однако на филогенетическом дереве,
10C
67
Tla-549 (MH779901)
- Phyllobacterium trifolii PETP02T (NR 043193) Tla-546 (MH779900) Tla-538 (MH779894) Tla-536 (MH779892) Tla-531 (MH779890) Phyllobacterium loti S658T (NR 133818)
_|- Phyllobacterium ifriqiyense STM 370T (NR043192)
100— Phyllobacterium catacumbae CSC19T (NR043055) - Phyllobacterium bourgognense STM 201T (NR 043191)
99J- Phyllobacterium sophorae CCBAU 03422T (KJ685937) 54| I Phyllobacterium brassicaceamm STM 196T (NR 043190) 75
90
88
100
98
78
- Tla-540 (MH779895) L Phyllobacterium endophyticum PEPV15T (NR 109517) Tla-537 (MH779893)
Phyllobacterium zundukense Tri 48T (CP017940) I Tla-543 (MH779897) 71 Tla-544 (MH779898)
Phyllobacterium myrsinacearum STM 948T (AY785315)
-Rhizobium gallicum R602spT (U86343)
Rhizobium yanglingense SH22623T (AF003375)
-Rhizobium mongolense USDA1844T(U89817)
L Rhizobium loessense CCBAU 7190BT (AF364069) — Rhizobium etli CFN 42T (U28916) Tla-550 (MH779902) Tla-552 (MH779903) Tla-541 (MH779896) Rhizobium leguminosarum LMG 14904T (NR 114989) Rhizobium laguerreae FB206T (NR 118274) Rhizobium anhuiense CCBAU 23252T (KF111868)
II
III
5' 6: 1 or
96
0,0050
Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изолятов, выделенных из клубеньков термопсиса ланцетного (Thermopsis lanceolata), а также представителей родственных видов Phyllobacterium и Rhizobium. Полученные изоляты обозначены жирным шрифтом. Типовые штаммы отмечены литерой Т. Кластеры 1 — Ш сформированы с участием изолятов Phyllobacterium, полученных в работе. Указаны уровни поддержки более 50 %
Таблица 1
Гомология генов 16S рРНК и atpD у изолятов, выделенных из клубеньков Thermopsis lanceolata, и типовых штаммов ближайших видов Phyllobacterium
I
62
Типовые штаммы Локус Уровень гомологии с изолятами (%)
Кластер I Кластер II Кластер III
Tla-531 Tla-536 Tla-538 Tla-546 Tla-549 Tla-540 Tla-537 Tla-543 Tla-544
P. trifolii PETP02T 16S рРНК 99,9 99,9 99,9 99,9 99,9 98,3 98,9 98,9 98,9
atpD 100 93,3 93,4 100 100 89,5 89,0 89,0 89,0
P. loti S658T 16S рРНК 100 100 100 100 100 98,4 99,0 99,0 99,0
atpD 96,7 92,6 92,6 96,7 96,7 89,3 87,7 87,7 87,7
P. bourgognense STM 201T 16S рРНК 99,1 99,1 99,2 99,2 99,2 98,8 99,4 99,3 99,3
atpD 88,9 89,6 89,6 88,9 88,9 89,6 91,8 91,8 91,8
P. brassicacearum STM 196T 16S рРНК 98,7 98,7 98,7 98,7 98,7 99,3 99,3 99,3 99,3
atpD 96,9 94,2 94,2 96,9 96,9 88,9 87,9 87,9 87,9
P. endophyticum PEPV15T 16S рРНК 98,1 98,1 98,7 98,7 98,7 99,2 99,5 99,4 99,4
atpD 90,8 90,8 90,1 90,8 90,8 89,8 89,6 89,6 89,6
P. zundukense Tri-48T 16S рРНК 99,0 99,0 99,0 99,0 99,0 99,3 100 99,9 99,9
atpD 89,0 89,8 89,8 89,0 89,0 89,3 100 100 100
P. sophorae CCBAU03422T 16S рРНК 98,3 98,3 98,5 98,5 98,5 99,1 99,0 99,2 99,2
atpD 88,9 89,4 89,4 88,9 88,9 87,3 91,5 91,5 91,5
50
67
65
99
100
Phyllobacterium trifolii PETP02T (JN848779) Tla-531 (MK135051) Tla-546 (MK135061) Tla-549 (MK135062)
Phyllobacterium loti S658T (KC577467)
-Phyllobacterium brassicacearum STM 196T (AY785335)
I Tla-536 (MK135053)
Ia
1001 Tla-538 (MK135055) -Tla-540 (MK135056)
Ib } II
-Phyllobacterium endophyticum PEPV15T (JN848780)
- Phyllobacterium sophorae CCBAU03422T (KJ685941) Phyllobacterium zundukense Tri-48T (KX447666)
Tla-537 (MK135054) Tla-543 (MK135058) Tla-544 (MK135059) -Phyllobacterium bourgognense STM 201T (AY785336)
-Rhizobium leguminosarum LMG 14904T (AM418783) -Rhizobium laguerreae FB206T (JN558661)
100
III
100
Rhizobium leguminosarum bv viciae BIHB 1160 (JF759810) Rhizobium leguminosarum bv trifolii R200 (HQ394215)
Rhizobium anhuiense CCBAU 23252T (KF111890) Tla-550 (MK135063) - Tla-541 (MK135057) Tla-552 (MK135064)
0,020
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов atpD изолятов, выделенных из клубеньков термопсиса ланцетного (Thermopsis lanceolata), а также представителей родственных видов Phyllobacterium и Rhizobium. Полученные изоляты обозначены жирным шрифтом. Типовые штаммы отмечены литерой Т. Кластеры 1а, 1Ь, II и III сформированы с участием изолятов, полученных в работе. Указаны уровни поддержки более 50 %
построенном на основании анализа гена atpD, данные изоляты разделились на два статистически достоверных кластера (рис. 2). Кластер Ia формировался при 100 % уровне поддержки и состоял из изолятов Tla-531, Tla-546, Tla-549, а также типового штамма P. trifolii PETP02T, сходство с которым по гену atpD составляло 100 % (см. табл. 1). Таким образом, на основании результатов секвенирования гена atpD изоляты Tla-531, Tla-546, Tla-549 были идентифицированы как P. trifolii. Отметим, что бактерии этого вида впервые были выделены из клубеньков клевера лугового (Trifolium pretense) [16]. Ранее было показано, что штамм P. trifolii PETP02T способен вступать в эффективный симбиоз с растениями Trifolium repens и Lupinus albus [16, 17]. Помимо этого, бактерии, близкородственные виду P. trifolii и имеющие 99,9 % сходства с ним по rrs гену, были выделены из клубеньков эспарцета виколистного (Onobrychis viciifolia) [18], что говорит о широком спектре растений-хозяев у этой группы ризобий. Кластер Ib был образован изоля-
тами Tla-536 и Tla-538, идентифицированными как Phyllobacterium sp. и наиболее близкими к видам P. loti и P. trifolii (см. рис. 1, 2; табл. 1).
Rrs-кластер II был сформирован при низком уровне поддержки 54 % штаммами P. sophorae CCBAU03422T, P. brassicacearum STM 196T и изолятом Tla-540, который на atpD-дендрограмме не группировался с другими штаммами (см. рис. 1, 2). Сходство этого изолята по rrs-гену c ближайшими видами P. brassicacearum и P. zundukense составляло 99,3 % (см. табл. 1). На основании анализа полученных данных изолят Tla-540 был идентифицирован как Phyllobacterium sp.
Rrs-кластер III объединил изоляты Tla-537, Tla-543, Tla-544 и типовой штамм P. zundukense Tri-48T при уровне поддержки 88 % (см. рис. 1). На atpD-дендро-грамме (см. рис. 2) данные штаммы также образовали статистически достоверный кластер (уровень поддержки 100 %). С учетом высокой степени гомологии по генам rrs (99,9-100 %) и atpD (100 %) изоляты Tla-537, Tla-543, Tla-544 были идентифицированы как
Таблица 2
Гомология генов 16S рРНК и atpD у изолятов, выделенных из клубеньков Thermopsis lanceolata, и типовых штаммов ближайших видов Bosea и Rhizobium
Типовой штамм Локус Уровень гомологии с изолятами (%) Типовой штамм Локус Уровень гомологии с изолятами (%)
Tla-534 Tla-545 Tla-541 Tla-550 Tla-552
B. massiliensis LMG 26221T 16S рPНК 99,0 98,6 R. leguminosarum LMG 14904T 16S рPНК 99,8 99,8 99,8
atpD 92,4 95,6 atpD 93,5 93,7 93,7
B. lathyri LMG 26379T 16S рPНК 99,0 98,5 R. anhuiense CCBAU23252T 16S рPНК 99,8 99,8 99,8
atpD 91,9 94,0 atpD 96,8 97,0 97,0
B. vaviloviae Vaf18T 16S рPНК 98,9 98,5 R. laguerreae FB206T 16S рPНК 99,8 99,8 99,8
atpD 91,0 92,2 atpD 95,7 95,9 95,9
вид P. zundukense (см. табл. 1), который был недавно описан для микросимбионтов реликтового бобового растения остролодочника трехлистного (Oxytropis triphylla), произрастающего в Прибайкальском регионе [19]. Было показано, что штаммы P. zundukense, выделенные из клубеньков O. triphylla, по всей видимости, самостоятельно не вступают в симбиоз, поскольку не имеют общих nodABC генов, необходимых для нодуляции растений [19]. В настоящее время род Phyllobacterium представлен всего 11 видами, большая часть которых выделена из корневых клубеньков бобовых [16, 19-23], однако только у двух видов (P. trifolii и P. sophorae) были обнаружены nodACD и nifH гены, необходимые для эффективного симбиоза с растением-хозяином. Известно, что P. trifolii и P. sophorae способны самостоятельно образовывать клубеньки на растении-хозяине [16, 23, 24].
Быстрорастущие изоляты Tla-541, Tla-550 и Tla-552 были отнесены к роду Rhizobium и показали одинаковый уровень rrs-гомологии (99,8 %) сразу с тремя типовыми штаммами R. leguminosarum LMG 14904T, R. anhuiense CCBAU23252T и R. laguerreae FB206T, с которыми формировали общий кластер при уровне поддержки 98 % (см. рис. 1, табл. 2). На atpD-ден-дрограмме изоляты Tla-541, Tla-550 и Tla-552 кластеризовались только с типовым штаммом R. anhuiense CCBAU23252T при достаточно высоком уровне поддержки 83 % (см. рис. 2). Принимая во внимание значительное сходство гена atpD у штамма R. anhuiense CCBAU23252T и изолятов Tla-541, Tla-550 и Tla-552 (96,8-97,0 %), последние были отнесены к виду Rhizobium anhuiense (см. табл. 2). Штаммы этого вида был выделены из клубеньков бобов обыкновенных (Vicia faba) и гороха посевного (Pisum sativum), произрастающих в Китае [25]. Бактерии R. anhuiense являются также микросимбионтами чины японской Lathyrus japonicus [26]. Было показано, что для L. japonicus ха-
рактерна очень высокая способность к азотфиксации, особенно в условиях низких температур арктического и субарктического регионов, где данное растение рассматривается в качестве перспективной кормовой культуры [27]. В целом род Rhizobium составляет наиболее представительную группу семейства Rhizobiaceae, все виды которой способны фиксировать атмосферный азот и образовывать устойчивые симбиозы с бобовыми растениями [28].
Медленнорастущие изоляты Tla-534 и Tla-545 не сформировали на rrs- и atpD-дендрограммах статистически достоверных групп с другими штаммами (рис. 3, 4). По уровню гомологии гена rrs (см. табл. 2) изоляты Tla-534 и Tla-545 показали наибольшее сходство с типовыми штаммами рода Bosea: B. massiliensis LMG 26221T, B. lathyri LMG 26379T и B. vaviloviae Vaf18T (сходство 98,5—99,0 %). Исходя из полученных данных, оба изоля-та были идентифицированы как Bosea sp. С учетом полученных результатов можно предположить, что изоляты Tla-534 и Tla-545 могут относиться к новым видам рода Bosea. Этот род представлен в настоящее время девятью видами, из которых только четыре вида (B. lupini, B. lathyri, B. robiniae и B. vaviloviae) были выделены из клубеньков бобовых растений родов Lupinus, Lathyrus, Robinia и Vavilovia соответственно. Однако способность этих штаммов к самостоятельному формированию симбиозов до сих пор не изучена [7, 29, 30].
Таким образом, в результате исследования мы впервые получили бактериальные изоляты из корневых клубеньков бобового растения T. lanceolata. Были идентифицированы клубеньковые бактерии видов P. trifolii и R. anhuiense, представители которых образуют клубеньки на растениях, а также бактерии вида P. zundukense с пока не изученной способностью к самостоятельному формированию симбиоза. Изоля-ты, отнесенные к роду Bosea, по-видимому, могут быть представителями новых видов медленнорастущих риз-
5§г Bradyrhizobium huanghuaihaiense CCBAU 23303т (HQ231463)
99
0,01
Bradyrhizobium iriomotense LMG 24129T (AB300992) Bradyrhizobium arachidis CCBAU 051107T (HM107167)
i-Bradyrhizobium betae NBRC 103048T (AB681928)
]i— Bradyrhizobium cytisi CTAW11T (EU561065) 83^- Bradyrhizobium rífense CTAW711 (EU561074)
-Bradyrhizobium canariense BTA-1T (NR042177)
i— Bradyrhizobium daqingense CCBAU 15774T (HQ231274) 1 r- Bradyrhizobium japonicum USDA 6T (NR112552)
— Bradyrhizobium yuanmingense CCBAU 10071T (NR028768)
- Rhodopseudomonaspalustris ATCC 17001T (NR114498)
-Tardiphaga robiniae LMG 26467T (FR753034)
— Bradyrhizobium retamae LMG 27393T (KC247085)
Í Bradyrhizobium jicamae PAC68T (NR043036) bradyrhizobium lablabi CCBAU 23086T (GU433448) Bradyrhizobium pachyrhizi PAC48T (NR043037) 531—Bosea eneae LMG 26220T(NR028798) Bosea vestrisii LMG 26222T (LN995688) ■Bosea lupini LMG 26383T (NR108514)
-Bosea minatitlanensis AMX51T (AF273081)
Bosea thiooxidans LMG 26210T (NR114668) " Bosea massiliensis LMG 26221T (NR025118) -Bosea vaviloviae Vafl8T (NR136423) Tla-545 (MH779899) Bosea lathyri LMG 26379T (NR108515) Tla-534 (MH779891)
57l
Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изолятов, выделенных из клубеньков термопсиса ланцетного (Thermopsis lanceolata), а также представителей родственных видов Bosea. Полученные изоляты обозначены жирным шрифтом. Типовые штаммы отмечены литерой Т. Указаны уровни поддержки более 50 %
94
71
43 66
43
59
100
-Bradyrhizobium lablabi CCBAU 23086T (GU433473)
- Bradyrhizobium jicamae PAC68T (FJ428211) -Bradyrhizobium retamae Ro19T (KC247101)
37 40
84
93
- Bradyrhizobium cytisi CTAW11T (GU001613)
- Bradyrhizobium canariense bv genistearum BTA-1T (AY386739) -Bradyrhizobium pachyrhizi PAC48T (FJ428208)
- Bradyrhizobium yuanmingense CCBAU 10071T (AY386760) Bradyrhizobium iriomotense EK05T (AB300994)
- Bradyrhizobium arachidis CCBAU 051107T (GU433475)
-Bradyrhizobium daqingense CCBAU 15774T (HQ231289)
Bradyrhizobium huanghuaihaiense CCBAU 23303T (HQ231682)
- Bradyrhizobium rifense CTAW71T (GU001617)
i-Bradyrhizobium japonicum USDA 6T (HQ231681)
54l-Bradyrhizobium betae NBRC 103048х (FM253129)
Bosea thiooxidans LMG 26210х (FR871211)
-Bosea vaviloviae Vaf18T (CP017147)
-Bosea eneae LMG 26220T (FR871205)
-Tla-534 (MK135052)
55
0,02
77
- Bosea vestrisii LMG 26222T (FR871212) -Bosea lathyri LMG 26379T (FR871206)
- Tla-545 (MK135060)
-Bosea massiliensis LMG 26221T (FR871209)
-Bosea lupini LMG 26383T (FR871207)
Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов atpD изолятов, выделенных из клубеньков термопсиса ланцетного (Themopsis lanceolata), а также представителей родственных видов Bosea. Полученные изоляты обозначены жирным шрифтом. Типовые штаммы отмечены литерой Т. Указаны уровни поддержки более 30 %
обий. Следует отметить, что для уточнения таксономического положения 9 из 14 полученных изолятов был успешно использован анализ гена atpD, благодаря которому нам удалось описать новые виды P. zundukense и B. vaviloviae [7, 19]. Создание и изучение коллекции микросимбионтов термопсиса ланцетного позволит в дальнейшем создать предпосылки для повышения эффективности промышленного возделывания этой ценной лекарственной культуры.
Работа выполнена в рамках государственного задания ФАНО России (тема № 0664-2018-0001). Сек-венирование гена atpD проведено при поддержке РНФ (грант № 16-16-00080). Долгосрочное хранение штаммов осуществляется за счет средств, выделенных на Программу по развитию и инвентаризации биоресурсных коллекций научными организациями.
ЛИТЕРАТУРА
1. Проворов Н.А., Воробьев Н.И. Генетические основы эволюции растительно-микробного симбиоза. — СПб.: Информ-Навигатор, 2012. [Provo-rov NA, Vorob'ev NI. Geneticheskie osnovy evolyutsii rastitel'no-mikrobnogo simbioza. Saint Petersburg: Inform-Navigator; 2012. (In Russ.)]
2. Мальцев А.И. Атлас важнейших видов сорных растений СССР. — М.; Ленинград: ОГИЗ Сельхоз-гиз, 1939. [Mal'tsev AI. Atlas vazhneyshikh vidov sornykh rasteniy SSSR. Moscow, Leningrad: OGIZ Sel'khozgiz; 1939. (In Russ.)]
3. Shakirov TT, Sabirov KA. The production of cyisine from the seeds of Thermopsis lanceolata. Chem Nat Compd. 1970;6(6):733-734. https://doi.org/10.1007/ BF00565346.
4. Tutka P, Zatonski W Cytisine for the treatment of nicotine addiction: from a molecule to therapeutic efficacy. Pharmacol Rep. 2006;58(6):777-798.
5. Рабинович М.И. Лекарственные растения в ветеринарной практике. — М.: Агропромиздат, 1987. [Rabi-novich MI. Lekarstvennye rasteniya v veterinarnoy praktike. Moscow: Agropromizdat; 1987. (In Russ.)]
6. Novikova N, Safronova V. Transconjugants of Agrobac-terium radiobacter harbouring sym genes of Rhizobium galegae can form an effective symbiosis with Medica-go sativa. FEMS Microbiol Lett. 1992;72(3):261-268. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1992.tb05107.x.
7. Safronova VI, Kuznetsova IG, Sazanova AL, et al. Bosea vaviloviae sp. nov., a new species of slow-growing rhizobia isolated from nodules of the relict species Vavilovia formosa (Stev.) Fed. Antonie Van Leeuwenhoek. 2015;107(4):911-920. https://doi. org/10.1007/s10482-015-0383-9.
8. Gaunt MW, Turner SL, Rigottier-Gois L, et al. Phy-logenies of atpD and recA support the small subunit rRNA-based classification of rhizobia. Int J Syst Evol
Microbiol. 2001;51(Pt 6):2037-2048. https://doi. org/10.1099/00207713-51-6-2037.
9. Martens M, Dawyndt P, Coopman R, et al. Advantages of multilocus sequence analysis for taxonomic studies: a case study using 10 housekeeping genes in the genus Ensifer (including former Sinorhizobium). Int J Syst Evol Microbiol. 2008;58(Pt 1):200-214. https://doi.org/10.1099/ijs.0.65392-0.
10. Stepkowski T, Zak M, Moulin L, et al. Bradyrhizo-bium canariense and Bradyrhizobium japonicum are the two dominant rhizobium species in root nodules of lupin and serradella plants growing in Europe. Syst Appl Microbiol. 2011;34(5):368-375. https://doi. org/10.1016/j.syapm.2011.03.002.
11.Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol. 2011;28(10):2731-9. https://doi.org/10.1093/molbev/msr121.
12. Safronova V, Tikhonovich I. Automated cryobank of microorganisms: Unique possibilities for long-term authorized depositing of commercial microbial strains. In: Microbes in applied research: current advances and challenges. Ed. by A. Mendez-Vilas. Hackensack: World Scientific Publishing Co; 2012. P. 331-334. https://doi.org/10.1142/9789814405041_0066.
13. Убугунова В.И. Экологические условия формирования почв речных пойм Монголии и их свойства: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. — Иркутск, 1999. [Ubugunova VI. Ekologicheskie usloviya formirovaniya pochv rechnykh poym Mongolii i ikh svoystva. [dissertation] Irkutsk; 1999. (In Russ.)]
14. Белозерцева И.А., Сороковой А.А., Доржготов Д., и др. Почвы бассейна озера Байкал и их картографирование на территории России и Монголии // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2014. - № 5-2. - С. 114-120. [Belozertseva IA, Sorokovoy AA, Dorzhgotov D, et al. Ground of pool of lake baikal and their mapping in territory of Russia and Mongolia. Mezhdunarodnyy zhurnal prikladnykh i fundamental'nykh issledo-vaniy. 2014;(5-2):114-120. (In Russ.)]
15.Шишов Л.Л., Тонконогов В.Д., Лебедева И.И., Герасимова М.И. Классификация и диагностика почв России. - Смоленск: Ойкумена, 2004. [Shishov LL, Tonkonogov VD, Lebedeva II, Gerasimova MI. Klassifikatsiya i diagnostika pochv Rossii. Smolensk: Oykumena; 2004. (In Russ.)]
16. Valverde A, Velazquez E, Fernandez-Santos F, et al. Phyllobacterium trifolii sp. nov, nodulating Trifolium and Lupinus in Spanish soils. Int J Syst Evol Microbiol. 2005;55(Pt 5):1985-1989. https://doi. org/10.1099/ijs.0.63551-0.
17. Zamlynska K, Komaniecka I, Zebracki K, et al. Studies on lipid A isolated from Phyllobacterium trifolii
PETP02(T) lipopolysaccharide. Antonie Van Leeu-wenhoek. 2017;110(11):1413-1433. https://doi. org/l0.1007/s10482-017-0872-0.
18. Baimiev AK, Baimiev AK, Gubaidullin II, et al. Bacteria closely related to Phyllobacterium trifolii according to their 16S rRNA gene are discovered in the nodules of Hungarian sainfoin. Russ J Genet. 2007;43(5):587-90. https://doi.org/10.1134/S1022795407050146.
19. Safronova VI, Sazanova AL, Kuznetsova IG, et al. Phyllobacterium zundukense sp. nov., a novel species of rhizobia isolated from root nodules of the legume species Oxytropis triphylla (Pall.) Pers. Int J Syst Evol Microbiol. 2018;68(5):1644-1651. https://doi. org/10.1099/ijsem.0.002722.
20. Mantelin S, Saux MF, Zakhia F, et al. Emended description of the genus Phyllobacterium and description of four novel species associated with plant roots: Phyllobacterium bourgognense sp. nov., Phyllobacterium ifriqiyense sp. nov, Phyllobacterium leguminum sp. nov. and Phyllobacterium brassicacearum sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol. 2006;56(Pt 4):827-839. https://doi.org/10.1099/ijs.0.63911-0.
21. Flores-Felix JD, Carro L, Velazquez E, et al. Phyllobacterium endophyticum sp. nov., isolated from nodules of Phase-olus vulgaris. Int J Syst Evol Microbiol. 2013;63(Pt 3): 821-6. https://doi.org/10.1099/ijs.0.038497-0.
22. Sanchez M, Ramirez-Bahena MH, Peix A, et al. Phyllobacterium loti sp. nov. isolated from nodules of Lotus corniculatus. Int J Syst Evol Microbiol. 2014;64(Pt 3): 781-6. https://doi.org/10.1099/ijs.0.052993-0.
23. Jiao YS, Yan H, Ji ZJ, et al. Phyllobacterium sopho-rae sp. nov, a symbiotic bacterium isolated from root nodules of Sophora flavescens. Int J Syst Evol Microbiol. 2015;65(Pt 2):399-406. https://doi.org/10.1099/ ijs.0.067017-0.
24. Zhao L, Deng Z, Yang W, et al. Diverse rhizobia associated with Sophora alopecuroides grown in different regions of Loess Plateau in China. Syst Appl Micro-
biol. 2010;33(8):468-477. https://doi.Org/l0.1016/j. syapm.2010.08.004.
25. Zhang YJ, Zheng WT, Everall I, et al. Rhizobium an-huiense sp. nov, isolated from effective nodules of Vicia faba and Pisum sativum. Int J Syst Evol Microbiol. 2015;65(9):2960-7. https://doi.org/l0.1099/ijs.0.000365.
26. Li Y, Wang ET, Liu Y, et al. Rhizobium anhuiense as the predominant microsymbionts of Lathyrus mariti-mus along the Shandong Peninsula seashore line. Syst Appl Microbiol. 2016;39(6):384-390. https://doi. org/l0.1016/j.syapm.2016.07.001.
27. Gurusamy C, Bal A, McKenzie D. Nodulation of beach pea (Lathyrus maritimus [L.] Bigel.) induced by different strains of rhizobia. Can J Plant Sci. 1999;79(2):239-42. https://doi.org/l0.414l/P98-039.
28. Alves LM, de Souza JAM, Varani AM, Lemos EGM. The family Rhizobiaceae. In: The Prokaryotes. Ed. by E. Rosenberg, E.F. DeLong, S. Lory, et al. Berlin, Heidelberg: Springer; 2014.P. 419-437. https://doi. org/l0.1007/978-3-642-30197-1_297.
29. De Meyer SE, Willems A. Multilocus sequence analysis of Bosea species and description of Bosea lupini sp. nov, Bosea lathyri sp. nov. and Bosea robiniae sp. nov., isolated from legumes. Int J Syst Evol Microbiol. 2012;62(Pt 10):2505-10. https://doi.org/10.1099/ ijs.0.035477-0.
30. Сазанова А.Л., Кузнецова И.Г., Сафронова В.И., и др. Изучение генетического разнообразия микросимбионтов копеечника щетинистого Hedysarum gmelinii subsp. setigerum, произрастающего в Прибайкалье // Сельскохозяйственная биология. — 2017. - Т. 52. - № 5. - C. 1004-1011. [Sazanova AL, Kuznetsova IG, Safronova VI, et al. Study of the genetic diversity of microsymbionts isolated from Hedysarum gmelinii subsp. setigerum, growing in the Baikal lake region. Selskokhoziaistvennaia Biol. 2017;52(5):1004-1011. (In Russ.)]. https://doi. org/10.15389/agrobiology.2017.5.1004rus.
Ш Информация об авторах
Денис Сергеевич Карлов — канд. биол. наук, младший научный сотрудник ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии», Пушкин, Санкт-Петербург. SPIN: 8355-8091. E-mail: [email protected].
Анна Львовна Сазанова — канд. биол. наук, старший научный сотрудник ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии», Пушкин, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
Ирина Геннадьевна Кузнецова — инженер-исследователь ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии», Пушкин, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
à Information about the authors
Denis S. Karlov — PhD, Junior Researcher, Russian Collection of Agricultural Microorganisms. All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Pushkin, St. Petersburg, Russia. SPIN: 8355-8091. E-mail: [email protected].
Anna L. Sazanova — PhD, Senior Researcher, Russian Collection of Agricultural Microorganisms. All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Pushkin, St. Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].
Irina G. Kuznetsova — Engineer-Researcher, Russian Collection of Agricultural Microorganisms. All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Pushkin, St. Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].
Ф Информация об авторах
Вера Игоревна Сафронова — канд. биол. наук, заведующая ведомственной коллекцией полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии», Пушкин, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
Нина Юрьевна Тихомирова — научный сотрудник ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии», Пушкин, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
Жанна Павловна Попова — канд. биол. наук, старший научный сотрудник ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии», Пушкин, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
Юрий Сергеевич Оследкин — канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии», Пушкин, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
Алла Васильевна Верхозина — канд. биол. наук, руководитель группы «Гербарий» отдела устойчивости наземных экоситем. ФГБУН «Сибирский институт физиологии и биохимии растений» СО РАН, Иркутск. E-mail: [email protected].
Андрей Алексеевич Белимов — д-р биол. наук, заведующий лабораторией ризосферной микрофлоры. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии», Пушкин, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].
Ф Information about the authors
Vera I. Safronova - PhD, Head, Russian Collection of Agricultural Microorganisms. All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Pushkin, St. Petersburg, Russia. E-mail: v.safronova@ rambler.ru.
Nina Y. Tikhomirova - Researcher, Russian Collection of Agricultural Microorganisms. All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Pushkin, St. Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].
Zhanna P. Popova — PhD, Senior Researcher, Russian Collection of Agricultural Microorganisms. All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Pushkin, St. Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].
Yuriy S. Osledkin — PhD, Leading Researcher, Russian Collection of Agricultural Microorganisms. All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Pushkin, St. Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].
Alla V. Verkhozina — PhD, Head of The Herbarium Group, Department of Terrestrial Ecosystems Resistance. Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry (SIPPB), Irkutsk, Russia. E-mail: [email protected].
Andrey A. Belimov — DrSci, Head of Laboratory of Rhizosphere Microflora. All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Pushkin, St. Petersburg, Russia. E-mail: belimov@ rambler.ru.
