CC BY
98
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
9. Шумилов К. В., Калмыков В. В., МихайловаЮ. П. и др. // Ветеринария. — 1996. — № 5. — C. 55—59.
10. Al Dahouk S., Le Fleche P., Nockler K. et al. // J. Microbiol. Meth. —2007. — Vol. 69. — P. 137—145.
11. Alton G. G., Jones L. M., Angus R. D. et al. // Techniques for the brucellosis laboratory. — Paris, 1988. — Р. 54—58.
12. Bikandi J., San Millan R., Rementeria A. et al. // Bioinformatics. — 2004. —Vol. 20. — P. 798—799.
13. Boom R., Sol C. J., Salimans M. M. et al. // J. Clin. Microbiol. — 1990. — Vol. 28. — P. 495—503.
14. BrickerB. J., EwaltD. R. // Bio. Med. Centr. Microbiol. — 2005. — Vol. 5. — P. 37.
15. ForbesL. B. // Can. Vet. J. — 1991. — Vol. 32, N 11. — P. 686—688.
16. Halling S. M., Peterson-Burch B. D., Bricker B. J. et al. // J. Bacte-riol. —2005. — Vol. 187. — P. 2715—2726.
17. Her M., Kang S. I., Kim J. W. et al. // J. Microbiol. Biotechnol. —2010. — Vol. 20. — P. 1750—1755.
18. Hunter P. R., Gaston M. A. // J. Clin. Microbiol. — 1988. — Vol. 26. — P. 2465—2466.
19. Jiang H., Mao L. L., Zhao H. Y. et al. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. — 2010. — Vol. 104, N 12. — P. 796—800.
20. Jiang H., Mao L. L, Zhao H.Y. et al. // Vet. Microbiol. — 2012. — Vol. 154, N 3—4. — P. 419—421.
21. Kang S. I., Heo E. J., Cho D. et al. // J. Vet. Med. Sci. — 2011. — Vol. 73, N 6. — P. 779—786.
22. Kulakov Y. K., Zheludkov M. M., Sclyarov O. D. // Vaccine. — 2010. — Vol. 28 (suppl 5). — P. 41—45.
23. Le Fleche P., Jacques I., Grayon M. et al. // Bio. Med. Centr. Microbiol. — 2006. — Vol. 6. — P. 9.
24. MaquartM., Le Fleche P., Foster G. et al. // Bio. Med. Centr. Microbiol. — 2009. — Vol. 9. — P. 145.
25. Microorganisms tandem repeats database. http://minisatellites.u-psud.fr.
26. Nockler K., Maves R., Cepeda D. et al. // J. Clin. Microbiol. — 2009. — Vol.47, N 10. — P. 3147—3155.
27. Nomura A , Imaoka K., Imanishi H. et al. // Emerg. Infect. Dis. —2010.—Vol. 16, N 7. — P. 1183—1185.
28. ReesR. K., GravesM., CatonN. et al. // J. Microbiol. Meth. —2009. — Vol.78, N 1. — P. 66—70.
29. Sayan M., Erdenlig S., Stack J. et al. // Jpn. J. Infect. Dis. — 2011. — Vol. 64, N 6. — P. 516—519.
30. Strom Holst B., Lofqvist K., Ernholm L. et al. // Acta Vet. Scand. — 2012. — Vol. 54, N 1. — P. 18.
31. Tiller R. V, De B. K., Boshra M. et al. // J. Clin. Microbiol. — 2009. — Vol.47, N 7. — P.2226—2231.
32. Valdezate S., Navarro A., Villalon P. et al. // J. Clin. Microbiol. — 2010. — Vol.48, N 8. — P. 2734—2740.
33. Wattam A. R., Williams K. P., Snyder E. E. et al. // J. Bacteriol. — 2009. — Vol. 191. — P. 3569—3579.
34. Whatmore A. M., Shankster S. J., Perrett L. L. et al. // J. Clin. Microbiol. — 2006. — Vol. 44. — P. 1982—1993.
35. ZheludkovM. M., TsirelsonL. E. // Biol. Bull. — 2010. — Vol. 37, N 7. — P. 709—715.
Поступила 24.05.12
MOLECULAR-GENETIC CHARACTERIZATION OF CANINE AND RANGIFERINE BRUCELLA ISOLATES FROM DIFFERENT REGIONS OF RUSSIA
Y. K. Kulakov, L. E. Tsirelson, M. M. Zheludkov
Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, Moscow, Russia Goal. Comparative molecular-genetic characterization of Brucella isolates from dogs and reindeers in Russia by molecular-genetic typing methods.
Materials and methods. 19 canine and 2 rangiferine Brucella isolates were studied by molecular typing methods based on PCR for differential species and biovar specific molecular targets and MLVA (multiple locus variable number tandem repeats analysis) using primers to 12 known variable loci.
Results. Using PCR for differential molecular targets, canine Brucella isolates were characterized as B. canis and rangiferine isolates as B. suis biovar 4. MLVA revealed 5 identical and 7 variable MLVA loci. Using the dendrogram, all the isolates on the data of 12 loci were classified into the close related cluster. On the other hand, high discrimination power of MLVA with a resulting Hunter and Gaston discriminatory index (HGDI) of 0.9842 was shown to reveal genetic diversity for the isolates of 17 MLVA genotypes.
Conclusion. B. canis and B. suis isolates from different geographical regions in Russia were genetically close related, thereby confirming known genetic relationship between these species. Related MLVA genotypes of isolates were connected to certain regions of preliminary isolation in Russia. To improve the system of brucellosis surveillance in Russia MLVA typing of more canine and rangiferine Brucella isolates having epidemiological danger for humans is required to be studied. Key words: Brucellosis, isolates, Brucella canis, Brucella suis, identification, PCR, MLVA (multiple locus variable number tandem repeats analysis)
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.98:578.823.91
Е. В. Жираковская1, Р. Х. Аксакова2, М. Г. Горбунова3, А. Ю. Тикунов1, А. М. Курильщиков1,
С. Н. Соколов2, С. В. Нетесов2, Н. В. Тикунова1
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ИЗОЛЯТОВ РОТАВИРУСОВ ГРУППЫ А, ВЫЯВЛЕННЫХ В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ В 2007—2011 ГГ.
1Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск; 2Новосибирский государственный университет; 3Управление Роспотребнадзора по Омской области, Омск
Проведен генетический анализ изолятов ротавируса группы А, выявленных в фекалиях детей, госпитализированных в стационары Новосибирска и Омска в течение 4 эпидемических сезонов: 2007, 2007/08, 2009/10, 2010/11. Методом мультиплексной ПЦР генотипировано 1416 изолятов ротавируса группы А. Показано, что в 2007—2011 гг. в Западной Сибири социркулировали изоляты широко распространенных генотипов G1P[8], G4P[8], G2P[4], G3P[8]. В единичных случаях определены генотипы G9P[8], G2P[8], G3P[9] и G4P[6]. В 2008 г. в Омске, а в 2009 г. в Новосибирске произошла замена доминирующего генотипа G1P[8] генотипом G4P[8]. Встречаемость и спектр циркулировавших генотипов различались и изменялись каждый эпидемический сезон в обоих городах. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 3 фрагментов генома, кодирующих белки VP4 (VP8*), VP7 и VP6, показал, что боль-
шинство новосибирских и омских изолятов кластеризовались вместе и демонстрировали высокую степень гомологии с изо-лятами, выявленными в других регионах Евразии. Кроме того, впервые в Новосибирске обнаружены 14 изолятов ротавируса (генотипов G9, G1 и G4), относящихся к редкой сублинии P[8]b (OP354-like) гена, кодирующего белок VP4, а в Омске — единственный изолят Omsk08-381/G9P[8]b. Результаты, полученные в этом исследовании, указывают на необходимость длительного мониторинга изолятов ротавируса, циркулирующих на территории Западной Сибири, что важно при выборе ротавирусной вакцины для иммунизации детей раннего возраста, совершенствования диагностических наборов для этой инфекции, а также для понимания эпидемиологии и эволюции ротавирусов группы А. Ключевые слова: ротавирусы группы А, VP4, VP6, VP7, дети, генотипирование, филогенетический анализ
33
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №4, 2012
Ротавирусы группы А входят в род Rotavirus семейства Reoviridae и вызывают гастроэнтериты у птиц и млекопитающих, в том числе у многих домашних животных и человека [12]. Геном ротавируса состоит из 11 фрагментов двухцепочечной РНК, каждый из которых кодирует отдельный белок, за исключением 11-го фрагмента, кодирующего 2 неструктурных белка. Вирусная частица имеет трехслойный икосаэдрический капсид диаметром около 70 нм. На поверхности структурного белка внутреннего капсида VP6 находятся антигенные детерминанты, определяющие групповую (A—G) специфичность ротавируса. Человек инфицируется в основном ротавирусами группы А (до 90%), намного реже ротавирусами групп С и В [1, 8]. Двойная система классификации ротавирусов группы А основана на структурных белках VP7 (G-генотип) и VP4 (P-генотип) внешнего капсида, которые в организме человека вызывают выработку вируснейтрализующих антител и определяют, таким образом, индуцирование противовирусного иммунитета [8]. К настоящему времени различают 27 G- и 35 P-генотипов ротавируса группы А. Из них 13 G- и 16 P-генотипов обнаруживают у ротавирусов человека [13], причем в человеческой популяции одновременно циркулируют ротавирусы различных типов. Наиболее широко в мире распространены комбинации G1P[8], G3P[8], G4P[8], G9P[8] и G2P[4]. Также выявляют некоторое количество нети-пируемых штаммов [15, 18]. Кроме того, по результатам филогенетического анализа последовательностей 6-го фрагмента генома у ротавирусов группы А выделяют 16 генотипов последовательностей, кодирующих белок VP6, при этом у ротавирусов человека чаще всего выявляют I1 и I2 генотип VP6 [13]. Существуют значительные географические различия в распространенности ротавирусов разных генотипов, причем с течением времени происходит изменение встречаемости генотипов на одной и той же территории.
Ротавирусная инфекция занимает важное место в структуре заболеваемости детей и взрослых в развитых странах и лидирует в заболеваемости и смертности детей раннего возраста от острых кишечных инфекций в развивающихся странах [11]. Ротавирусный гастроэнтерит распространен повсеместно и наиболее часто обусловливает развитие тяжелой дегидратации у детей первых лет жизни. У взрослых заболевание часто протекает в легкой форме. Ротавирусная инфекция характеризуется высокой контагиозностью, и практически каждый ребенок переносит ее к 3-летнему возрасту [1, 10]. При этом формируется типоспецифический иммунитет, который усиливается с каждым реинфицированием и эффективно предотвращает развитие тяжелой формы ротавирусной инфекции, вызванной другим типом ротавируса [1, 15]. В настоящее время существуют 2 лицензированные ротавирусные вакцины. Живая вакцина RotaTeq® ("Merck & Co., Inc".) содержит 5 генетически модифицированных бычьих штаммов с капсидными белками человеческих ротавирусов серотипов G1, G2, G3, G4 и P[8]. Другая живая аттенуированная вакцина Rotarix® ("GSK Biologicals") создана на основе человеческого штамма серотипа G1P[8]. Эти вакцины уже введены в национальные программы иммунизации ряда стран Америки и Европы. Согласно результатам эпидемиологических исследований, применение этих вакцин позволило значительно сокра-
тить риск тяжелых случаев заболевания и уменьшить частоту госпитализаций [11].
Целью данной работы был генетический анализ изолятов ротавируса группы А, циркулировавших в Западной Сибири в течение 4 эпидемических сезонов: 2007, 2007/08, 2009/10, 2010/11 гг. Генотипирование ротавирусов в настоящее время является неотъемлемым компонентом вирусологического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за ротавирусной инфекцией для установления смены доминирующего G[P]-генотипа ротавируса и расшифровки вспышек в организованных коллективах. Кроме этого, при выборе ротавирусной вакцины для иммунизации детей раннего возраста необходима информация о генетическом спектре ротавирусов, распространенных в данном регионе.
Материалы и методы
Материалом для исследования служили пробы фекалий детей раннего возраста с клиническими проявлениями острого гастроэнтерита, госпитализированных в стационары Новосибирска и Омска в период с января 2007 г. по май 2011 г. Образцы фекалий собирали в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры при поступлении пациентов в стационар, чтобы исключить внутрибольничное инфицирование. Образцы хранили при -20°С. Материал транспортировали с соблюдением условий "холодовой цепи".
Детекция. Нуклеиновые кислоты из 20% осветленных фекальных экстрактов выделяли методом аффинной сорбции на силикагеле, используя набор реагентов РИБО-сорб ("ИнтерЛаб-Сервис", Россия) согласно инструкции производителя. Выявление РНК ротавирусов группы А проводили методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией с применением набора реагентов АмплиСенс Rotavims/Norovirus/Astrovirus-FL ("ИнтерЛабСервис", Россия), амплификатора MAXYGENE ("Axygen", США) и флюоресцентного ПЦР-детектора ДЖИН (ООО "НПО ДНК-Технология", Россия).
Генотипирование. Комплементарную ДНК (кДНК) получали методом обратной транскрипции на матрице РНК ротавирусов, используя набор реагентов РЕВЕРТА-L ("ИнтерЛабСервис", Россия). G[P]-генотип ротавируса определяли методом двухраундо-вой мультиплексной ПЦР со смесью типоспецифических праймеров согласно описанию в работах [7, 10, 11]. Для G-типирования в первом раунде амплифицировали кДНК девятого фрагмента генома ротавируса, кодирующего гликопротеин VP7 (праймеры Beg9, 9Con2) [7, 11]. Для P-типирования в первом раунде амплифици-ровали кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующей домен VP8* белка VP4 (праймеры 4Con3, 4Con2) [10]. Второй раунд амплификации проводили со смесями праймеров, специфических для генотипов G1, G2, G3, G4, G9 (9Con1 и 9Т-1, 9Т-2, 9Т-3р, 9Т-4, 9Т-9В) и P[4], P[6], P[8], P[9], P[10], P[11] (4Con3 и 1Т-1,2Т-1, 3Т-1,4Т-1, 5Т-1, ND2). [7, 10, 11].
Анализ продуктов амплификации выполняли посредством разделения фрагментов ДНК в 1,5% агарозном геле в трис-боратном буфере, содержащем 0,1% бромида этидия. При наличии более одного специфического ампликона в одном образце определяли смесь генотипов ротавируса.
Секвенирование. Для амплификации 9-го и 4-го фрагментов генома использовали праймеры для ПЦР (Beq9 и 9Con2, 9Con1 и End9, 4Con3 и 4Con2 соответственно). Для амплификации 4-го фрагмента генома нетипируемых изолятов были использованы праймеры VP4F (132—149 н.) и VP4R (775—795 н.) [16]. Для амплификации 6-го фрагмента генома использовали праймеры VP6-Beg6 5'-GGCTTTTAAACGAAGTCTTC (1—20 н.) и VP6-757R 5'-GGATTAAAGAACCATGTAG (775—757 н.), VP6-523F 5'-ATAGATCTCAACCAATGCATG (523—543 н.), и VP6-End6 5'-GGTCACATCCTCTCACTA (1356—1339 н.). Ампликоны очищали разделением в 0,6% агарозном геле с использованием SeaKem®GTG™Agarose ("Lonza Group Ltd.") в трис-ацетатном буфере и последующей пассивной элюцией из фрагмента геля. Реакцию Сэнгера проводили с использованием набора Big
34
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Dye® Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit ("Applied Biosystems", США) с каждым из праймеров, от невключившейся флюоресцентной метки продукты реакции очищали гель-фильтрацией, используя Centri-Sep™ Spin Columns ("Princeton Separations, Inc."). Нуклеотидные последовательности фрагментов генома определяли в ЦКП СО РАН "Геномика" на геномном автоматическом анализаторе GA 3130xl ("Applied Biosystems", США) в Центре коллективного пользования ИХБФМ СО РАН.
Филогенетический анализ. Определенные нуклеотидные последовательности редактировали с помощью приложения SeqMan II программы DNASTAR Lasergene 7.0. Сравнение этих последовательностей с ранее опубликованными выполняли с использованием программы NCBI BLAST 2.2.26. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей и построения филограмм использовали программу MEGA 5.1. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей исследуемых фрагментов генома проводили методом Neighbor-Joining по двухпараметрической модели Кимуры. Показатели статистической надежности узлов филогенетических древ рассчитаны с помощью бутстреп-анализа с использованием 1000 случайных реплик.
На проведение данного исследования было получено одобрение Этического комитета при ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" (регистрационный номер IRB00001362, FWA00000621).
Результаты и обсуждение
Выявление и генотипирование ротавирусов группы А. Новосибирск и Омск с населением около 1,5 и 1,15 млн человек соответственно являются крупнейшими промышленными центрами и транспортными узлами Западной Сибири. Это предполагает высокую вероятность обнаружения большинства генетических вариантов ротавирусов группы А, циркулирующих на территории Западной Сибири в популяциях жителей этих городов. Наши многолетние исследования ротавирусной инфекции в Новосибирске и Омске показали, что спорадические случаи ротавирусного гастроэнтерита регистрируются на протяжении всего года с выраженным сезонным подъемом заболеваемости с ноября по май [2—5]. В связи с этим для анализа молекулярно-генетического разнообразия ротавирусов группы А, выделенных в этих городах, выбраны четыре эпидемических сезона, охватывающие периоды ежегодного подъема заболеваемости ротавирусной инфекции (см. таблицу).
В настоящей работе исследовали образцы фекалий от 4323 детей, госпитализированных в Новосибирске и Омске с диагнозом острой кишечной инфекции. Методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией ротавирусы группы А были выявлены в 1761 образце, что составило около 40%. Этот результат согласуется с полученными нами ранее данными о
выявлении ротавирусного гастроэнтерита у 23—45% детей, госпитализированных с острыми кишечными инфекциями в Новосибирске и Омске [2—5].
Методом мультиплексной ПЦР провели молекулярно-генетический анализ 1416 (80,4%) изолятов ротавируса и идентифицировали 8 различных G[P]-генотипов. Большую часть из них (78,5%) представляли широко распространенные генотипы G4P[8] (46%), G1P[8] (22%), G2P[4] (6,4%), G3P[8] (4,1%), G2P[8] (0,4%) (см. таблицу). Кроме того, в 6 пробах был выявлен ротавирус генотипа G9P[8] (0,4%, II эпидемический сезон), и в единичных образцах из Омска были обнаружены изоляты редкого в Западной Сибири генотипа G4P[6] и редкого во всем мире генотипа G3P[9]. В 28 (2%) клинических пробах выявили смесь G-генотипов G1G4P[8], G1G3P[8], G1G2P[8], G2G4P[8], G1G2P[4], G4G2P[4]. В каждый эпидемический сезон было всего несколько таких случаев, при этом наблюдались сочетания самых распространенных в каждый период генотипов. Эти результаты согласуются с опубликованными ранее данными, полученными в других эпидемиологических исследованиях, когда также были зафиксированы случаи выявления нескольких генотипов ротавируса группы А в пробе от одного пациента [15].
При ПЦР-типировании с использованием указанных праймеров у 4,9% изолятов ротавируса не определился Р-тип, у 8,1% изолятов — G-тип, а в 5,2% случаев — оба генотипа. При этом G-тип не был идентифицирован у ротавирусов генотипов GxP[8], GxP[6] и GxP[4]. Р-тип не был определен у ротавирусов с генотипами G1P[x], G4P[x], G2P[x] и G3P[x]. Поскольку ротавирусы имеют высокий уровень генетической изменчивости, одной из причин выявления нетипируемых изолятов могло быть наличие точечных замен в праймерсвязывающих сайтах генов, кодирующих белки VP7 и VP4 [18]. Следует также отметить, что в нашем исследовании не использовались праймеры, специфические для редко встречающихся генотипов G12, G8 и G5.
Многолетний мониторинг генотипов ротавирусов показал, что в Новосибирске с 2003 по 2009 г., как и в большинстве регионов мира, наиболее часто встречающимися были ротавирусы генотипа G1P[8] [4, 5]. В результате анализа динамики выявления различных генотипов в исследуемый период обнаружено, что в Новосибирске в III эпидемическом сезоне произошла смена доминирующего генотипа G1P[8] на G4P[8] (рис. 1). В Омске такая смена произошла раньше, и ротавирусы генотипа G4P[8] преобладали уже во II
Генотипы ротавирусов группы А, выявленные в течение 4 эпидемических сезонов в Западной Сибири
Город Сезон Период Изоляты, n Генотип ротавируса, n
G1P[8] G3P[8] G4P[8] G2P[4] G9P[8] G2P[8] G4P[6] G3P[9] другой НТ
Новоси- I 01.2007—03.2007 42 33 1 1 1 0 0 0 0 0 6
бирск и 09.2007—05.2008 219 84 24 24 41 6 0 0 0 4 36
III 09.2009—05.2010 184 43 2 102 11 0 1 0 0 5 20
IV 09.2010—05.2011 402 38 21 243 0 0 2 0 0 10 88
Омск I 01.2007—03.2007 89 50 0 9 9 0 0 1 0 1 19
II 09.2007—05.2008 158 27 5 64 28 1 0 0 1 5 27
III 09.2009—05.2010 180 20 3 126 0 0 0 1 0 0 30
IV 09.2010—05.2011 142 16 2 86 0 0 3 0 1 3 31
Примечание. Другой — смесь генотипов; НТ — нетипируемые.
35
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №4, 2012
G1 Р[8]
G4P[8]
G3P[8]
G2P[4]
□ Другие
Рис. 1. Динамика выявления ротавирусов основных генотипов в Новосибирске и Омске в течение 4 эпидемических сезонов.
Другие — G9P[8], G2P[8], G4P[6], G3P[9], нетипируемые изоляты и смесь генотипов.
эпидемическом сезоне. После смены доминирующего генотипа ротавирусы генотипа G1P[8] стали в обоих городах вторыми по встречаемости.
Секвенирование. Для детального генетического анализа были секвенированы полные последовательности 6-го и 9-го фрагментов генома и вариабельная часть 4-го фрагмента генома 67 изолятов ротавируса А, выявленных в разные эпидемические сезоны в Новосибирске и Омске. Полученные нуклеотидные последовательности зарегистрированы в базе данных GenBank NCBI, номера доступа указаны на рис. 2—4. На основе выровненных нуклеотидных последовательностей методом Neighbor-Joining были построены отдельные филограммы для трех исследуемых фрагментов генома. Значения индекса бутстреп-анализа менее 70% (BV — bootstrap value) на рисунках не приведены.
Филогенетический анализ последовательностей, кодирующих белок VP4. Нуклеотидные последовательности вариабельной части 4-го фрагмента генома (89 п. н.), которая кодирует домен VP8* (10—900 н.) капсидного белка VP4, мы сравнили с доступными в GenBank NCBI последовательностями, включая референсные штаммы Wa/P[8], OP354/P[8], WI61/P[8], DS-1/P[4], KO-2/P[4], ST3/P[6], AU-1/P[9] и вакцинные RotaTeq-WI79-4/P[8], Rotarix-A41CB052A/P[8] (номера доступа в базе данных GenBank указаны на рис. 2). Филогенетический анализ показал, что выявленные изоляты с высокими индексами поддержки группируются в четкие клады, которые соответствуют отдельным генотипам и благодаря существующей вариабельности разделяются на кластеры. Так, 13 изолятов генотипа G1P[8], все 9 изолятов G3P[8], 15 изолятов G4P[8] и один G9P[8], выделенные в Западной Сибири в течение четырех эпидемических сезонов, формируют кластер P[8]-III вместе с изолятами из разных стран мира, выделенными в последние годы. Кластер P[8]-III вместе с кластерами P[8]-I (Wa-like) и P[8]-II (F45-like) объединяют в сублинию P[8^ [14]. В то же время 2 изолята генотипа G9P[8] (II эпидемический сезон), 2 изолята G1P[8] (III сезон) и 8 изолятов G4P[8] (III и IV сезоны), выделенные в Новосибирске, вошли в кластер P[8]-IV (OP354-like), который недавно выделили в сублинию P[8]b [14]. В Омске выявлен единствен-
ный изолят Omsk08-381/G9P[8], относящийся к сублинии P[8]b. Этот изолят, как и 5 новосибирских изолятов генотипа G9P[8]b, впервые был обнаружен нами во II сезоне. Примечательно, что генотип G9P[8] был вторым по встречаемости в Новосибирске в 2004—2005 гг., однако выявленные тогда изоляты относились к сублинии P[8^, как и изолят Nov07-2799/G9P[8]a [4, 5]. Ротавирусы сублинии P[8]b считаются редкими и впервые были выделены в Малави в 1998—1999 гг. В последние годы ротавирусы сублинии P[8]b с низкой частотой обнаруживают в некоторых странах Азии, Африки и Европы, и чаще всего они не типируются праймерами Con3/Con2 [14]. В данном исследовании для типирования и сек-венирования фрагмента гена, кодирующего VP8* этих изолятов, мы использовали праймеры VP4F/VP4R [17].
Во II эпидсезоне следующим по встречаемости в обоих городах был генотип G2P[4]. В III—IV эпидсезонах он не встретился ни разу в Омске, а в IV сезоне — в Новосибирске. Пять изолятов генотипа G2P[4], выделенных в Новосибирске в II—III, а в Омске в I—II эпидемические сезоны, вошли в кластер P[4]-III. Два новосибирских изолята (III сезон) оказались гомологичными ротавирусам кластера P[4]-II (KO-2-like).
Изолят Omsk07-79/G4P[6] (I эпидемический сезон) и 3 новосибирских изолята генотипа GxP[6] (III-IV сезоны) кластеризуются с ротавирусами генотипа P[6]. При этом изолят Nov10-N921/GxP[6] гомологичен изоляту GER172-08 генотипа G12P[6]. Другие изоляты, хотя и имеют высокую степень гомологии со штаммами генотипа G4P[6], формируют отдельные ветви на филограмме. Изолят Omsk08-442/G3P[9] кластеризуется с изолятами генотипа P[9].
Филогенетический анализ последовательностей, кодирующих белок VP7. Полные нуклеотидные последовательности 9-го фрагмента генома (1062 п. н.), кодирующего капсидный белок VP7 (49—1029 н.), мы сравнили с доступными в базе данных GenBank NCBI-последовательностями, включая референсные Wa/G1, WI61/G9, DS-1/G2, KO-2/G2, ST3/G4, AU-1/G3 и вакцинные штаммы RotaTeq-WI79-9/G1, RotaTeq-SC2-9/ G2, RotaTeq-WI78-8/G3, RotaTeq-BrB-9/G4, Rotarix-A41CB052A/G1 (номера доступа в GenBank указаны на
36
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рис. 2. Филограмма, построенная методом Neighbor-Joining по двухпараметрической модели Кимуры на основе выровненных нуклеотидных последовательностей вариабельной части 4-го фрагмента генома, кодирующей домен VP8* капсидного белка VP4 ротавирусов.
Здесь и на рис. 3 и 4 приведены индексы бутстреп-анализа >70 % (1000 реплик). Обозначения изолятов, выявленных в разные эпидемические сезоны: треугольник — I, кружок — II, темный ромб — III, квадрат — IV; светлый ромб — вакцинные штаммы. Сокращения: AUS — Австралия, BEL — Бельгия, BRZ — Бразилия, GER — Германия, FRA — Франция, IND — Индия, JPN — Япония, MAL — Малави, PAK — Пакистан, THAI — Таиланд, VNM — Вьетнам, USA — США, ZAF — Южная Африка.
37
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №4, 2012
I Novi 1-N2146 G1PS I HQ738628 OmskOS-425 G1Р8 I Novi 1-N1947 G1P8
------- JF719063 IRAN/2010 G1P8
---- ■ Novi 1-N1784 G1P8
• GQ452921 Omsk08-350 G1 PS A HQ738582 Novi 0-N375 G1 P8 JN001862 NIBGE-32 G1P8 2010 PAK FJ348350 Ha95 G1P8 2008 Cuba HM773851 2007719907 G1P8 2007 USA HQ392371 BE00042 G1P3 2008 BEL
• FJ435209 NovOS-3427 G1PS
• GU377154 NOV08-2884 G1P8 A HQ738579 NOV07-1831 G1P8 A HQ738577 Nov07-1767 G1P8 HQ392388 BE00044 G1P8 2009 BEL
JN258340 2007719685 G1P8 2007 USA О JN349114 Rotarix-A41 CB052A G1P8 1988 USA A HQ738580 Noy10-N93 G1P8 A HQ537514 Novi Q-N327 G1P8 A FJ915077 Omsk07-7 G1P8
GQ996873 CU581-BK G1P8 2009 THAI
G1
ijl GU392974 GER15 G1P8 2008 GER
97. О GU565057 RotaTeq-Wl 79-9 1992 G1 USA I K02033 Wa G1P8 1974 USA
IV
I
AB605605 V32 G1P8 2006 VNM
:GU377173 Nov09-D202 G1 PS GU377174 Nov09-D249 G1 PS
:JQ713096 NOV10-N16 G1P8 JQ289113 Novi 0-N218 G1 P8
99. GQ229049 mani-362 G4P6 2007 IND 1 DQB73680 R479 G4P6 2004 CHI
. FJ915080 О ms kO 7-79 G4P6 — A GU377175 Nov09-D263 G4P8 О GU565090 RotaTeq-BrB-9 1996G4 USA AB039034 Odelia G4P8 1984 JPN GU392992 GER167 G4P8 2008 GER HM773S95 DC4320 G4P8 1988 USA X13603 ST3 G4P6 1975 GRB A FJ529400 МОУ07-1805 G4P8 9 FJ529401 Nov08-3260 G4P8 A HQ537510 Nov10-N71 G4P8 A JQ289116 Novi 0-N429 G4P8 A FJ932742 Omsk07-102 G4P8 • GU377162 Omsk08-362 G4P8
JGU377163 Omsk08-377 G4P8 HQ738619 Omsk08-459 G4P8 A JQ289118 Omsk09-526 G4P8 A JQ289119 Omsk09-530 G4P8
SFJ915079 Omsk07-217 G3P8 GQ452929 Omsk08-478 G3P8 ■ JX088011 Novi 1 - N1882 G3P8 ■ JX088010 Now11-N1874 G3P8 A HQ537513 NOV10-N243 G3P8 • GQ452926 Noy08-3404 G3P8 9 GQ117006 Hoy08-3281 G3P8 • GU377155 Nov08-2887 G3P8 JN849146 BE1259 G3P8 2009 BEL HM773686 2008747336 G3P8 2008 USA HQ230033 J P-9320 G3PB 2008 JPN JQ043266 CMH014-07 G3P8 2007 THAI
----О GU565079 RotaTeq-WI78-8 1992 G3 USA
GU377159 Omsk08-442 G3P9
G4
G3
Г“С
, D86271 AU-1 G3P9 1982 JPN ' 1 D86281 TK08 G3 JPN
SFJ919249 Nov08-3428 G9P8 GU377164 Omsk08-381 G9P8 • GU377157 NOV0B-3296 G9P8 JN001865 NIBGE-42 G9P8 2010 PAK JQ253562 CAU08-350 G9P8 2008 SKOR . AB180969 WI61 G9P8 1983 USA -----i AB180970 F45 G9P8 AUS
J4
HQ702226 DC3 G9P8 2009 USA JQ253569 CAU10-2 G9P8 2010 SKOR . GQ869642 MMC153 G9P8 2006 BGD
--. JN013996 2371WC G9P8 2008 ZAF
4.-------GU392976 GER20-08 G9P8 2008 GER
i • HQ445973 Nov07-2799 G9P8
87. JN849124 BE1058 G2P4 2008 BEL
--------' HQ657176 3203WC G2P4 2009 ZAF
70. HQ650124 DS-1 G2P4 1976 USA I-------1AY261338 514GRG2P4 1987SAF
GO
IV
I o GU565068 RotaT eq -SC2-9 1992 G2 USA A HQ537515 Novi 0-N397 G2P4 A JQ343219 Nov10-N413 G2P4 HM467953 LB2744 G2P4 2005-06 USA HM066103 15777 08PE G2P4 2008 BRZ AF401754 KO-2 G2P4 2000 JPN
■ HQ537512 Nov10-N190 G2P4 FJ440332 Omsk08-257 G2P4 FJ447566 Nou08-3277 G2P4 HM066075 14157 07RS G2P4 2006 BRZ GU979198 GER31 G2P4 2008 GER HM066123 16099 09ES G2P4 2009 BRZ . GQ117015 Omsk07-87 G2P4 > GU377161 OmskOe-336 G2P4
f
i
G2
0.02
Рис. 3. Филограмма, построенная методом Neighbor-Joining по двухпараметрической модели Кимуры на основе выровненных полных нуклеотидных последовательностей 9-го фрагмента генома, кодирующего капсидный белок VP7 ротавирусов.
38
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
95
99
99
♦ HQ611007 Nov10-N243 G3P8
-ш ................—
_ JQ613189 Novi 1-N1874 G3P8 • GQ477115 Omsk08-478 G3P8 ■ JQ613190 Novi 1-N1882 G3P8 HM773683 2008747336 G3P8 2008 USA JQ043292 CMH014 G3P8 2007 THAI -• GQ477109 Omsk07-217 G3P8 n ф JQ230Q72 Nov09-D187 G1 P8
Lf---Ф JQ230086 Nov10-N218 G1P8
Ц iф GU390458 Nov09-D202 G1P8 ?0Ц-ф GU390459 Nov09-D249 G1P8 aoL^ HQ611001 Nov10-N71 G4P8 ,* GQ477099 Nov08-3281 G3P8 4- JF491068 VU08-09-24 G3P8 2008 USA T# GQ477102 Nov08-3404 G3P8
JQ23Q095 Nov10-N921 P6
HQ702223 DC3 G9P8 2009 USA
nn----■ JQ613208 Nov11-N2359 G3P8
— ДВ605601 V32 G1P8 2006 VNM GU390443 NovOS-3296 G9P8 GQ477104 Nov08-3428 G9P8
ЧЛ
93
Э91* GU390449 Omsk08-381 G9P8 г- JN258348 2007719685 2007 G1P8 USA |L ■ JQ613188 Novi 1-N1 784 G1P8
FJ747617 GER126-08 G3G12P8 2008 GER i— ф GU390460 Nov09-D263 G4P8 JQ230081 Nov09-D336 G4P8 HQ610999 Nov10-N16 G1P8 HQ611000 Novi 0-N53 G4P8 JQ230085 NOV10-N164 G4P8 JQ230087 NOV10-N348 G4P8 HQ611019 Nov10-N45B G4P8 JQ230096 Nov10-N1008 G4P8 JQ613178 Nov10-N1107 G4P8 JQ613180 Nov10-N1154 G1P8 JQ613186 Novi 1-N1700 G4P8 JQ613187 Novi 1-N1778 G4P8 JQ613192 Novi 1-N1912 G4P8 HQ738599 Omsk09-526 G4P8 . HQ738600 OmskO9-530 G4P8
----EF563052 WI61 G9P8 1983 USA
i— EF583048 ST3 G4P6 1975 GBR GU390445 Omsk07-102 G4P8 GU390448 Omsk08-377 G4P8 HQ738586 Omsk08-459 G4P8 GU390447 Omsk08-362 G4P8 HQ445976 NOVC7-2799 G9P8 HQ611012 Novi0-N395 G4P8 GQ477089 Nov07-1805 G4P8 HQ611015 Nov10-N429 G4P8 HQ392389 BE00044 G1P8 2009 BEL • GQ477110 Omsk08-350 G1P8 HM773848 2007719907 G1P8 2007 USA ' HQ611014 Nov10-N375 G1P8 JQ613194 Novi 1-N1947 G1P8 JQ613200 Novi 1-N2146 G1P8 AJQ8181S7 Nov07-1831 G1P8 -♦ HQ611003 Novi0-N93 G1P8 ‘ JQ230066 NOV07-1767 G1P8 GU390440 Nov08-2884 G1P8 GU390441 Nov08-2887 G3P8 GQ477098 Nov08-3260 G4P8 _ GQ477107 OmskO7-7 G1P8 -• GQ477103 Nov08-3427 G1P8 JQ818154 Omsk08-425 G1P8
GQ477107 Omsk07-79 G4P6
991
99
l_ 4
li
95,
- HM773892 DC4320 G4P8 1988 USA ■ ■ JQ230097 Novi 1-N1485 P6
- HQ392373 BE00042 G1P8 2008 BEL ♦ HQ6110C9 NOV10-N327 G1P8
■ КО2086 Wa G1P8 1974 USA
99,
HQ611 020 Novi 0-N459 P6 DQ490538 AU-1 G3P9 1982 JPN
96
95
--------------------DQ146702 T152 G12P9 1998 THAI
DQ870507 DS-1 G2P4 197B USA
■ • JQ230102 OmskO8-442 G3P9
79
98
GU56507B RotaTeq-WI78-8 G3 1992 USA GU5S5089 RotaTeq-BrB-9 G4 1996 USA 99Г|<> GU565067 RotaTeq-SC2-9 G2 1992 USA
--- <> GU565056 RotaTeq-WI79-9 G1 1992 USA
‘ О GU565045 RotaTeq4WI79-4 P8 1992 USA m "S HQ611011 Nov10-N397 G2P4 ► HQ611017 Nov10-N413 G2P4
---JN014002 2371WC G9P8 2008 ZAF
7->IM467947 LB2744 G2P4 2006 USA 991 HM123837 15777 08PE G2P4 2008 BRZ “H HM123833 14263 07RS G2P4 2007 BRZ ", A GU138214 Omsk07-87 G2P4 J '• GU390446 Omsk08-336 G2P4 ' HQ657175 3203WC G2P4 2009 ZAF
98
HM066155 16099 09ES G2P4 2009 BRZ .♦HQ611005 Nov10-N190 G2P4 !■• GQ477100 NovOB-3277 G2P4 Ч* JQ818152 Omsk08-257 G2P4
11
13
12
0.02
Рис. 4. Филограмма, построенная методом Neighbor-Joining по двухпараметрической модели Кимуры на основе выровненных полных нуклеотидных последовательностей 6-го фрагмента генома, кодирующего капсидный белок VP6 ротавирусов.
39
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №4, 2012
рис. 3). На филограмме видно, что формируются четкие клады, соответствующие отдельным генотипам, однако выделенные клады имеют относительно низкие индексы поддержки (50—70%). В связи с этим дополнительно был проведен анализ этих последовательностей методом максимального правдоподобия. Топология полученной филограммы практически не отличалась, что позволяет сделать заключение о достоверности выделения кластеров, показанных на рис. 3 (данные не приведены). Филогенетический анализ показал, что сибирские изоляты генотипа G1 сгруппировались в два кластера. Большинство новосибирских (I—III эпидемические сезоны) и все омские изоляты группируются в кластер G1-II вместе с изолятами, которые выделены в последние годы во многих странах мира. Четыре новосибирских изолята (III сезон) вместе с изолятом из Вьетнама сгруппировались в кластер G1-III.
Большинство сибирских изолятов генотипа G4P[8] по последовательности, кодирующей белок VP7, кластеризуются с изолятами данного генотипа, выделенными в разные годы во многих странах мира, в том числе с вакцинным штаммом RotaTeq-BrB-9/G4. Изолят Nov09-D263 формирует отдельную ветвь на филограмме.
Изолят Nov07-2799/G9P[8]a вошел в кластер G9-I, а 3 сибирских изолята генотипа G9P[8]b — в другой кластер G9-II. Два новосибирских изолята генотипа G2 (III—IV эпидсезоны) и три омских (I—II сезоны) формируют 2 группы в кластере G2-III. Два новосибирских изолята (III сезон) группируются в другой кластер G2-II (KO-2-like).
Филогенетический анализ последовательностей, кодирующих белок VP6. Полученные полные нуклеотидные последовательности 6-го фрагмента генома (1356 п. н.), который кодирует внутренний капсидный белок VP6 (24—1217 н.), сравнили с последовательностями, доступными в базе данных GenBank NCBI, включая референсные штаммы Wa/I1, WI61/ I1, DS-1/I2, AU-1/I3 и вакцинные RotaTeq-WI79-4/ P8-I2, RotaTeq-WI79-9/G1-I2, RotaTeq-SC2-9/G2-I2, RotaTeq-WI78-8/G3-I2, RotaTeq-BrB-9/G4-I2 (номера доступа в GenBank указаны на рис. 4). По результатам филогенетического анализа последовательностей 6-го фрагмента генома сибирские изоляты с высокими индексами поддержки формируют четкие клады, соответствующие отдельным генотипам: изоляты генотипов G1P[8], G3P[8], G4P[8], G9P[8], G4P[6] по последовательности VP6 имеют генотип VP6-I1, а изоляты типов G2P[4] и G3P[9] входят в кластер генотипа VP6-I2. В частности, 52 сибирских изолята, имеющих генотип G1P[8], G3P[8], G4P[8], G9P[8], G4P[6], VP6-I1, вошли в многочисленный кластер VP6-I1 с изолятами аналогичных генотипов, выявленными в других регионах мира. С ними же кластеризовался изолят Nov10-N921 генотипа GxP[6]. На филограмме можно выделить отдельные группы, формирование которых связано с кластеризацией VP4 и VP7. Так, изоляты генотипа G9P[8]b формируют группу, отдельную от изолята Nov07-2799/G9P[8^, который группируется с изолятами генотипа G4P[8^ (рис. 4). Изоляты Omsk07-79/G4P[6] и Nov11-N1485/ GxP[6] формируют отдельные ветви на филограмме в кластере генотипа VP6-I1. Изолят Nov10-N327/ G1P[8] формирует отдельную ветвь вместе с изо-
лятом BE00042/G1P[8]-I1, выявленным в Бельгии в 2008 г. Изолят Nov10-N459/GxP[6] кластеризуется со штаммом Wa/G1P[8]-I1.
Семь сибирских изолятов генотипа G2P[4] имеют генотип VP6-I2. В этом кластере можно выделить обособленные группы изолятов, сформированные согласно кластеризации VP4 и VP7. Изолят Omsk08-442/ G3P[9] также имеет генотип VP6-I2, но формирует отдельную ветвь на филограмме.
Филогенетический анализ последовательностей изолятов с редкими генотипами. Изоляты генотипа G3P[8] в исследуемый период выявлялись с низкой частотой, хотя они были вторыми по встречаемости в Новосибирске в эпидемический сезон 2005/06 [3]. Сибирские изоляты генотипа G3P[8] по трем генам имели высокую степень гомологии между собой (см. рис. 2—4). Кроме того, в Омске выявлен изолят Omsk08-442 редкого генотипа G3P[9]. Ротавирусы генотипа G3P[9] относятся к редко встречающимся во всем мире и в единичных случаях выявляются в разных странах мира. Изолят Omsk08-442 формирует на филограммах VP4, VP7 и VP6 отдельные ветви. В Омске также был обнаружен изолят Omsk07-79 генотипа G4P[6]. Ротавирусы генотипа этого генотипа редки для Западной Сибири, но достаточно часто встречаются в таких странах, как Корея, Венгрия, Италия и Бразилия [4, 5, 17]. В Новосибирске были выявлены 3 изолята генотипа GxP[6]. Изолят Nov10-N921 по гену, кодирующему белок VP4, гомологичен изоляту GER172-08 генотипа G12P[6] и по гену, кодирующему белок VP6, отличается от двух других изолятов. Ротавирусы генотипа G12 в Западной Сибири до сих пор не обнаруживали. Изоляты Nov11-N1485 и Nov10-N459 имеют высокую степень гомологии со штаммами генотипа G4P[6], хотя и формируют отдельные ветви на филограммах VP4 и VP6.
Таким образом, проведенные исследования подтвердили, что ротавирусная инфекция остается актуальным инфекционным заболеванием детей раннего возраста, проживающих в Западной Сибири. Генотипический анализ выявленных изолятов ротавируса группы А показал, что в течение исследуемого периода в Западной Сибири произошла замена доминирующего генотипа G1P[8], преобладающего во всем мире, генотипом G4P[8], причем в Омске эта замена была зарегистрирована на 1 год раньше, чем в Новосибирске, в эпидемический сезон 2007—2008 гг. (см. рис. 1). Вероятно, с этим же связано резкое различие в генотипических спектрах изолятов, обнаруженных в Новосибирске и Омске в этом сезоне, в то время как в других сезонах спектры генотипов, выявленных в Новосибирске, в целом были подобны спектрам генотипов, зарегистрированных в соответствующий сезон в Омске. Причина опережающей смены генотипического спектра изолятов ротавируса А в Омске остается неясной и требует дальнейшего исследования.
Детальный молекулярно-генетический анализ, проведенный с использованием полных нуклеотидных последовательностей 6-го и 9-го фрагментов генома и вариабельной части 4-го фрагмента генома изолятов ротавируса группы А, выявленных в разные эпидемические сезоны в Новосибирске и Омске, показал, что спектры генотипов циркулировавших ротавирусов и частота их выявления различались и изменялись почти каждый эпидемический сезон. При филогенетическом
40
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
анализе установлено, что большинство изолятов ротавируса группы А, обнаруженных в Новосибирске и Омске, кластеризовались вместе и демонстрировали высокую степень гомологии с изолятами, выявленными в других регионах мира, преимущественно в Евразии, что позволяет отнести их к широко распространенным изолятам. Вместе с тем обнаружены единичные изо-ляты, гомологичные тем, которые были зарегистрированы на отдаленных территориях, что, возможно, свидетельствует об их "завозном" происхождении. Зарегистрированы также единичные изоляты, которые имели существенные отличия в нуклеотидных последовательностях. Все это позволяет сделать заключение, что спектр изолятов ротавируса группы А, циркулирующих в Западной Сибири, разнообразен и требует постоянного мониторинга, позволяющего оперативно выявлять смену доминирующего генотипа вируса, которая может сопровождаться ростом заболеваемости ротавирусным гастроэнтеритом.
Следует особо отметить, что нуклеотидные последовательности изолятов ротавируса группы А, выявленных в Новосибирске и Омске, не кластеризовались с соответствующими последовательностями вакцинных штаммов RotaTeq и Rotarix. Наши данные согласуются с опубликованными результатами исследований, проведенных в других странах, в которых также отмечают низкую гомологию циркулирующих изолятов с вакцинными штаммами RotaTeq и Rotarix. Вместе с тем, согласно результатам исследований в странах, где эти вакцины уже введены в национальные календари иммунизации, их применение позволило заметно сократить риск развития тяжелых случаев заболевания и уменьшить частоту госпитализаций [10].
Работа выполнена благодаря финансирова-
нию по гранту НШ-2996.2012.4 и Госконтракту № 02.740.11.0767 "Выявление вирусных возбудителей заболеваний, актуальных для здравоохранения Западной Сибири (гепатиты, гастроэнтериты, серозный менингит), изучение их генетического разнообразия в целях разработки и совершенствования диагностикумов".
Сведения об авторах
Жираковская Елена Владимировна — канд. биол. наук, науч. сотр. ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; е-mail: ezhr@ niboch.nsc.ru;
Аксанова Рената Халимовна — студентка Новосибирского государственного университета; е-mail: tikunova@ niboch.nsc.ru;
Горбунова Марина Георгиевна — канд. мед. наук, гл. специалист-эксперт отдела эпидемиологического надзора Управления Роспотребнадзора по Омской области; е-mail: [email protected];
Тикунов Артем Юрьевич — канд. биол. наук, мл. науч. сотр. ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; е-mail: [email protected];
Курильщиков Александр Михайлович — аспирант ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; е-mail: [email protected];
Соколов Сергей Николаевич — инженер-исследователь Новосибирского государственного университета, е-mail: [email protected];
Нетесов Сергей Викторович — чл.-корр. РАН, д-р биол. наук, проф., проректор по научной работе Новосибирского государственного университета; е-mail: [email protected];
Тикунова Нина Викторовна — д-р биол. наук, зав. лабораторией ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, е-mail: tikunova@ niboch.nsc.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильев Б. Я., Васильева Р. И., Лобзин Ю. В. Острые кишечные заболевания. Ротавирусы и ротавирусная инфекция. — СПб: Лань, 2000.
2. ГорбуноваМ. Г., Жираковская Е. В., Тикунова Н. В. и др. // Сиб. мед. журн. — 2008. — Т. 82, № 7. — C. 113—116.
3. ГорбуноваМ. Г., ТикуноваН. В., ЖираковскаяЕ. В. и др. // Эпи-демиол. и инфекц. бол. — 2008. — № 6. — С. 36—39.
4. Жираковская Е. В., Малеев В. В., Боднев С. А. и др. // Журн. ми-кробиол. — 2008. — № 4 — С. 12—16.
5. Жираковская Е. В., Никифорова Н. А., Корсакова Т. Г. и др. // Эпидемиол. и инфекц. бол. — 2007. — № 3. — С. 32—36.
6. КуличенкоТВ. // Вопр. диагн. в педиат. — 2009. — № 2. — С. 17—23.
7. DasB. K., Gentsch J. R., CicirelloH. G. et al. // J. Clin. Microbiol. — 1994. — Vol. 32. — P. 1820—1822.
8. EstesM. K., KapikianA. Z. // Fields virology. — 5th ed. — Vol. 1. — Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins — 2007. — P. 1917—1974.
9. Fischer Walker C. L., BlackR. E. // BMC Publ. Health. — 2011. — Vol. 11 — (suppl. 3). — P. S16.
10. Gentsch J. R., Glass R. I., Woods P. et al. // J. Clin. Microbiol. — 1992. — Vol. 30. — P. 1365—1373.
11. Gouvea V, Glass R. I., Woods P. et al. // J. Clin. Microbiol. — 1990. — Vol. 28. — P. 276—282.
12. Iturriza-Gomara M., Dallman T., Banyai K. et al. // Epidemiol. Infect. — 2011. — Vol. 139. — P. 895—909.
13. Matthijnssens J., CiarletM., McDonaldS. M. et al. // Arch. Virol. — 2011. — Vol. 156. - P. 1397—1413.
14. NagashimaS., KobayashiN., PaulS. K. et al. // Jpn. J. Infect. Dis. — 2010. — Vol. 63. — P. 208—211.
15. SantosN., Hoshino Y. // Rev. Med. Virol. — 2005. — Vol. 15. — P. 29—56.
16. Simmonds M. K., Armah G., Asmah R. et al. // J. Clin. Virol. — 2008. — Vol. 42. — P. 368—373.
17. Shim S. Y., Jung Y. C., Le V. P. et al. // J. Med. Virol. — 2010. — Vol. 82. — P. 700—706.
18. Solberg O. D., Hasing M. E., Trueba G., Eisenberg J. N. // Virology. — 2009. — Vol. 385. — P. 58-67.
Поступила 21.05.12
GENETIC DIVERSITY OF GROUP A ROTAVIRUS ISOLATES FOUND IN WESTERN SIBERIA IN 2007-2011
E. V. Zhirakovskaya1, R. Kh. Aksanova2, M. G. Gorbunova3,
A. Yu. Tikunov1, A. M. Kurilschikov1, S. N. Sokolov2, S. V. Netesov2,
N. V. Tikunova1
1 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia; 2 Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia; 3 Federal
Service on Customers’ Rights Protection and Human Well-Being Surveillance for Omsk Region, Omsk, Russia Genetic analysis of group A rotavirus recovered from fecal samples of children admitted to hospitals in Novosibirsk and Omsk during four epidemic seasons 2007, 2007/2008, 2009/2010, 2010/2011 was performed. A total of 1416 rotavirus isolates were genotyped using multiplex PCR. The isolates of the most common rotavirus genotypes G1P[8], G4P[8], G2P[4], G3P[8] co-circulated in Western Siberia during 2007-2011. In isolated cases G9P[8], G2P[8], G3P[9], and G4P[6] genotypes were detected. Change of dominant genotype from G1P[8] to G4P[8] occurred in 2008 in Omsk and in Novosibirsk in 2009 as well. Incidence and distribution of rotavirus genotypes differed and changed every epidemic season in both cities. The phylogenetic analysis based on Vp4 (VP8*), VP7, and VP6 gene sequences showed that the majority of isolates from Novosibirsk and Omsk were clustered together and demonstrated high level homology with rotavirus isolates found in other regions of Eurasia. In addition, a rare P[8]b (OP3 54-like) subtype of the VP4 gene was identified in fourteen isolates (G9, G1, and G4) in Novosibirsk and in a single isolate Omsk08-381/G9P[8]b in Omsk. The results obtained in this study demonstrate the necessity of long-term monitoring of rotavirus isolates in Western Siberia. This is important for selection of rotavirus vaccine for immunization of infants, improvement of diagnostic kits and understanding of the epidemiology and the evolution of group A rotaviruses.
Key words: group A rotavirus, VP4, VP6, VP7, children, geno-typing, phylogenetic analysis
