CC BY
0
https://doi.org/10.17116/molgen20234103125
Генетическая вариабельность риккетсий в клещах Dermacentor spp. на территории Западной Сибири и Северного Казахстана
© В.И. ЯКУБОВСКИЙ1, Я.П. ИГОЛКИНА1, А.Ю. ТИКУНОВ1, В.В. ПАНОВ2, В.В. ЯКИМЕНКО3, А.Г. ЖАБЫКПАЕВА4, Т.И. ЕПИХИНА1, В.А. РАР1
1ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия 2ФГБУН Институт систематики и экологии животных СО РАН, Новосибирск, Россия 3ФБУН Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций, Омск, Россия 4НАО «Костанаский региональный университет им А. Байтурсынова», Костанай, Республика Казахстан
РЕЗЮМЕ
Цель исследования. Изучить распространение, видовое разнообразие и генетическую вариабельность риккетсий в клещах Dermacentor spp. на территории Западной Сибири и Северного Казахстана.
Материал и методы. Образцы от 571 клеща рода Dermacentor (406 Dermacentor reticulatus, 136 Dermacentor nuttalli, 21 Dermacentor marginatus и 8 Dermacentor silvarum) были исследованы на наличие ДНК Rickettsia spp. методом двухраундовой ПЦР. Видовая принадлежность риккетсий была установлена методом видоспецифичной ПЦР и/или секвенированием фрагментов gltA гена. Для ряда образцов Rickettsia raoultii были дополнительно определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов ompA (3266 н.п.) и ompB (4852 н.п.).
Результаты. В исследованных клещах обнаружена ДНК четырех видов риккетсий, а также нового генотипа Rickettsia spp. Ko-97-Dr, не относящегося к известным видам. Все виды клещей наиболее часто были инфицированы R. raoultii; уровень инфицированности варьировал от 47,0 до 86,8%. ДНК Rickettsia sibirica была обнаружена в 16,1 —45,7% D. nuttalli на трех участках Республики Алтай. ДНК Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia aeschlimannii-like, «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» и новый генотип Rickettsia sp. Ko-97-Dr были обнаружены в единичных D. reticulatus и D. marginatus. На основании анализа фрагмента гена gltA было идентифицировано семь сиквенс-вариантов R. raoultii, четыре из которых соответствовали ранее описанным генотипам данного вида. Проведенный анализ образцов R. raoultii по протяженным фрагментам ompA и ompB показал наличие трех генетических групп, соответствующих различным генотипам по гену gltA. Заключение. В клещах Dermacentor spp. были обнаружены как типичные, так и нетипичные для данных клещей виды риккетсий. Показано существование природных очагов сибирского клещевого тифа на территории Республики Алтай. На основании анализа вариабельных генов поверхностных белков и консервативного гена gltA показано существование трех генетических групп R. raoultii.
Ключевые слова: клещи Dermacentor spp., риккетсиозы, Rickettsia sibirica, Rickettsia aeschlimannii, «Candidatus Rickettsia tarasevichiae», gltA, ompA, ompB, филогенетический анализ.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Якубовский В.И. — https://orcid.org/0009-0009-1425-3678; e-mail: [email protected] Иголкина Я.П. — https://orcid.org/0000-0001-5604-1846; e-mail: [email protected] Тикунов А.Ю. — https://orcid.org/0000-0001-5613-5447; e-mail: [email protected] Панов В.В. — e-mail: [email protected]
Якименко В.В. — https://orcid.org/0000-0001-9088-3668; e-mail: [email protected] Жабыкпаева А.Г. — e-mail: [email protected] Епихина Т.И. — e-mail: [email protected]
Рар В.А. — https://orcid.org/0000-0002-5930-5306; e-mail: [email protected]
Автор, ответственный за переписку: Якубовский В.И. — e-mail: [email protected]
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Якубовский В.И., Иголкина Я.П., Тикунов А.Ю., Панов В.В., Якименко В.В., Жабыкпаева А.Г., Епихина Т.И., Рар В.А. Генетическая вариабельность риккетсий в клещах Dermacentor spp. на территории Западной Сибири и Северного Казахстана. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2023;41(3):25—34. https://doi.org/10.17116/molgen20234103125
Genetic diversity of rickettsias in Dermacentor spp. ticks on the territory of Western Siberia and Northern Kazakhstan
© V.I. YAKUBOVSKIJ1, Y.P. IGOLKINA1, A.Y. TIKUNOV1, V.V. PANOV2, V.V. YAKYMENKO3, A.G. ZHABYKPAYEVA4, T.I. EPIKHINA1, V.A. RAR1
'Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of SBRAS, Novosibirsk, Russia; institute of Systematics and Ecology of Animals, SBRAS, Novosibirsk, Russia; 3Omsk Research Institute of Natural Focal Infections, Omsk, Russia; 4A. Baitursynov Kostanay regional university, Kostanay, Republic of Kazakhstan
ABSTRACT
Purpose. To study distribution, species diversity and genetic variability of rickettsiae in Dermacentor spp. from the Western Siberia and Northern Kazakhstan.
Material and methods. Samples from 571 Dermacentor ticks (406 Dermacentor reticulatus, 136 Dermacentor nuttalli, 21 Dermacentor marginatus, and 8 Dermacentor silvarum) were examined for the presence of Rickettsia spp. DNA using nested PCR. The species of rickettsiae was determined by species-specific PCR and/or sequencing of gltA gene fragments. For a number of R. raoultii samples, the sequences of the ompA (3266 bp) and ompB (4852 bp) gene fragments were additionally determined. Results. DNA of four Rickettsia species and a new genotype Rickettsia spp. Ko-97-Dr, which cannot be assigned to any of known species, were found in examined ticks. All tick species were most commonly infected with R. raoultii; the infection rate varied from 47.0% to 86.8%. Rickettsia sibirica DNA was found in 16.1—45.7% of D. nuttalli at three sites in the Republic of Altai. DNA of Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia aeschlimannii-like, «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» and a new genotype Rickettsia sp. Ko-97-Dr were found in single D. reticulatus and D. marginatus. Based on the analysis of the gltA gene fragment, seven haplotypes of R. raoultii were identified, four of which corresponded to previously described genotypes. The analysis of long fragments of the ompA and ompB genes of R. raoultii samples showed the presence of three genetic groups corresponding to different genotypes for the gltA gene.
Conclusion. In Dermacentor spp., both typical and atypical species of Rickettsia spp. were found. The existence of natural foci of STT in the Altai Republic was shown. Based on the analysis of the variable surface protein genes and conserved gltA, the existence of three genetic groups of R. raoultii was shown.
Keywords: Dermacentor spp., rickettsioses, Rickettsia sibirica, Rickettsia aeschlimannii, «Candidatus Rickettsia tarasevichiae», gltA, ompA, ompB, phylogenetic analysis.
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:
Yakubovskij V.I. — https://orcid.org/0009-0009-1425-3678; e-mail: [email protected] Igolkina Y.P. — https://orcid.org/0000-0001-5604-1846; e-mail: [email protected] Tikunov A.Y. — https://orcid.org/0000-0001-5613-5447; e-mail: [email protected] Panov V.V. — e-mail: [email protected]
Yakymenko V.V. — https://orcid.org/0000-0001-9088-3668; e-mail: [email protected] Zhabykpayeva A.G. — e-mail: [email protected] Epikhina T.I. — e-mail: [email protected]
Rar V.A. — https://orcid.org/0000-0002-5930-5306; e-mail: [email protected] Corresponding author: Yakubovskij V.I. — e-mail: [email protected]
TO CITE THIS ARTICLE:
Yakubovskij VI, Igolkina YP, Tikunov AY, Panov VV, Yakymenko VV, Zhabykpayeva AG, Epikhina TI, Rar VA. Genetic diversity of rickettsias in Dermacentor spp. ticks on the territory of Western Siberia and Northern Kazakhstan. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2023;41(3):25-34. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen20234103125
Введение
Риккетсии — облигатные внутриклеточные грам-отрицательные бактерии, являющиеся эндосимбион-тами и/или паразитами клещей и ряда насекомых [1]. Род Rickettsia подразделяется на несколько групп — группы сыпного тифа (СТ) и клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), а также базальные группы риккет-сий (группы Rickettsia canadensis, «Candidatus Rickettsia mendelii» и Rickettsia bellii) [1, 2]. Самая многочисленная группа риккетсий — группа КПЛ, в ней насчитывается 29 видов, не менее 21 из которых являются патогенными для людей [1, 3]. Показано, что риккетсии могут с высокой степенью эффективности передаваться в клещах трансовариально и трансфазово [4, 5].
Распространенность разных видов риккетсий значительно варьирует в различных регионах (рис. 1). На территории Западной Сибири наиболее часто регистрируется сибирский клещевой тиф (СКТ), этиологическим агентом которого является Rickettsia sibirica subsp. sibirica [4, 6]. Также в регионе отмечены редкие случаи дальневосточного клещевого риккет-сиоза, вызываемого Rickettsia heilongjiangensis [4, 7]. Обе инфекции имеют сходные клинические проявления, включая сыпь, первичный аффект на месте
присасывания клеща, высокую температуру, головную и мышечную боль [4, 6]. Основными переносчиками R. sibirica и R. heilongjiangensis являются клещи Dermacentor spp. и Haemaphysalis concinna, соответственно. В редких случаях R. sibirica выявляется также в клещах H. concinna и Ixodes persulcatus, а R. heilongjiangensis — в I. persulcatus, I. pavlovskyi и Dermacentor nuttalli [8-13].
В последние годы на территории Западной Сибири были установлены случаи нетипичных для данного региона риккетсиозов, вызванных инфицированием Rickettsia raoultii, Rickettsia slovaca, Rickettsia aeschlimannii и «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» [14—16]. Среди «нетипичных» риккетсиозов наиболее часто наблюдались случаи инфицирования людей R. raoultii. Так, в Новосибирской области встречаемость риккет-сиоза, вызываемого R. raoultii, была схожа со встречаемостью СКТ (32,1 и 43,4% от общего числа пациентов, инфицированных риккетсиями, соответственно), в то время как остальные риккетсиозы выявлялись в единичных случаях [15]. Клинические проявления риккетсиоза, вызванного R. raoultii, в основном неспецифичны; это объясняет, почему данный риккет-сиоз ранее не был обнаружен на территории России.
Рис. 1. Места сбора клешей на территории Западной Сибири и Республики Казахстан.
Как в случае инфицирования R. raoultii, так и в случае СКТ, у пациентов наблюдается лихорадка; сыпь и/или первичный аффект достоверно более часто были обнаружены у пациентов с СКТ, а неврологические симптомы — у пациентов, инфицированных R. raoultii [15].
Rickettsia raoultii выявляются преимущественно в клещах рода Dermacentor; также отмечены редкие находки данного вида в H. concinna, I. persulcatus и I.pavlovskyi [8, 10—12, 17]. Первоначально на основании анализа гена gltA было установлено три генотипа R. raoultii, прототипными штаммами для которых являются Marne (генотип RpA4), Elanda-23/95 (генотип DnS28) и Khabarovsk (генотип DnS14) [18, 19]. Позднее было показано, что на территории Дальнего Востока в Dermacentor silvarum широко распространен еще один генотип R. raoultii — Var-Ds [11].
В Казахстане также известны эндемичные регионы по клещевым риккетсиозам; наибольшая встречаемость зарегистрирована в Кызы-лординской и Северо-Казахстанской областях. В среднем заболеваемость риккетсиозами колеблется от 0,4 до 1,8 на 100 тыс. человек в год (~может превышать 300 случаев в год) [20—22]. Информация о видовом разнообразии риккетсий в Казахстане ограничена; к настоящему времени имеются данные лишь по нескольким областям Казахстана. Во всех исследованных областях в клещах рода Dermacentor была обнаружена R. raoultii [21—24]. Кроме того, в южном Казахстане в Dermacentor marginatus была выяв-
лена ДНК R. slovaca, а в Haemaphysalispunctata — ДНК риккетсий, схожих с Rickettsia aeschlimanni [21, 24].
Клещи семейства Ixodidae играют важную роль в поддержании циркуляции риккетсий в природе и в инфицировании риккетсиями людей и других видов позвоночных. Входящие в данное семейство клещи рода Dermacentor являются основными переносчиками двух возбудителей риккетсиозов на территории Сибири — R. sibirica и R. raoultii. На территории Западной Сибири встречаются 4 вида Dermacentor spp. — D. reticulatus, D. marginatus, D. silvarum и D. nuttalli [25, 26]. Изучение инфицированности риккетсиями клещей данного рода имеет ключевое значение для установления эндемичных по клещевым риккетсиозам природных очагов на территории Западной Сибири.
Цель данной работы — изучение видовой принадлежности и генетического разнообразия риккет-сий, выявляемых в клещах рода Dermacentor на территории Западной Сибири и Северного Казахстана.
Материал и методы
В исследование включили 571 клеща, включая 144 из Республики Алтай (136 D. nuttalli и 8 D. silvarum), 47 из Омской области (8 D. marginatus и 39 D. reticulatus), 181 из Новосибирской области (все D. reticulatus) и 199 из Костанайской области, Казахстан (13 D. marginatus и 186 D. reticulatus) (см. рис. 1). Dermacentor reticulatus из Омской области были сняты
Таблица 1. Встречаемость различных видов риккетсий в клешах рода Dermacentor
Вид клеща
N
N (%) клещей, содержащих ДНК риккетсий
все виды
Rr
Rs
Rr + Rs
Rt
Rr + Rt
Ra
R.sp
D. reticulatus D. nuttalli D. marginatus
D. silvarum Все виды
406 136 21 8
196 (48,3) 119(87,5) 10 (47,6) 6 (75,0)
571 331 (58,0)
191 (47,0) 90 (66,2) 8(38,0) 6 (75,0) 295 (51,7)
1 (0,7)
1 (0,1)
27 (19,9) 1 (4,8)
28 (4,9)
1 (0,3)
1 (0,1)
1 (0,7)
1 (0,1)
3 (0,7) 1 (4,8)
4 (0,7)
1 (0,3)
1 (0,1)
Примечание. N — количество клещей; Rr — R. raoultii; Rs — R. sibirica; Rt — «Ca. R. tarasevichiae»; Ra — R. aeschlimannii; R.sp. — Rickettsia spp.
с мелких млекопитающих и претерпевали метаморфоз из стадии личинки в стадию нимфы в лабораторных условиях; 40 клещей из Костанайской области были сняты с животных (собаки и коровы). Все остальные клещи были собраны с растительности на флаг.
Видовая принадлежность клещей была установлена на основании морфологических признаков [26]. У ряда образцов вид клещей был дополнительно подтвержден на основании результатов секвенирования фрагмента внутреннего транскрибируемого спейсе-ра ITS2, как описано ранее [12].
Выделение ДНК проводили с использованием коммерческого набора «Проба НК» (ДНК-технология, Москва) в соответствии с инструкцией производителя. ДНК риккетсий выявляли методом двухраун-довой ПЦР в присутствии родоспецифичных прайме-ров из области гена gltA. Для положительных образцов был проведен второй раунд ПЦР в присутствии прай-меров, специфичных к «Ca. R. tarasevichiae» и к рик-кетсиям из группы КПЛ, как описано ранее [11]. Идентификацию R. sibirica и R. raoultii проводили методом двухраундовой ПЦР в присутствии видо-специфичных праймеров из области гена поверхностного белка OmpA [11]. Для некоторых образцов R. raoultii были дополнительно определены нуклео-тидные последовательности генов ompA (общей длиной 3266 н.п.) и ompB (4851 н.п.), в соответствии с методикой, описанной ранее [27, 28].
Полученные продукты ПЦР были очищены с использованием GTG-агарозы. Секвенирующие реакции проводили в объеме 30 мкл с использованием «BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit» («Applied Biosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Продукты секвенирующей реакции были очищены GFX Columns («Amersham Biosciences», США). Нуклеотидные последовательности были определены с использованием ABI 3500 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», USA) и проанализированы с помощью программы BLASTN. Филогенетический анализ проводили с помощью пакета филогенетических программ MEGA7.0 с использованием метода максимального правдоподобия (ML). Достоверность полученных дендрограмм оценивали с помощью бутстрэп-анализа.
В базу данных GenBank были депонированы последовательности gltA, ompA и ompB генов R. raoul-
tii (ON515499—ON515544), gltA гена R. aeschlimannii и R. aeschlimannii-like (ON515523, ON515524), а также gltA и ompB генов нового генотипа Rickettsia spp. Ko-97-Dr из группы КПЛ (ON515522, ON533890).
95% доверительный интервал (ДИ) уровня ин-фицированности клещей риккетсиями был рассчитан в программе MS Excel.
Результаты и обсуждение
Выявление ДНК риккетсий
На наличие ДНК риккетсий были исследованы образцы от 571 клещей рода Dermacentor (406 D. reticulatus, 136 D. nuttalli, 21 D. marginatus и 8 D. silvarum), собранных на территории четырех регионов Западной Сибири и Северного Казахстана. ДНК Rickettsia spp. была обнаружена во всех исследованных видах клещей; для разных видов уровень инфицированно-сти варьировал от 47,6 до 87,5% и был наибольшим для D. nuttalli (табл. 1).
Для всех выявленных образцов риккетсий была определена их видовая принадлежность; всего в клещах была обнаружена ДНК четырех видов: R. raoultii, R. sibirica, R. aeschlimannii, «Ca. R. tarasevichiae», а также нового генотипа Rickettsia spp. Ko-97-Dr. Все исследованные виды клещей наиболее часто были инфицированы R. raoultii; уровень инфицированности составил 47,0% (95% ДИ 42,2—51,9), 86,8% (95% ДИ 80,1—91,5), 42,8% (95% ДИ 24,5—63,5) и 75,0% (95% ДИ 40,9—92,9) (включая случаи смешанного инфицирования) для D. reticulatus, D. nuttalli, D. marginatus и D. silvarum, соответственно (табл. 1). Полученные результаты согласуются с литературными данными о высокой встречаемости R. raoultii в клещах Dermacentor spp. [8, 11, 17].
Известно, что Республика Алтай имеет одни из наиболее высоких показателей заболеваемости СКТ в РФ. В 2022 г. заболеваемость СКТ в Республике Алтай составила 66,5 на 100 тыс. населения в год, что существенно выше, чем, например, в соседней Новосибирской области (6,4 на 100 тыс.) [29, 30]. В настоящей работе ДНК R. sibirica была обнаружена в 20,6% D. nuttalli из Республики Алтай и в одном D. marginatus из Омской области; при этом за одним исключением R. sibir-ica была выявлена в виде микст-инфекции с R. raoultii. Интересно, что высокий уровень инфицированности D. nuttalli возбудителем СКТ наблюдался в одном участ-
74
БЗ
r— + Kos-61-Dr {ON515520)
- + Kos-76-Dr (ON515521)
• Aft-66-Dn (ON515512)
• Ah-53-Dn (ON515511) R. raouhn strain DnS28 (AF120027)
- + Kos-8-Dr (ON515519) + Kos-64-Dr
R. raoutei isolate Am-650 Ds (MG545017) A Om-26-Dm (ON515513) ■ Ah-2-Ds (ON515514) 65 R. raouhn strain DnS14 (AF120028) + Kos-15-Dr A Kos-60-Dm ■ Alt-5-Ds (ON515509)
• Aft-8-Dn (ON515510) R. raoultn strain RpA4 (AT 120029)
• Kos-193-Dr (ON515515) A Kos-41-Dm + Kos-177-Dr A Om-l-Dm (ON515516) + Om-44-Dr (ON515517)
83 ♦ Nov-21-Dr (ON515518)
— R. massitiae Mtu 1 (U59719)
- A Kos-101-Dm (ON515523)
+ Kos-45-Dr + Kos-122-Dr (ON515524) R. aeschfimaimii strain Stavropol (DQ235776) ■ R. slovaca N.A. 13-B (U59725)
I— R. heflongjiangensis (AY285776)
-R. nctettsa strain Bitterroot (U59729)
75 - R_ conorii Seven (U59730)
R_ sibirica isolate Xinjiang-RP12CP (MG811709)
- R. peacockii strain Rustic (DQ100162) - + Kos-97-Dr (ON515522)
DnS28+ Var-Ds+ new
sequence variants
DnS14
RpM
R. raoutiii
53
]
R.
aeschlimannii
-R. helvetica C9P9 (U59723)
R. monacensis strain IrR/Muntch CDQ100163)
-R. typhi Wilmington (U59714)
КПЛ
ээ
CT
R_ prowazekii (U59715)
100
— iL tarasevichiae strain Podgorodka-29/2003 (DQ168983) R. canadensis 2678 (U59713)
---R. beffii 369L42-1 (U59716)
0.020
Рис. 2. Дендрограмма, построенная ML методом на основе нуклеотидных последовательностей фрагмента гена gltA (610 п.н.) Rickettsia spp.
В узлах дендрограммы указаны индексы поддержки. • — D. nuttalli; ■ — D. silvarum; ▲ — D. marginatus; ♦ — D. reticulatus.
ке в Усть-Коксинском районе (5/31; 16,1%; 95% ДИ 7,1—32,6) и в двух участках в Кош-Агачинском районе (16/35; 45,7%; 95% ДИ 30,5—61,8 и 7/40; 17,5%; 95% ДИ 8,8—47,0), в то время как на третьем участке в Кош-Агачинском районе ДНК К. мЬтеа не была обнаружена ни в одном из 30 исследованных Б. пыЫаШ. Полученные
результаты свидетельствуют о наличии природных очагов СКТ на территории Усть-Коксинского и Кош-Ага-чинского районов.
Помимо К. гаоыИИ и К. мЬтеа, в единичных случаях в исследуемых клещах были выявлены нетипичные для ВегтаеепО 8рр. риккетсии. ДНК «Са. К 1ага8еу-
Таблица 2. Распространение разных геновариантов Rickettsia raoultii в разных видах клешей из различных регионов
Вид клеща (регион)
N клещей с ДНК N генотипиро- -
R. raoultii ванных изолятов RpA4
N изолятов, принадлежащих геноварианту
DnS14
DnS28
Var-Ds
новые генотипы
D. reticulatus (Омская об- 23
ласть)
D. reticulatus (Новосибир- 64
ская область)
D. reticulatus (Костанайская 104
область)
D. marginatus (Омская об- 5
ласть)
D. marginatus (Костанай- 4
ская область)
D. nuttalli (Республика Ал- 118
тай)
D. silvarum (Республика Ал- 6
тай)
23 22 67
5 4 39
6
23 22 43 1 3
1
19 1
14 1
20
7
3
3
ichiae» была обнаружена в одном D. reticulatus из Омской области и одном D. nuttalli из Республики Алтай, а ДНК R. aeschlimannii — в трех D. reticulatus и одном D. marginatus из Костанайской области (Казахстан). Основными переносчиками для «Ca. R. tarasevichiae» являются I. persulcatus [8, 12], а для R. aeschlimannii — клещи рода Haemaphysalis. В частности, R. aeschlimannii были обнаружены в единичных Haemaphysalis на Дальнем Востоке [11], а R. aeschlimannii-like — в H. punctata на юге Казахстана [21, 24]. Нахождение R. aeschlimannii на севере Казахстана наряду с недавним выявлением R. aeschlimannii в клинических образцах пациентов в Новосибирской области [15] свидетельствует о возможном расширении ареала этого патогенного для людей вида риккетсий. Кроме того, в одном D. reticulatus из Костанайской области был обнаружен новый генотип риккетсий (Kos-97-Dr), существенно отличающийся от известных видов (табл. 1).
Генетическая характеристика выявленных
риккетсий
Выявленные образцы R. sibirica были генотипи-рованы по вариабельному гену ompA. Определенные последовательности гена ompA (длиной 488 н.п.) были идентичны для 22 проанализированных образцов и соответствовали последовательности Rickettsia sibirica subsp. sibirica (U83455).
Остальные виды риккетсий были генотипированы по гену gltA. Определенные последовательности гена gltA «Ca. R. tarasevichiae» соответствовали последовательности штамма Podgorodka-29/2003 (DQ168983) и другим известным последовательностям данного вида. Последовательности гена gltA R. aeschlimannii из трех D. reticulatus длиной 607 н.п. соответствовали последовательности штамма Stavropol (DQ235776), а последовательность R. aeschlimannii-like из D. mar-
ginatus (607 н.п.) отличалась от нее тремя нуклеотид-ными заменами, две из которых являлись несинонимичными. Проведенный филогенетический анализ показал, что последовательности R. aeschlimannii и R. aeschlimannii-like с высоким уровнем поддержки образуют общий кластер на дендрограмме (рис. 2).
Новый генотип риккетсий (Kos-97-Dr) был охарактеризован по gltA и ompB генам. Данный изолят по фрагменту гена gltA (882 н.п.) был наиболее схож с R. raoultii штамм Khabarovsk (СР010969), уровень сходства составлял 95,3%; по фрагменту гена ompB (414 п.н.) наибольшее сходство (90,2%) наблюдалось с последовательностью «Candidatus Rickettsia uralica» (OM293672). Филогенетический анализ, проведенный по обоим генам, показал, что новый генотип Kos-97-Dr относится к группе КПЛ, но при этом существенно отличается от известных последовательностей и образует отдельную ветвь на дендрограммах (рис. 2).
Выявленные образцы R. raoultii отличались наиболее высокой генетической вариабельностью. На основании анализа фрагмента гена gltA длиной 610 н.п. было идентифицировано семь сиквенс-вари-антов R. raoultii, различающихся между собой 1—4 ну-клеотидными заменами. Из них четыре варианта соответствовали описанным ранее генотипам R. raoultii (RpA4, DnS14, DnS28 и Var-Ds), а три новых варианта были наиболее схожи с генотипом DnS28 и отличались от него 1—2 заменами (рис. 3). Результаты по встречаемости разных генотипов R. raoultii в разных видах клещей представлены в табл. 2. В D. nuttalli были идентифицированы два генотипа (DnS14 и DnS28), а в D. reticulatus из Западной Сибири — только один генотип — RpA4 (табл. 2). Аналогично, ранее генотипы DnS14 и DnS28 были выявлены в D. nuttalli на территории Алтая и Красноярского края, а генотип RpA4 — в D. reticulatus из различных областей Урала и Сибири [8, 17, 23]. Интересно, что наиболее высокое генетическое разнообразие R. raoultii наблю-
247 273 292 460 S68 577 622 753
genotype DnS14
strain Khabarovsk (AT 120023) T G С A G T A T
Alt-5-Ds
Alt-S-Dn
Kos-60-Dm
Kos-15-Dr * -
genotype DnS2S
strain Et»nda-23/9S {AF120027) A
A]t-22-Dn A
A]t-13-Dn A
Kos-71-Dr A
Kos-16-Dr A
genotype Var-Ds
isolate Am-4i 48-Ds (MG545017) A A
Om-26-Dm A A
A]t-2-Ds A A
ÎS'ew genotype
Kos-S-Dr A С
Kos-61-Dr С A # G
Kov76-Dr A ■ G * С
genotype KpA4
strain Marne (ЛГ120029) T
Om-l-Dm T
Om-44-Dr T
Nov-21-Dr T
Kos-193-Dr T
Kos-41-Dm T
Kos-177-Dr T
Рис. 3. Конденсированное выравнивание последовательностей фрагмента гена gltA основных геновариантов и некоторых исследованных образцов R. raoultii.
Нуклеотидные позиции приведены по последовательности штамма R. raoultii Khabarovsk (AF120028)
далось в D. тИтШт из Северного Казахстана. В этих клещах были выявлены все варианты гена gltA, за исключением Уаг^8; при этом генотип ЯрЛ4 доминировал (табл. 2). Таким образом, некоторые генотипы R. raoultii чаще выявлялись в определенных видах клещей, однако эта ассоциация не является строгой. Проведенный филогенетический анализ по гену gltA показал, что все выявленные в данной работе варианты R. raoultii образуют общий кластер с прототипны-ми штаммами (рис. 2).
Генетическая характеристика Я. тоиЬп по
протяженным фрагментам генов отрА и отрВ
Поскольку основные генотипы R. raoultii различаются лишь единичными заменами по консервативному гену gltA, остается открытым вопрос, соответствуют ли разные генотипы отдельным филогенетическим кластерам по вариабельным генам поверхностных белков. Для ответа на этот вопрос некоторые изоляты R. raoultii, принадлежащие к четырем основным генотипам по gltA гену и выявленные в различных исследованных регионах, были дополнительно охарактеризованы по протяженным фрагментам генов ompA и ompB.
Для 18 образцов были определены последовательности двух фрагментов гена ompA общей длиной более 3282 н.п. Длина первого фрагмента, расположенного на 5'-конце гена, составила 450—540 п.н., а второго фрагмента — 2832—2841 н.п. Определенные последовательности гена ompA образцов, относящихся к генотипам DnS14 (n=5), RpA4 (n=7), DnS28 (n=3) и Var-Ds (я=3) были идентичны для каждого генотипа. Последовательности генотипов DnS28 и Var-Ds были наиболее схожи между собой и различались одной заменой, в то время как генотипы DnS14, RpA4 и DnS28 по исследуемому фрагменту различались 10—12 заменами. Сравнение определенных последовательностей с соответствующими последовательностями прототипных штаммов показало 100% сходство со штаммами Khabarovsk (генотип DnS14) и Marne (генотип RpA4) и 99,97% сходство (1 замена) со штаммом Elanda-23/95 (генотип DnS28). Проведенный филогенетический анализ по гену ompA показал наличие трех кластеров, соответствующих генотипам DnS14, RpA4 и DnS28-Var-Ds (рис. 4).
Последовательности гена ompB длиной 4839— 4851 н.п. были определены для 10 образцов. Определенные последовательности образцов, относящихся к генотипам DnS14 (n=2), DnS28 (n=2) и Var-Ds (n=2), бы-
99
99
78
Rickettsia sp. DnS14 (АН009130) R raoultii str. BIME (CP098324) ■ Att-5-Ds (ON515525+ON515535)
• Att-50-Dn
• Alt-8-Dn {ON515526+ON515536) R. raoultii str Khabarovsk (AH015610)
• Alt-22-Dn
# Att-66-Dn (ON515528+ON515538) R raoultii str Elanda-23/95 (AH009129)
■ A!t-2-Ds (ON515530+ON515540)
■ Alt-3-Ds
A Om-26-Dm (ON515529+ON515539)
75
95
Г R. raoultii is. Tomsk (MK304548) R. raoultii str. Marne (AH009131) ▲ Kos-41-Dm
♦ Om-44-Dr (ON515533+ON515543)
♦ Kos-193-Dr (ON515531+ON515541) ф Nov-21-Dr (ON515534+ON515544) A Om-1-Dm (ON515532+ON515542)
- R. amblyommatis str. Ac (CP012420)
0.0020
DnS14
DnS28 +VarDs
RpA4
Рис. 4. Дендрограмма, построенная ML методом на основе нуклеотидных последовательностей фрагмента гена ompA (3266 п.н.) Rickettsia raoultii. В узлах дендрограммы указаны индексы поддержки.
• — D. nuttalli; ■ — D. silvarum; ▲ — D. marginatus; ♦ — D. reticulatus.
ли одинаковыми для каждого генотипа, но отличались от соответствующих последовательностей прототипных штаммов из базы данных GenBank. Последовательности образцов, относящихся к генотипам DnS28 и Var-Ds, были наиболее схожи и различались одной заменой. На основании анализа гена ompB генотип DnS14 является наименее вариабельным; проанализированные в данной работе образцы из Республики Алтай полностью соответствовали штамму BIME (СР098324) из Китая, но отличались пятью нуклеотидными заменами от других штаммов с Дальнего Востока (штамм Khabarovsk (DQ365798)) и Китая (штамм IM16 (СР019435)). Образцы, относящиеся к генотипу RpA4, показали наибольшее генетическое разнообразие. Всего было идентифицировано 13 вариантов последовательностей, относящихся к генотипу RpA4 (4 из данной работы и 9 из базы GenBank), различающихся между собой 1—8 нуклеотидными заменами, а также делециями в 3 и 9 н.п. Интересно, что последовательность одного образца из Омской области (Om-44-Dr) полностью соответствовала
последовательности образца из Калининградской области (КаИтщгаё-31), несмотря на значительное расстояние между этими областями (рис. 5).
Сравнение всех известных последовательностей исследуемого фрагмента гена отрВ (10 из данной работы и 13 из базы данных ОепВапк) показало, что они различаются между собой 1—23 нуклеотидными заменами, а также наличием делений в 3 и 9 н.п. Проведенный филогенетический анализ изолятов К. гаоыШ по гену отрВ также показал наличие трех кластеров. Первый кластер включает образцы, относящиеся к генотипу ЯрА4; второй кластер состоит из образцов генотипа DnS14 и штамма Б1апёа-23/95, являющегося прототипным для генотипа DnS28; третий кластер включал образцы из данной работы, относящиеся к генотипам DnS28 и Уаг^8 (рис. 5).
Таким образом, проведенный анализ последовательностей отрА и отрВ генов К. гаои1Ш достоверно показал наличие трех генетических групп, которые в основном соответствуют различным генотипам по консерватив-
62
94
F< ▲
I R. rc
rR
L R. I
LjR.
96) R.
R, raoullii str, Crimea-1 (KU961541) ♦ Nov-21-Dr (GN515508) A Om-1-Dm (ON515506)
R. raoultii is Kaliningrad-28 (ON191722) raoultii is. Kalinlngrad-29 (ON191723) . raoultii is. Kaliningrad-30 (ON191724) г R. raoultii str. Marne (DQ365797) П- R. raoultii str. Tomsk (KX258622) R raoultii is. Kalininarad-31 (ON191725) ♦ Om-44-Dr (GN515507) L ♦ Kos-193-Dr(ON515505) R. raoultii str. Krasnoobsk 13-1 (KU310592) raoultii str. Krasnoobsk 13-6 (KU310593)
RpA4
62
68
30
39
R raoultii str Khabarovsk (DQ365798) -R. raoultii str. Elanda-23/95 (EU036984)
R. raoultii str. IM16 (CP019435) ■ Att-5-Ds (ON515499) • Ait-8-Dn (ON515500) R. str BIME (CP098324)
I Alt-53-Dn (ON515501) I Alt-66-Dn (ON515502) A Om-26-Dm (QN515503) ■ Alt-2-Ds (ON515504)
— R. amblyommatis str Ac37 (CP012420)
DnS14
100
64
Var-Ds+DnS28
(10020
Рис. 5. Дендрограмма, построенная ML методом на основе нуклеотидных последовательностей фрагмента гена ompB (4855 п.н.) Rickettsia raoultii. В узлах дендрограммы указаны индексы поддержки.
• — D. nuttalli; ■ — D. silvarum; ▲ — D. marginatus; ♦ — D. reticulatus.
ному гену gltA. Исключение составляют генотипы Var-Ds и DnS28, которые образуют общие кластеры по ompA и ompB генам (см. рис. 4, 5); это позволяет рассматривать Var-Ds как один из вариантов генотипа DnS28. Интересно, что штамм Elanda-23/95 относится к разным филогенетическим кластерам по ompA и ompB генам (рис. 4, 5). Мы полагаем, что штамм Elanda-23/95 не следует рассматривать как типовой штамм для генотипа DnS28, поскольку последовательность гена ompB этого штамма значительно отличается от последовательностей других изолятов данного генотипа.
Заключение
Таким образом, в клещах рода Dermacentor, обитающих на территории Западной Сибири и Северного Казахстана, были обнаружены как типичные для Dermacentor spp. виды риккетсий (R. sibirica и R. raoultii), так и нетипичные виды (R. aeschlimannii, «Ca. R. tara-sevichiae»). Показано существование природных очагов СКТ на территории Республики Алтай. В одном D. reticulatus был обнаружен новый генотип Kos-97-Dr, который нельзя отнести ни к одному из известных видов группы КПЛ.
На основании анализа фрагмента гена gltA было идентифицировано 7 различных аллельных вариантов R. raoultii, 4 из которых соответствовали описанным ранее генотипам. В D. nuttalli были идентифицированы два генотипа (DnS14 и DnS28), а в D. reticulatus преобладал генотип — RpA4. Проведенный анализ ряда изолятов R. raoultii по протяженным фрагментам генов ompA и ompB показал наличие трех генетических групп, которые в основном соответствуют различным генотипам по консервативному гену gltA: 1). DnS14; 2). RpA4; 3). DnS28-Var-Ds. Исключение составляет штамм Elanda-23/95, относящийся к группе DnS28-Var-Ds по гену ompA и к группе DnS14 по гену ompB.
Финансирование работы
Работа поддержана проектом Государственного задания ИХБФМ СО РАН (№121031300043-8).
Соблюдение этических стандартов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Merhej V, Angelakis E, Socolovcshi C, Raoult D. Genotyping, evolution and epidemiological findings of Rickettsia species. Infect Genet Evol. 2014;25:122-137. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2014.03.014
2. Igolkina Y, Nikitin A, Verzhutskaya Y, Gordeyko N, Tikunov A, Epikhina T, et al. Multilocus genetic analysis indicates taxonomic status of «Candidatus Rickettsia mendelii» as a separate basal group. Ticks and Tick-borne Diseases. 2022;14(2):102104.
https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2022.102104
3. List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature — Genus Rickettsia Available online. Accessed February 25, 2023. https://lpsn.dsmz.de/genus/rickettsia
4. Тарасевич И.В. Современные представления о риккетсиозах. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2005;7(2):119-129. Tarasevich IV. Rickettsial Diseases: Current State of the Problem. Klin Mikro-biol antimikrob himioter. 2005;7(2):119-129. (In Russ.).
5. Parola P, Paddock C, Socolovschi C, Labruna MB, Mediannikov O, Kernif T, et al. Update on tick-borne rickettsioses around the world: a geographic approach. Clin Microbiol Rev. 2013;26(4):657-702. https://doi.org/10.1128/cmr.00104-13
6. Рудаков Н.В. Риккетсии ириккетсиозы. Руководство для врачей. Омск: Омский научный вестник; 2016.
Rudakov NV. Rickettsia and rickettsiosis. Guide for doctors. Omsk: Omsk Scientific Bulletin; 2016. (In Russ.)
7. Granitov V, Shpynov S, Beshlebova O, Arsenjeva I, Dedkov V, Safonova M, et al. New evidence on tick-borne rickettsioses in the Altai region of Russia using primary lesions, serum and blood clots of molecular and serological study. Microbes Infect. 2015;17(11-12):862-865. https://doi.org/10.1016/j.micinf.2015.08.011
8. Shpynov S, Fournier P-E, Rudakov N, Samoilenko I, Reshetnikova T, Yastrebov V, et al. Molecular identification ofa collection ofspotted fever group rickettsiae obtained from patients and ticks from Russia. Am J Trop MedHyg. 2006a;74(3):440-443. https://doi.org/10.4269/ajtmh.2006.74.440
9. Shpynov S, Fournier P-E, Rudakov N, Tarasevich I, Raoult D. Detection of members of the genera Rickettsia, Anaplasma and Ehrlichia in ticks collected in the Asiatic part of Russia. Ann NY Acad Sci. 200 6b;1078:378-383. https://doi.org/10.1196/annals.1374.075
10. Shpynov S, Fournier P-E, Rudakov N, Arseneva I, Granitov M, Tarasevich I, Raoult D. Tick-borne rickettsiosis in the Altay region of Russia. Clinical microbiology and infection. 2009;15(2):313-314. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2008.02255.x
11. Igolkina Y, Rar V, Vysochina N, Ivanov L, Tikunov A, Pukhovskaya N, et al. Genetic variability of Rickettsia spp. in Dermacentor and Haemaphysalis ticks from the Russian Far East. Ticks and Tick-borne Diseases. 2018a;9(6):1594-1603. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2018.07.015
12. Rar V, Livanova N, Tkachev S, Kaverina G, Tikunov A, Sabitova Y, et al. Detection and genetic characterization of a wide range of infectious agents in Ixodes pavlovskyi ticks in Western Siberia, Russia. Parasites and vectors. 2017;10(1):258. https://doi.org/10.1186/s13071-017-2186-5
13. Яковчиц Н.В., Бондаренко Е.И., Адельшин Р.В., Мельникова О.В., Вершинин Е.А., Морозов И.М. и др. Выявление ДНК возбудителей клещевого риккетсиоза в клещах на территории Иркутской области. Эпидемиология. 2015;6(85):43-46.
Yakovchitc NV, Bondarenko EI, Adelshin RV, Melnikova OV, Vershinin EA, Morozov IM, et al. Identification of DNA pathogens of tick-borne rickettsiosis in ticks in the Irkutsk region. Epidemiology. 2015;6(85):43-46. (In Russ.).
14. Igolkina Y, Krasnova E, Rar V, Savelieva M, Epikhina T, Tikunov A, et al. Detection of Causative Agents of Tick-Borne Rickettsioses in Western Siberia, Russia: Identification of Rickettsia raoultii and Rickettsia sibirica DNA in Clinical Samples. Clin Microbiol Infect. 2018b;24(2):199.e9-211.e12. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2017.06.003
15. Igolkina Y, Rar V, Krasnova E, Filimonova E, Tikunov A, Epikhina T, Ti-kunova N. Occurrence and clinical manifestations of tick-borne rickettsioses in Western Siberia: First Russian cases of Rickettsia aeschlimannii and Rickettsia slovaca infections. Ticks Tick Borne Dis. 2022;13(3): 101927. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2022.101927
16. Rudakov N, Samoylenko I, Shtrek S, Igolkina Y, Rar V, Zhirakovskaia E, et al. A fatal case of tick-borne rickettsiosis caused by mixed Rickettsia sibirica subsp. sibirica and «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» infection in Russia. Ticks and Tick-borne Diseases. 2019;10(6):101278. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2019.101278
17. Карташов М.Ю., Микрюкова Т.П., Кривошеина Е.И., Кузнецов А.И., Романенко В.Н., Мисквитина Н.С. и др. Генотипирование возбудителей клещевых инфекций в клещах Dermacentor reticulatus, собранных в городских биотопах г. Томска. Паразитология. 2019;53(5):355-369. Kartashov MJ, Mikrjukova TP, Krivosheina EI, Kuznecov AI, Romanen-ko VN, Miskvitina NS, et al. Genotyping of pathogens of tick-borne infections in Dermacentor reticulatus ticks collected in urban biotopes of Tomsk. Parasitology. 2019;53(5):355-369. (In Russ.). https://doi.org/10.1134/S0031184719050016
18. Rydkina E, Roux V, Rudakov N, Gafarova M, Tarasevich I, Raoult D. New Rickettsiae in ticks collected in territories of the former Soviet Union. Emerg Infect Dis. 1999;5(6):811-814. https://doi.org/10.3201/eid0506.990612
19. Mediannikov O, Matsumoto K, Samoylenko I, Drancourt M, Roux V, Rydkina E, et al. Rickettsia raoultii sp. nov., a spotted fever group rickettsia associated with Dermacentor ticks in Europe and Russia. Int J Syst Evol Micro-biol. 2008;58(7):1635-1639. https://doi.org/10.1099/ijs.0.64952-0
20. Дмитровский А.М., Егембердиева Р.А., Ералиева Л.Т., Туребеков Н.А., Шапиева Ж.Ж., Неупокоева А.С. и др. Современные проблемы эпидемиологического надзора за риккетсиозами в Казахстане. Вестник КазНМУ. 2019;3:54-57.
Dmitrovsky AM, Egemberdieva RA, Eralieva LT, Turebekov NA, Shapie-va ZZ, Neupokoeva AS, et al. Present problems of epidemiological surveillance of rickettsiosis in Kazakhstan. Bulletin of KazNMU. 2019;3:54-57. (In Russ.).
21. Turebekov N, Abdiyeva K, Yegenberdiyeva R, Dmitrovsky A, Yeraliyeva L, Shapi-yeva Z, et al. Prevalence of Rickettsia species in ticks including identification of unknown species in two regions in Kazakhstan. Parasit Vectors. 2019;12(1):197. https://doi.org/10.1186/s13071-019-3440-9
22. Hay J, Yeh KB, Dasgupta D, Shapieva Z, Omasheva G, Deryabin P, et al. Biosurveillance in Central Asia: Successes and Challenges of Tick-Borne Disease Research in Kazakhstan and Kyrgyzstan. Front Public Health. 2016;4:4. https://doi.org/10.3389/fpubh.2016.00004
23. Shpynov S, Parola P, Rudakov N, Samoilenko I, Tankibaev M, Tarasevich I, Raoult D. Detection and identification of spotted fever group rickettsiae in Dermacentor ticks from Russia and central Kazakhstan. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2001;20(12):903-905. https://doi.org/10.1007/s10096-001-0638-4
24. Shpynov S, Fournier P-E, Rudakov N, Tankibaev M, Tarasevich I, Raoult D. Detection of a Rickettsia closely related to Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia heilongjiangensis, Rickettsia sp. strain RpA4, and Ehrlichia muris in ticks collected in Russia and Kazakhstan. J Clin Microbiol. 2004;42(5):2221-2223. https://doi.org/10.1128/JCM.42.5.2221-2223.2004
25. Якименко В.В., Малькова М.Г., Шпынов С.Н. Иксодовые клещи Западной Сибири. Фауна, экология, основные методы исследования. Омск: Омский научный вестник; 2013.
Yakimenko VV, Malkova MG, Shpynov SN. Ixodid ticks of Western Siberia. Fauna, ecology, basic research methods. — Omsk: Omsk Scientific Bulletin; 2013. (In Russ.).
26. Филиппова Н.А. Иксодовые клещи подсемейства Amblyomminae. Фауна России и сопредельных стран, Паукообразные. СПб.: Наука; 1997. Filippova NA. Ixodid ticks of the subfamily Amblyomminae. Fauna of Russia and neighboring countries, Arachnids. SPb.: Nauka; 1997. (In Russ.).
27. Fournier P-E, Roux V, Raoult D. Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsiae by stydy oof the outer surface protein rOmpA. International journal oof systematic bacteriology. 1998;48(3):839-849. https://doi.org/10.1099/00207713-48-3-839
28. Igolkina Y, Rar V, Yakimenko V, Tikunov A, Tikunova N. «Candidatus Rick-ettsia uralica» and «Candidatus Rickettsia thierseensis» are genetic variants of one species. Ticks Tick Borne Dis. 2022;13(3):101933. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2022.101933
29. Доклад «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Республике Алтай в 2022 году». 2022;285.
Report «On the state of sanitary and epidemiological well-being of the population in the Altai Republic in 2022». 2022;285. (In Russ.).
30. Государственный доклад «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Новосибирской области в 2022 году». 2022;291. State report «On the state of sanitary and epidemiological well-being of the population in the Novosibirsk region in 2022». 2022;291. (In Russ.).
Поступила в редакцию 04.04.2023 Поступила после доработки 30.04.2023 Принята к публикации 26.05.2023
