Генетические варианты норовируса генотипа gii. 6

Епифанова Наталия Владимировна

13. Петрова И.Д., Казаева Е.В., Малкова Е.М., Серегин С.В., Яшина Л.Н., Тюнников Г.И. и др. Клиническое, серологическое и молекулярно-биологическое исследование краснухи в Новосибирске в 2006 году. Инфекционные болезни. 2007; 5: 16-9.

14. Серегин С.В., Бабкин И.В., Петрова И.Д., Яшина Л.Н., Малкова Е.М., Петров В.С. Выявление генотипа 1h вируса краснухи в Западной Сибири. Молекуляpная генетика, ми^обиология и в^усология. 2011; 4: 18-23.

15. Бузицкая Ж.В., Сироткин А.К., Гудкова Т.М., Прочуханова А.Р., Карпов А.В., Цыбалова Л.М. и др. Молекулярно-биологическая характеристика штаммов вируса краснухи, выделенных в Санкт-Петербурге. Молекулярная биология. 2012; 46 (4): 672-6.

16. Лаврентьева И.Н., Семериков В.В., Жербун А.Б., Фельдблюм И.В., Марков А.В. Краснуха в России: изменчивость возбудителя в период вакцинопрофилактики. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2008; 3: 26-31.

Поступила 02.08.14

REFERENCES

4. WHO. Update of standard nomenclature for wild-type rubella viruses. Wkly Epidemiol. Rec. 2007; 82: 216-22.

5. Feng Y., Santibanez S., Appleton H. et al. Application of new assays for rapid confirmation and genotyping of isolates of rubella virus. J. Med. Virol. 2011; 83: 170-7.

6. Petrov V.S., Petrova I.D., Tyunnikov G.I., Seregin S.V. A set of oligonucleotide primers to identify RNA rubella virus. Patent RF № 2217501, 2003. (in Russian)

7. Petrova I.D., Tyunnikov G.I., Petrov V.S., Malkova E.M., Smerdova M.A. Development of a method of diagnostics of diseases rubella early in pregnancy. Allergy, asthma and clinical immunology. 1999; 9: 131-5. (in Russian)

8. Frey T.K. Molecular biology of rubella virus. Adv. Virus Res. 1994; 44: 69-160.

9. Hall T.A. Bioedit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids Symp. Ser. 1999; 41: 95-8.

10. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucl. Acids Res. 1997; 24: 4876-82.

11. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28 (10): 2731-9. doi:10.1093/molbev/msr121

12. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 1980; 16: 111-20.

13. Petrova I.D., Kazaeva E.V., Malkova E.M., Seregin S.V., Yashina L.N., Tyunnikov G.I. et al. Clinical, serological and molecular biological research of rubella in Novosibirsk in 2006. Infectious diseases. 2007; 5: 16-9. (in Russian)

14. Seregin S.V., Babkin I.V., Petrova I.D., Yashina L.N., Malkova E.M., Petrov V.S. Identification of genotype 1h rubella virus in Western Siberia. Molecular genetics, Microbiology and Virology. 2011; 4: 18-23. (in Russian)

13. Buzitskaya Zh.V., Sirotkin A.K., Gudkova T.M., Prochukhanova A.R., Karpov A.V., Tsybalova L.M. et al. Molecular-biological characteristics of strains of rubella virus allocated in St. Petersburg. Molecular biology. 2012; 46 (4): 672-6. (in Russian) 16. Lavrent'eva I.N., Semerikov V.V., Zherbun A.B., Fel'dblyum I.V., Markov A.V. Rubella in Russia: variability of the pathogen in the period of vaccination. Journal of Microbiology, epidemiology and immunobiology. 2008; 3: 26-31. (in Russian)

Recieved 02.08.14

Епифанова Н.В.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ НОРОВИРУСА ГЕНОТИПА GII.6

ФБУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора, 603950, Нижний Новгород

Введение. Норовирусы - этиологические агенты острых кишечных инфекций, в основном относятся к генотипу GII.4. Однако норовирусы других генотипов также играют немаловажную роль в некоторые эпидемические сезоны или в отдельных географических регионах. Норовирус генотипа GII.6 в последние годы становится вторым по значимости после GII.4 этиологическим агентом вспышек норовирусной инфекции. Цель. Охарактеризовать генетические варианты норовирусов генотипа GII.6 на основе филогенетического анализа последовательностей генома норовирусов, представленных в базах данных GenBank и NoroNet, а также выявленных на территории Нижнего Новгорода.

Материалы и методы. Путем секвенирования участка генома, кодирующего N/S-домен капсидного белка VP1, идентифицированы норовирусы генотипа GII.6, циркулировавшие при спорадической заболеваемости, а также обусловившие вспышку острой кишечной инфекции на территории Нижнего Новгорода. С использованием программного обеспечения Mega 5.2 проведен сравнительный филогенетический анализ полученных последовательностей и последовательностей, имеющихся в международных генетических базах данных. Результаты. Подтверждено наличие трех генетических вариантов генотипа GII.6 по гену капсидного белка - GII.6a (Seacroft_1990), GII.6b (Saitama_1997) и GII.6c (Shizuoka_2008) в сочетании с двумя генотипами по гену полимеразы - P6 и P7. Установлена их коциркуляция с 70-х годов прошлого века, что отражает различия в эволюционных процессах между минорными генотипами норовирусов и доминирующим генотипом GII.4, у которого новые эпидемические варианты полностью вытесняют предыдущие в течение нескольких лет. Норовирусы GII.6, циркулирующие в Нижнем Новгороде и в других городах России, относятся к геновариантам GII.6a и GII.6b. Заключение. Наиболее широкое распространение в Азии и Европе в последние годы получили рекомбинантные норовирусы

GII.P7_GII.6c. Норовирусы геноварианта GII.6c в России пока не обнаружены, однако нельзя исключить вероятность их появления в качестве причины вспышек острых кишечных инфекций на территории нашей страны в ближайшее время.

Ключевые слова: норовирус; генотип GII.6; генетические варианты; филогенетический анализ.

Одним из основных этиологических агентов острой кишечной инфекции (ОКИ) человека и животных являются норовирусы - мелкие безоболочечные РНК-содержащие вирусы, относящиеся к роду Norovirus семейства Caliciviridae. Геном норовирусов представляет собой полиаденилированную однонитевую РНК позитивной полярности размером примерно 7,5 тыс. нуклеотидных оснований (н.о.) [1] и организован в 3 открытые рамки считывания (ОРС). ОРС1 кодирует большой полипротеин, который нарезается вирусной протеазой на 6 неструктурных белков, включая РНК-зависимую РНК-полимеразу. ОРС2 и ОРС3 кодируют главный и минорный капсидные белки VP1 и VP2, соответственно [2]. VP1 состоит из N-терминального участка, S-домена (от англ. shell - оболочка), P-домена (от англ. protruding - выступающий) и C-терминального участка. Р-домен, несущий антигенные детерминанты и сайты связывания с клеточными рецепторами хозяина, состоит из субдомена P2 и двух фланкирующих его субдоменов P1-1 и P1-2 [3, 4].

На основе анализа первичной структуры генома в настоящее время норовирусы разделяют как минимум на 5 геногрупп [5]. Ге-ногруппы норовирусов разделяются на генотипы (или кластеры) а те в cвою очередь - на генетические варианты (геноварианты, субкластеры, линии, штаммы) [5, 6]. В рамках международного интернет-проекта NoroNet функционирует автоматическая система типирования норовирусов Norovirus Genotyping Tool Version 1.0, с помощью которой можно определить геногруппу и генотип норовируса на основании анализа нуклеотидной последовательности генома [7, 8]. Для типирования чаще других используют

участок ОРС1, кодирующий РНК-полимеразу (регион А), и участки ОРС2, кодирующие N/S-домен (регион С) и P1-2-домен (регион D) капсидного белка VP1 (рис. 1) [9]. Применяют двойную номенклатуру изолятов, учитывающую генотип норовируса по обеим рамкам считывания [6].

Наиболее эпидемически значимыми являются норови-русы 2-й геногруппы 4-го генотипа (GII.4), который с середины 90-х годов прошлого века прочно занимает доминирующее положение в популяциях норовирусов. С периодичностью 2-3 года появляются новые геноварианты данного генотипа, которые приобретают характер эпидемических (пандемических), быстро распространяясь среди населения практически всего мира [10-12]. В связи с этим генетическая вариабельность норовирусов генотипа GII.4 наиболее хорошо охарактеризована, а номенклатура наиболее разработана [6]. Автоматическая система типирования позволяет определить геновариант норовируса генотипа GII.4 в отличие от других норовирусов, которые идентифицируются только до генотипа.

Однако норовирусы других генотипов также играют немаловажную роль в некоторые эпидемические сезоны или в отдельных географических регионах. В 2008-2009 гг. в Японии на второе место после GII.4 вышел норовирус GII.6, составив 40,4% всех выявленных норовирусов, причем было отмечено появление нового геноварианта [13, 14]. В 2010-2012 гг. норовирус генотипа GII.6 вызвал 107 вспышек норовирусной инфекции (НВИ), зарегистрированных в странах-участницах NoroNet, уступив только GII.4, который обусловил 1174 вспышки [15]. При изучении генетического разнообразия норовирусов, циркулировавших на территории Нижнего Новгорода, нами также выявлены норовирусы генотипа GII.6 [16].

Целью данной работы явилась характеристика генетических вариантов норовирусов генотипа GII.6 на основе филогенетического анализа последовательностей генома норови-русов, представленных в базах данных GenBank и NoroNet, а также выявленных нами на территории Нижнего Новгорода.

Материалы и методы

Материалом для исследования служили образцы фекалий больных ОКИ. Выделение РНК норовирусов, обратную транскрипцию, полимеразную цепную реакцию и генотипирование норовирусов на основе секвенирования участка генома, кодирующего N/S-домен белка VP1, проводили как описано ранее [17]. Выравнивание нуклеотидных последовательностей, вычисление эволюционных дистанций и филогенетический анализ осуществляли с помощью программного обеспечения Mega, версия 5.2.1 [18, 19]. Для сравнения использовали нуклеотидные последовательности норовирусов, имеющиеся в базах данных GenBank и NoroNet. Их номера указаны в названиях изолятов на филогенетических древах. Филогенетические древа построены методом объединения ближайших соседей (Neighbor-joining) с использованием 2-параметрической модели Kimura. Достоверность топологии филограмм оценивали методом повторных выборок на основании анализа 1000 псевдореплик. На филограммах указывали статистические индексы поддержки более 60. В качестве элемента сравнения (outgroup) использовали последовательность генома норовируса генотипа GII.4 Lorsdale (X86557). Полученные в данном исследовании последовательности фрагментов генома норовирусов GII.6 представлены в международной базе данных GenBank под следующими номерами: HQ003272, JX524570,

Таблица 1

Выявление норовирусов генотипа GII.6 у больных ОКИ в Нижнем

Новгороде

Рег. № Дата выделения Возраст больного Эпидситуация по ОКИ Номер в GenBank Геновариант GII.6

13041 23.08.04 10 мес Спорадический случай JX536249 a

2352/09 01.10.09 5 лет То же JX524573 b

2648/09 27.11.09 5 мес " " JX524574 b

2703/09 04.12.09 2 г. 6 мес " " HQ003272 b

46/10 04.01.10 2 г. 5 мес " " - b

961/10 04.04.10 2 г. 6 мес " " - b

2669/11 00.12.11 4 года Групповое заболевание JX524570 a

2673/11 00.12.11 5 лет То же - a

2676/11 00.12.11 Н/д* " " - a

2681/11 00.12.11 Н/д* " " - a

Примечание. Н/д* - нет данных (взрослый, сотрудник стационара).

Рис. 1. Схема структурной организации генома норовирусов и положение областей, которые используют для генотипирования [9, с изменениями].

JX524573, JX524574, JX536249.

Результаты и обсуждение

Выявление норовирусов генотипа GII.6 в Нижнем Новгороде. При наблюдении за циркуляцией норовирусов на территории Нижнего Новгорода в 2003-2012 гг. нами было выявлено 10 изолятов норовирусов генотипа GII.6. Шесть изолятов обнаружены при спорадической заболеваемости и 4 - при групповом заболевании ОКИ (табл. 1). Последовательности участка генома, кодирующего N/S-домен белка VP1 изолятов 2352/09, 46/10 и 961/10, оказались идентичными, в базе данных была депонирована последовательность только одного из них (2352/09).

При групповом заболевании ОКИ в одном из соматических стационаров Нижнего Новгорода в декабре 2011 г. пострадало 17 человек. Норовирусы второй геногруппы были выявлены у 7 пациентов и 6 сотрудников стационара. Установить нуклеотидные последовательности участка генома белка VP1 удалось для изолятов, выделенных от 2 пациентов (2669/11, 2673/11) и 2 сотрудников (2676/11, 2681/11). Все 4 последовательности были идентичными, депонирована последовательность изолята 2669/11.

Филогенетический анализ полных последовательностей ОРС2 норовирусов генотипа GII.6. В базе данных GenBank доступны в настоящее время 39 полных нуклеотидных последовательностей ОРС2, кодирующих капсидный белок VP1 норовиру-сов генотипа GII.6, выделенных в период с 1976 по 2012 г. При построении филогенетического древа (рис. 2, а) эти последовательности распределяются на 3 группы, соответствующие идентифицированным W. Chang-It и соавт. [13] субкластерам a, b и c. Как было установлено ранее, каждый субкластер имеет характерные аминокислотные замены в наиболее вариабельном регионе VP1 - домене P2, а представители субкластеров b и c в отличие от субкластера a имеют 3 делеции в одинаковых сайтах домена [13].

Используя номенклатуру, принятую для обозначения вариабельности внутри генотипа GII.4, субкластеры a, b и c можно считать генетическими вариантами генотипа GII.6. Они отчетливо различаются при филогенетическом анализе, который в последних рекомендациях по унификации генотипирования норовирусов предложен в качестве основного подхода к классификации норовирусов [6]. Дивергенция нуклео-тидных последовательностей изолятов, представленных на рис. 2 а, составляет 0,18,3% внутри геноварианта и 19,3-23,5% между геновариантами.

Рис. 2. Филогенетические древа, построенные на основе нуклеотидных последовательностей норовирусов генотипа GII.6.

а - полная ОРС2 размером 1656 н.о., кодирующая белок УР1; б - участок генома размером 273 н.о., кодирующий субдомен Р1-2 белка УР1 (регион D); в - участок генома размером 349 н.о., кодирующий К^-домен белка УР1 (регион С). Названия стран даны по двухбуквенному коду КО-3166-1.

Рис. 3. Филогенетические древа, построенные на основе нуклеотидных последовательностей участка генома, кодирующего N/8-домен белка УР1 (регион С) норовирусов генотипа GII.6 (по базе данных GenBank и NoroNet). Названия стран даны по двухбуквенному коду 180-3166-1.

- JX995097 BR/2010/LVCA/19094 J>©95008 BR/2010/LVCA/17506 J)®95036 BR/2010/LVCA/17862 JX995102 BR/2010/LVCA/19305 JXB95084 BR/2010/LVCA/18408 JX995024 BR/2010/LVCA/17804

- J>®95007 BR/2010/LVCA/17490 JX995103 BR/2010/LVCA/19310 J)®95080 BR/2010/LVCA/18197 JX995016 BR/2010/LVCA/17775 ,-JXS95101 BR/2010/LVCA/19240

JX995099 В R/2010/LVCA/19206 JX395098 BR/2010/LVCA/19196 JX395097 BR/2010/LVCA/19106

,♦ JQ585610 RU/2011 /Nsk-N3107 кПф JQ585609 RU/2011/Nsk-N3059 JX995027 BR/2010/LVCA/17827 JX995026 BR/2010/LVCA/17819 L- JXB95043 BR/2009/LVCA/17904 r- DK2005_12 DK/10-2005 p DK2005_8 DK/09-2005 L DK2005_3 DK/05-2005

- JX995094 BR/2010/LVCA/18966 JXD47018 BR/2008/PA/QUI-13F3

4- JX047020 BR/2008/PA/QUI-29F1 JXD47019 BR/2008/PA/QUM4F2 ■ AJ277620 GB/1990/Seacroft90

-■ HM633213 JP/2008/Shizuoka8913

AB039778 JP/1997/Saitama U16

-♦ HM590553 RU/2009/Nsk-D324

HM596587 RU/2010/Nsk-N425 HM596579 RU/2010/Nsk-N266

GII.6a

100

67

-♦ HM596588 RU/2010/Nsk-N445

♦ JQ585607 RU/2010/Nsk-N1126

♦ HM596563 RU/2010/Nsk-N27 -XB6557 GB/1993/GII.4/Lordsdale

■ Прототипные штаммы геновариантов GM.6a, Gll.6b, Gll.6c ♦ Изоляты, выявленные в других исследованиях на территории России

Рис. 4. Филогенетическое древо, построенное на основе нуклеотидных последовательностей участка генома норовирусов, кодирующего субдомен Р1-2 белка УР1 (регион D) (по базе данных ОепБапк и Пого№1;). Названия стран даны по двухбуквенному коду 180-3166-1.

Дивергенция выведенных аминокислотных последовательностей составляет 0,2-2,1% внутри каждого геноварианта и 8,5-9,4% между вариантами а и Ь, 6,6-7% -между а и с и 4,7-5,3% между Ь и с. Эти последовательности удовлетворяют и ранее предложенным для генотипа ОП.4 количественным критериям выделения вариантов внутри генотипа, согласно которым различия выведенных аминокислотных последовательностей полного капсида УР1 не должно превышать 2,8% внутри варианта и составлять примерно 5% и более между вариантами [6, 20, 21].

Для обозначения вариантов генотипа ОП.6 может быть использован подход, принятый в насто-

ящее время для вариантов GII.4, - по названию места и году выделения изолята, для которого впервые определена и опубликована полная нуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок VP1: вариант GII.6a -Seacroft_1990 (изо-лят HU/NTV/Seacroft/90/UK, AJ277620), GII.6b - Saitama_1997 (изолят Saitama U16, AB039778), GII.6c - Shizuoka_2008 (изолят Norovirus Hu/GII.6/8913/ Shizuoka/2008/JPN, HM633213).

При ретроспективном исследовании архивной коллекции ВОЗ, проведенном l.A. Rackoff и соавт. [22], были выявлены 2 норовируса генотипа GII.6 в образцах, собранных в Сенегале в 1976 г (JN699035 SN/1976/S9c и JN699036 SN/1976/S7e) и один - в Китае в 1977 г. (JN699041 CN/1977/ HK28). В филогенетическом древе сенегальские изоляты располагаются в субкластере GII.6a, в который входят также изоляты, выявленные в США в 1980-1990-х годах и в Японии в 1990-2000-х годах, в Швеции в 2008 г Китайский изолят 1977 г наряду с вирусами, циркулировавшими в Японии в 1990-2000-х годах, США в 1994 г и в Китае в 2010-2011 гг., входит в субкластер GII.6b.

В филогенетическом древе полных последовательностей VP1 геновариант GII .6c, с появлением которого в 2008-2009 гг. связано увеличение частоты обнаружения норовирусов генотипа GII.6 у пациентов, госпитализированных в педиатрическую клинику префектуры Сидзуока (shizuoka), Япония [13], представлен только японскими изолятами 2008-2012 гг.

Таким образом, на основе анализа полных последовательностей ОРС2 норовиру-сов генотипа GII.6 можно предположить, что варианты GII.6a и GII.6b коциркули-руют в мире с 70-х годов прошлого века, а вариант GII.6c возник в конце 2000-х годов в Японии. Для уточнения вопроса о сроках формирования варианта GII.6c были проанализированы частичные последовательности ОРС2, имеющиеся в международных базах данных.

Филогенетический анализ частичных последовательностей ОРС2 норовирусов генотипа GII.6. В связи с тем что нередко при генотипировании и депонировании используется частичная нуклеотидная последовательность гена VP1, необходимо было определить, не изменяется ли кластеризация последовательностей, полученная при анализе полного гена

GII.6c

GII.6b

Рис.

5. Филогенетическое древо, построенное на основе полных нуклеотидных последовательностей

генома норовирусов. Названия стран даны по двухбуквенному коду 180-3166-1.

АВ039776 JP/1997/GII.P7_GII.6/Saitama U3 AB039777 JP/1997/GII.P7_GII.6/Saitarria U4 AB084071 JP/1999/GII.P7_GII.6/GIFU99 L AB818404 JP/2003/GII.P7_GII.6/Ehime030769

-AB258331 JP/2006/GII.P7_GII.7/Osaka F140

GU930737 US/1997/GII.P7_GII.6/E99-13646

AB818400 JP/2012/GI1.P7 Gll.6/Ehime120246

81

AB818397 JP/2009/GII.P7_GII.6/Ehime090646 AB818398 JP/2009/GII.P7_GII.6/Ehime090056 AB818399 JP/2009/Gll.P7_GII.6/Ehime090549

_I-KC576910 SN/1976/GII.P6_GII.6/S9c

921-AJ277620_31515 GB/1990/GII.P6_GII.6/Seakrolt

- AB818403 JP/2003/GII.P6_GII.6/Ehime031163 AB039778 JP/1997/GII.P6_GII.6/Saiiama U16 AB039779 JP/1997/GII.P6_GII.6/Saitama U17

-JQ750999 CN/2008/GII.P6_GII.6/Wuhan Z1125

AB818401 JP/2005/GII.P6_GII.6/Ehime050007 AB818402 JP/2004/GII.P6_GII.6/Ehime041525 8| JX984944 CN/2011/GII.P6_GII.6/Guangzhou GZ2010-L96 JX989075 CN/2011/GII.P6_GII.6/Guangzhou GZ2010-L96 ■ JX984940 CN/2010/GII.P6_GII.6/Guangzhou GZ2010-L72 sel— JX984936 CN/2010/GII.P6_GII.6/Guangzhou GZ2010-L1 -X86557 GB/1993/GII.P4_GII.4/Lordsdale

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

GII.P7

GII.P6

Рис. 6. Филогенетическое древо, построенное на основе нуклеотидных последовательностей участка генома норовирусов размером 329 н.о., кодирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу (регион А). Названия стран даны по двухбуквенному коду КО-3166-1.

VP1 норовирусов GII.6, при построении филогенетических древ на основе более коротких участков генома.

На рис. 2, б, в показаны древа, построенные на основе нуклеотидных последовательностей регионов D и C тех же штаммов, которые анализировались на рис. 2, а. Распределение нуклеотидных последовательностей на 3 группы, соответствующие геновари-антам, сохраняется. Для региона D дивергенция нуклеотидных последовательностей изолятов составляет 0,4-9,6% внутри гено-варианта и 16,5-24% между геновариантами. Аналогичные показатели для более консервативного региона C составляют 0-4,5 и 6,4-9,4%. Следовательно, филогенетический анализ нуклеотид-ных последовательностей данных участков генома норовирусов GII.6 позволит определить принадлежность изолятов к одному из трех геновариантов, хотя выведенные аминокислотные последовательности каждого из этих участков практически идентичны у всех анализируемых штаммов.

В базе данных GenBank присутствует более 100 частичных последовательностей гена VP1 норовирусов, генотип которых обозначен как GII.6. Кроме этого, несколько последовательностей, не маркированных при депонировании как GII.6, но родственных нижегородским изолятам, обнаружены при анализе в программе BLAST [23]. В открытом доступе базы данных NoroNet по состоянию на сентябрь 2013 г. представлено 198 последовательностей гена VP1 норовирусов GII.6, в том числе 196 последовательностей норовирусов, выявленных в 2002-2013 гг. при вспышках норовирусной инфекции, которые были зарегистрированы в школах, детских садах, домах престарелых, отелях, ресторанах на территориях стран-участниц проекта, а также по одному изоляту 1979 и 1990 гг. [24].

На рис. 3 показано филогенетическое древо, построенное на основе нуклеотидных последовательностей региона C норовиру-сов GII.6 из баз данных GenBank и NoroNet (в анализ включено около трети имеющихся последовательностей), а также нижегородских изолятов. В качестве референсных использованы прото-типные изоляты каждого из трех геновариантов.

Анализ региона C показал, что к варианту GII^ относятся норовирусы, циркулировавшие в Азии (Япония, Китай, Вьетнам, Корея, Индия, Сингапур), Европе (Великобритания, Швеция, Франция, Дания, Россия), Африке (Эфиопия, Южно-Африканская республика), Австралии, Новой Зеландии в 1976-2013 гг. Нижегородский изолят 13041, обнаруженный в августе 2004 г. при

спорадической заболеваемости, оказался идентичным по исследуемому участку генома норовирусу, выделенному в Швеции в августе 2005 г. (БЕ_2005_09 БЕ/082005).

Нижегородские изоляты, выявленные нами при вспышке в соматическом стационаре Нижнего Новгорода в декабре 2011 г., входят в обособленный, достаточно однородный, кластер генова-рианта ОП.6а. В этот же кластер входят последовательности норовирусов, вызвавших вспышки НВИ, зарегистрированные в России в марте-ноябре 2012 г. (данные в NoroNet предоставлены ЦНИИЭ, Москва), а также норовирусов, циркулировавших в Европе (Франция, Испания, Дания) в 2010-2012 гг. и Китае в 2012 г По нуклеотидной последовательности региона С нижегородские изоляты идентичны между собой и с норовирусом М0Б1092012, выявленным на территории России в сентябре 2012 г., и отличаются всего на одну нуклеотид-ную замену от норовируса, выделенного в 2012 г. в Китае при пищевой вспышке в туристической группе (изолят ЯС783727 СП2012/хт018) [25].

Вариант ОП.6Ъ представлен на филогенетическом древе двумя ветвями, в каждую из которых входят последовательности норовирусов, циркулировавших как в Азии, так и в Европе в 2002-2012 гг. Норовирусы, обнаруженные нами при спорадической заболеваемости в 2009-2010 гг., относятся к одной из ветвей, к которой, кроме европейских и азиатских изолятов, принадлежит также норовирус, выявленный в Новой Зеландии в 2012 г. Нижегород-

Таблица 2

Сопоставление геноварианта Vp1 и генотипа полимеразы норовирусов GII.6

Год выделения Страна Название изолята Номер в GenBank Генотип, вариант VP1 Генотип полиме-разы

1993 США Florida/269 AF414407 GII.6a GII.P7

1997 Япония Sаitama U3 AB039776 GII.6a GII.P7

1997 Япония Saitama U4 AB039777 GII.6a GII.P7

1999 Япония GIFU99 AB084071 GII.6a GII.P7

2008 Швеция S18 JN183165 GII.6a GII.P7

2003 Япония Ehime030769 AB818404 GII.6a GII.P7

1976 Сенегал S9c KC576910 GII.6a GII.P6

1990 Великобритания Seacroft/90 AJ277620 GII.6a GII.P6*

1997 США E99-13646 GU930737 GII.6b GII.P7

1994 США Miami/292 AF414410 GII.6b GII.P7

1997 Япония Saitama U16 AB039778 GII.6b GII.P6

1997 Япония Saitama U17 AB069779 GII.6b GII.P6

2011 Китай GZ2010-L96 JX989075 GII.6b GII.P6

2003 Япония Ehime031163 AB818403 GII.6b GII.P6

2004 Япония Ehime041525 AB818402 GII.6b GII.P6

2005 Япония Ehime050007 AB818401 GII.6b GII.P6

2009 Япония Ehime090646 AB818397 GII.6c GII.P7

2009 Япония Ehime090056 AB818398 GII.6c GII.P7

2009 Япония Ehime090549 AB818399 GII.6c GII.P7

2012 Япония Ehime120246 AB818400 GII.6c GII.P7

Примечание . * представлена в NoroNet под номером

AJ277620_31515_seq_2.

35

ские изоляты оказались наиболее близки к норовирусу JN008938 IT/2009/IZSBs, обнаруженному в 2009 г. в Италии (гомология 98,4-99,5%).

Большинство изолятов норовируса варианта GII.6c выявлено в 2008-2009 гг. на территории Японии, где он и был впервые идентифицирован [13, 14]. Этот вариант циркулировал также во Вьетнаме, Корее, США, Мексике, Новой Зеландии, выявлялся в поверхностных водах открытых водоемов Южно-Африканской Республики. Наиболее ранний представитель данного геновари-анта, присутствующий в базе данных GenBank, - изолят 46048, выявленный в Ирландии в 2006 г. (EU392257 IE/2006/46048). В группу GII.6c на филогенетическом древе вошли также имеющиеся в базе NoroNet последовательности норовирусов, выявленных в Швеции в 1979, 2003 и 2004 гг. (1976_1979 SE/1979, SE-2003_10SE/08-2003, 533_05 SE/2004) и в Великобритании в 2005 г. (EVU1870a GB/03-2005), что опровергает предположение о возникновении норовируса GII.6c в Японии в 2008 г. и свидетельствует о более раннем появлении этого геноварианта в Европе.

Три последовательности из Genbank, обозначенные как GII.6, не сгруппировались с другими последовательностями данного генотипа. При генотипировании с помощью Norovirus typing tool изолят EU2392259 IE/2006/47747 показал принадлежность к GII.13, FJ409630 BE/2002/H7 - к GII.2, генотип изолята KC783725 CN/2012/xm016 автоматическая система не определила.

Участков генома норовирусов, соответствующих региону D, в базах данных существенно меньше (рис. 4). Анализ региона D расширил географию распространенности генотипа GII.6 и показал, что к геноварианту GII.6а принадлежат норовирусы, выявленные в Бразилии в 2008-2011 гг., в Дании в 2005 г. и в России (Новосибирск) в 2011 г., к варианту GII.6b - новосибирские изоляты 2009-2010 гг. Новых изолятов GII^ данный анализ не выявил. Отметим, что норовирус GII.6c при широкой циркуляции в мире на территории России пока не обнаруживался.

С учетом достаточно широкого охвата доступных последовательностей генома норовирусов GII.6 были установлены временные интервалы циркуляции разных геновариантов^П.6а -1976-2013 гг., GII.6b - 1977-2012 гг., GII.6c - 1979-2012 гг. Следовательно, в последние 35-37 лет генотип GII.6 представлен тремя коциркулирующими вариантами в отличие от генотипа GII.4, предыдущий эпидемический вариант которого за относительно короткий интервал времени (2-4 года) полностью вытесняется последующим [10-12].

Сопоставление геноварианта VP1 и генотипа полимеразы норовирусов GII.6. В базе данных GenBank в настоящее время присутствуют полногеномные последовательности 9 штаммов норовирусов, имеющих по гену капсидного белка генотип GII.6 (рис. 5). Четыре из них имеют аналогичную генотиповую принадлежность также и по гену полимеразы - GII.P6_GII.6, а 5 являются межгенотиповыми рекомбинантами GII.P7_GII.6. Анализируемые последовательности формируют 2 кластера, в один из которых входят рекомбинанты, в другой - норовирусы GII.P6_GII.6. Только штамм S9c, выделенный в 1976 г. в Сенегале, занимает промежуточное положение.

При филогенетическом анализе нуклеотидных последовательностей, кодирующих полимеразу, происходит кластеризация на генотипы P6 и P7 (рис. 6). Следует отметить, что данный участок у разных штаммов норовирусов, имея на уровне ну-клеотидных последовательностей различия до 16,3%, на уровне выведенных аминокислотных последовательностей идентичен (за исключением одной аминокислотной замены у изолята Guangzhou GZ2010-L1 (JX984936). Последовательность изолята S9c, выделенного в 1976 г. в Сенегале, и короткая последовательность гена полимеразы изолята Seacroft/90, присутствующая в базе данных NoroNet, хотя и типируются как P6, формируют отдельную ветвь, различия у которой по данному участку составляют 12,5-15,5% с P6 и 7,5-16,3% с P7. Возможно, эти штаммы были промежуточным звеном при дивергенции ОРС1 от общего предка, приведшей к четкому разделению P6 и P7.

Сопоставление геноварианта VP1 и генотипа полимеразы норовирусов GII.6. показало, что изоляты варианта GII.6a, как правило, имеет полимеразу P7 (табл. 2). Исключение составляют те же 2 изолята (S9c и Seacroft/90), полимераза которых существенно отличается от полимеразы других изолятов с генотипом P6. Норовирусы геноварианта GII.6b могут иметь полимеразу генотипа

как P7, так и P6. Все норовирусы GII.6c, для которых определена последовательность ОРС1, несут ген полимеразы P7. Таким образом, большинство норовирусов генотипа GII.6 является межге-нотиповыми рекомбинантами.

Норовирус генотипа GII.6 в последние годы становится вторым по значимости после GII.4 этиологическим агентом вспышек норовирусной инфекции. На основании проведенного филогенетического анализа последовательностей генома норовирусов GII.6 подтверждено наличие трех генетических вариантов данного генотипа по гену капсидного белка - GII.6a (Seacroft_1990), GII.6b (Saitama_1997) и GII.6c (Shizuoka_2008) в сочетании с двумя генотипами по гену полимеразы - P6 и P7. Эти геноварианты коциркулируют по крайней мере с 70-х годов прошлого века, что отражает различия в эволюционных процессах между минорными генотипами норовирусов и доминирующим генотипом GII.4, у которого новые эпидемические варианты полностью вытесняют предыдущие в течение нескольких лет.

Норовирусы генотипа GII.6, циркулирующие в Нижнем Новгороде и в других городах России, относятся к геновариантам GII.6a и GII.6b. Наиболее широкое распространение в Азии и Европе в последние годы получили рекомбинантные норовирусы GII.P7_GII.6c, сочетание генов полимеразы и капсидного белка VP1, у которых, вероятно, обеспечивает им определенные селективные преимущества. Норовирусы геноварианта GII.6c в России пока не обнаружены, однако нельзя исключить вероятность их появления в качестве причины вспышек острых кишечных инфекций на территории нашей страны в ближайшее время.

Сведения об авторе

Епифанова Наталия Владимировна (Epifanova Natalia Vladimirovna) - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций ФБУН «ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора, 603950, Нижний Новгород, ул. Малая Ямская, 71; e-mail: epifanovanv@ mail.ru.

ЛИТЕРАТУРА

1. Xi J.N., Graham D.Y., Wang K.N., Estes M.K. Norwalk virus genome cloning and characterization. Science. 1990; 250 (4987): 1580-3.

2. Jiang X., Wang M., Wang K., Estes M.K. Sequence and genomic organization of Norwalk virus. Virology. 1993; 195 (1): 51-61.

3. Prasad B.V., Hardy M.E., Jiang X., Estes M.K. Structure of Norwalk virus. Arch. Virol. Suppl. 1996; 12 (Suppl): 237-42.

4. Prasad B.V., Hardy M.E., Dokland Т., Bella J., Rossmann M.G., Estes M.K. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 1999; 286 (5438): 287-90.

5. Zheng D.P., Ando T., Fankhauser R.L., Beard R.S., Glass R.I., Monroe S.S. Norovirus classification and proposed strain nomenclature. Virology. 2006; 346 (2): 312-23.

6. Kroneman A., Vega E., Vennema H., Vinjé J., White P. A., Hansman G. et al. Proposal for a unified norovirus nomenclature and genotyping. Arch. Virol. 2013; 158 (10): 2059-68.

7. NoroNet. Sequence typing tool. Norovirus Genotyping Tool Version 1.0. Avaible at: http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool (accessed 10 October 2013).

8. Kroneman A., Vennema H., Deforche K., v d Avoort H., Peñaranda S., oberste M.S. et al. An automated genotyping tool for enteroviruses and noroviruses. J. Clin. Virol. 2011; 51 (2): 121-5.

9. Mattison K., Grudeski E., Auk B., Charest H., Drews S.J., Fritzinger A. et al. Multicenter comparison of two norovirus oRF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 2009; 47 (12): 3927-32.

10. Siebenga J.J., Vennema H., Zheng D.P., Vinjé J., Lee B.E., Pang X.L. et al. Norovirus illness is a global problem: emergence and spread of noro-virus GII.4 variants, 2001-2007. 2009; 200 (5): 802-12.

11. Bull R.A., Eden J.S., Rawlinson W.D., White P.A. Rapid evolution of pandemic noroviruses of the GII.4 lineage. PLoS Pathog. 2010; 6(3): e1000831.

12. Hoa Tran T.N., Trainor E., Nakagomi Т., Cunliffe N.A., Nakagomi O. Molecular epidemiology of noroviruses associated with acute sporadic gastroenteritis in children: Global distribution of genogroups, genotypes and GII.4 variants. J. Clin. Virol. 2013; 56 (3): 185-93.

13. Chan-It W., Thongprachum A., Khamrin P., Kobayashi M., Okitsu S., Mizuguchi M. et al. Emergence of a new norovirus GII.6 variant in Japan, 2008-2009. J. Med. Virol. 2012; 84 (7): 1089-96.

14. Iritani N., Kaida A., Kubo H., Abe N., Goto K., Ogura H. et al. Molecular epidemiology of noroviruses detected in seasonal outbreaks of acute nonbacterial gastroenteritis in Osaka City, Japan, from 1996-1997 to 20082009. J. Med. Virol. 2010; 82 (12): 2097-105.

15. van Beek J., Kroneman A., Vennema H., Koopmans M. NoroNet report, April 2013. Available at: http://www.rivm.nl/en/Topics/Topics/N/Noro-Net Publication date: 2013-04-25 Modification date: 2013-06-11 (accessed 10 October 2013).

16. Епифанова Н.В., Луковникова Л.Б., Новикова Н.А. Генетическое разнообразие норовирусов, циркулирующих на территории России. Инфекция и иммунитет. 2013, 3 (2): 126-7.

17. Епифанова Н.В., Новикова Н.А. Рекомбинантный норовирус GII. Pg_GlI.12 у детей с острой кишечной инфекцией. Медицинский алфавит. Эпидемиология и гигиена. 2013, 2(12): 22-6.

18. MEGA 5.2. Available at: http://megasoftware.net (accessed 10 October 2013).

19. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28 (10): 2731-9.

20. Bok K., Abente E.J., Realpe-Quintero M., Mitra T., Sosnovtsev S.V., Kapikian A.Z. et al. Evolutionary dynamics of GII.4 noroviruses over a 34-year period. J. Virol. 2009; 83 (22): 11890-901.

21. Zheng D.P., Widdowson M.A., Glass R.I., Vinje J. Molecular epidemiology of genogroup II-genotype 4 noroviruses in the United States between 1994 and 2006. J. Clin. Microbiol. 2010; 48 (1): 168-77.

22. Rackoff L.A., Bok K., Green K.Y., Kapikian A.Z. Epidemiology and evolution of rotaviruses and noroviruses from an archival WHO Global Study in Children (1976-79) with implications for vaccine design. PLoS One. 2013; 8 (3): e59394.

23. BLAST. Available at: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (accessed 10 October 2013).

24. NoroNet. Databases. Molecular epidemiology database public. Available at: http://www.rivm.nl/pubmpf/norovirus/database/outbreaks/list (accessed 10 October 2013).

25. Huang J., Xu X., Weng Q., Hong H., Guo Z., He S. et al. Serial food-borne norovirus outbreaks associated with multiple genotypes. PLoS One. 2013; 8 (5): e63327.

Поступила 01.02.14

REFERENCES

1. Xi J.N., Graham D.Y., Wang K.N., Estes M.K. Norwalk virus genome cloning and characterization. Science. 1990; 250 (4987): 1580-3.

2. Jiang X., Wang M., Wang K., Estes M.K. Sequence and genomic organization of Norwalk virus. Virology. 1993; 195 (1): 51-61.

3. Prasad B.V., Hardy M.E., Jiang X., Estes M.K. Structure of Norwalk virus. Arch. Virol. 1996; 12: (Suppl.): 237-42.

4. Prasad B.V., Hardy M.E., Dokland T., Bella J., Rossmann M.G., Estes M.K. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 1999; 286 (5438): 287-90.

5. Zheng D.P., Ando T., Fankhauser R.L., Beard R.S., Glass R.I., Monroe S.S. Norovirus classification and proposed strain nomenclature. Virology. 2006; 346 (2): 312-23.

6. Kroneman A., Vega E., Vennema H., Vinjé J., White P. A., Hansman G. et al. Proposal for a unified norovirus nomenclature and genotyping. Arch. Virol. 2013; 158 (10): 2059-68.

7. NoroNet. Sequence typing tool. Norovirus Genotyping Tool Version 1.0. Available at: http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool (accessed 10 October 2013).

8. Kroneman A., Vennema H., Deforche K., v d Avoort H., Peñaranda S., Oberste M.S. et al. An automated genotyping tool for enteroviruses and noroviruses. J. Clin. Virol. 2011; 51 (2): 121-5.

9. Mattison K., Grudeski E., Auk B., Charest H., Drews S.J., Fritzinger A. et al. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 2009; 47 (12): 3927-32.

10. Siebenga J.J., Vennema H., Zheng D.P., Vinjé J., Lee B.E., Pang X.L. et al. Norovirus illness is a global problem: emergence and spread of noro-virus GII.4 variants, 2001-2007. 2009; 200 (5): 802-12.

11. Bull R.A., Eden J.S., Rawlinson W.D., White P.A. Rapid evolution of pandemic noroviruses of the GII.4 lineage. PLoS Pathog. 2010; 6(3): e1000831.

12. Hoa Tran T.N., Trainor E., Nakagomi T. Cunliffe N.A., Nakagomi O. Molecular epidemiology of noroviruses associated with acute sporadic gastroenteritis in children: Global distribution of genogroups, genotypes and GII.4 variants. J. Clin. Virol. 2013; 56 (3): 185-93.

13. Chan-It W., Thongprachum A., Khamrin P., Kobayashi M., Okitsu S., Mizuguchi M. et al. Emergence of a new norovirus GII.6 variant in Japan, 2008-2009. J. Med. Virol. 2012; 84 (7): 1089-96.

14. Iritani N., Kaida A., Kubo H., Abe N., Goto K., Ogura H. et al. Molecular epidemiology of noroviruses detected in seasonal outbreaks of acute nonbacterial gastroenteritis in Osaka City, Japan, from 1996-1997 to 2008-2009. J. Med. Virol. 2010; 82 (12): 2097-105.

15. van Beek J., Kroneman A., Vennema H., Koopmans M. NoroNet report, April 2013. Available at: http://www.rivm.nl/en/Topics/Topics/N/Noro-Net Publication date: 2013-04-25 Modification date: 2013-06-11 (accessed 10 October 2013).

16. Epifanova N.V., Lukovnikova L.B., Novikova N.A. Genetic diversity of

noroviruses circulating in the territory of Russia. Infektsiya i immunitet. 2013, 3 (2): 126-7. (in Russian)

17. Epifanova N.V., Novikova N.A. Recombinant norovirus GII.Pg_GII.12 in children with acute enteric infection. Meditsinskiy alfavit. Epidemi-ologiya i gigiena. 2013, 2(12): 22-6. (in Russian)

18. MEGA 5.2. Available at: http://megasofftware.net (accessed 10 October 2013).