CC BY
16УДК !
Anastasia N. Vaganova1
16S RRNA
METHYLTRANSFERASE GENE AS THE TARGET FOR DETECTION OF UREAPLASMA DIVERSUM IN BIOLOGICAL SPECIMENS
Saint-Petersburg Pasteur Institute for Research in Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, 14, ul. Mira, St. Petersburg, 197101, Russia e-mail: [email protected]
Ureaplasma diversum is an opportunistic pathogen in cattle, it may be a causative agent of diseases that significantly affect the productivtty of cattle. A wide spread of these bacteria necessitates the development of such sensitive methods for its detection as real time PCR. The use of 16S rRNA methyltransferase gene as a target for real time PCR allows detection of U. diversum in clinic samples from cattle. Its sequence is species-specific and this permits exclusion of interaction of primers and probes specific to it with DNA of human ureaplasmas and mycoplasmas colonizing bovine reproductive system.
Key words: ureaplasmosis in cattle, PCR, molecular diagnosis, Ureaplasma diversum.
Введение
Ureaplasma diversum — оппортунистический патоген крупного рогатого скота. Вызываемые им заболевания поражают респираторную и репродуктивную системы животных. В то же время носительство этих уреаплазм широко распространено среди поголовья крупного рогатого скота различных стран. В отдельных странах Западной Европы доля животных, являющихся носителями U diversum может составлять 36-40 % от общей численности поголовья [1, 2]. Кроме того, бессимптомные инфекции, вызываемые U diversum, часто становятся причиной абортов, в частности, в Финляндии на сегодняшний день они является ведущей причиной абортов у крупного рогатого скота [3]. У телят заражение U diversum может приводить к развитию бронхопневмоний [4, 5], а также усугублять течение инфекционных заболеваний лёгких, вызванных другими патогенами [6]
Для контроля за распространением U diversum среди поголовья крупного рогатого скота и диагностики ассоциированных с ней заболеваний мо-
577.29
А.Н. Ваганова 1
ГЕН 16S РРНК МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ КАК МИШЕНЬ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ UREAPLASMA DIVERSUM В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ул. Мира, д. 14, Санкт-Петербург, 197101, Россия e-mail: [email protected]
Ureaplasma diversum является оппортунистическим патогеном крупного рогатого скота и может вызывать заболевания, существенно влияющие на его продуктивность. Широкая распространенность бессимптомного носительства этих бактерий обусловливает необходимость разработки чувствительных методов их выявления, таких как ПЦР в реальном времени. Использование в качестве мишени для ПЦР в реальном времени последовательности гена 16S рРНК метилтрансферазы позволяет выявлять U. diversum в клиническом материале от крупного рогатого скота. Данная последовательность является видоспецифичной, за счёт чего исключается взаимодействие распознающих её прай-меров и зондов с ДНК уреаплазм человека, а также микоплазм, колонизирующих репродуктивный тракт крупного рогатого скота.
Ключевые слова: уреаплазмоз крупного рогатого скота, ПЦР, молекулярная диагностика, Ureaplasma diversum.
гут применяться культуральные и молекулярно-биологические методы. Для культивирования и. diversum используются питательные среды, обогащён-ные ростовыми добавками и мочевиной, являющейся основным источником энергии для этих бактерий. Кроме того в состав питательных сред для культивирования уреаплазм вводят антибиотики бета-лактамного ряда, которые блокируют рост посторонних бактерий, но не подавляют рост уреаплазм, благодаря природной устойчивости последних к антибиотикам данной группы [7].
Молекулярно-биологические методы, такие как стандартная полимерная цепная реакция (ПЦР) и ПЦР в реальном времени, отличаются более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с культуральными методами при выявлении микоплазм и уреаплазм [8]. В качестве генетических мишеней для постановки ПЦР применяется ген 16 S рРНК [9-13]. Помимо этого описана методика выявления и. dive-^ит, предполагающая использование в качестве мишени участка межгенного спейсера 16S-23S рРНК.
1. Ваганова Анастасия Николаевна, науч. сотр., e-mail: [email protected] Anastasia N. Vaganova, research associate
Дата поступления - 5 декабря 2018 года
Однако использование данного способа выявления и ссывгвит в практике затруднено, поскольку для идентификации патогена необходима постановка гнёздной ПЦР с использованием в качестве матрицы полученных ампликонов [14] или секвенирование накопленных в ходе ПЦР фрагментов ДНК [15], что увеличивает трудозатраты на исследования и его стоимость.
Геном и. с/мвтит характеризуется малым объёмом и высокой изменчивостью [16]. В структурном плане он представляет собой единичную кольцевую хромосому. Содержание гуанина и цитозина (ГЦ) составляет порядка 28 %, что несколько выше, чем у других уреаплазм (25-27 %), однако также является очень низким. При исследовании единственного на сегодняшний день полностью секвенированного генома и. сСмвгБит было выявлено 646 кодирующих последовательностей (CDSs), 6 генов рРНК и 22 последовательности, кодирующих тРНК. Биоинформатический анализ позволил идентифицировать функцию 374 кодирующих последовательностей [17].
Накопление мутаций происходит у микоплазм, в частности, у уреаплазм, быстрее, чем у большинства микроорганизмов. Эта особенность связана с утратой 3'-5' экзонуклеазной активности их ДНК-полимеразы, в результате чего копирование ДНК при удвоении генома становится менее точным, чем у других организмов [18]. Высокая мутационная изменчивость, отмеченная у и. сСмвгБит затрагивает важные для поддержания жизнедеятельности этих бактерий последовательности, в том числе ^ рРНК. При исследовании данного участка генома и. сСЫвгвит было выявлено по крайней мере 44 однонуклеотидных полиморфизма [19]. Дополнительным источником генетической изменчивости и. сС^вгБит может быть обмен генами с другими видами микоплазм, происходящий путём горизонтального переноса генов. В геноме этих уреаплазм были найдены гены, кодирующие компоненты аппарата конъюгации, характерные для хромосомных элементов, способных к интеграции в геном и переноса путём конъюгации, описанных у микоплазм [20].
Высокая изменчивость и низкое содержание ГЦ затрудняют выбор участков генома, пригодных для подбора к ним видоспецифических праймеров и зондов. Генетическая изменчивость повышает вероятность того, что подобранная система окажется недостаточно чувствительной из-за того, что часть популяции выявляемого патогена будет иметь отличный от описанного нуклеотидный состав данного участка генома. Высокое содержание ГЦ в геноме приводит к тому, что выбор участков, к которым могут быть подобраны праймеры с адекватным (около 50 %) содержанием ГЦ ограничен.
Целью данного исследования была оценка применимости системы праймеров и зондов, подобранных к участку в составе последовательности гена 16 S рРНК метилтрансферазы для выявления ДНК и. сСмвгБит в биологическом материале от крупного рогатого скота.
Материалы и методы
Биологические образцы. Для исследования был использован изолят и. сСЫвгвит из рабочей коллекции Отдела новых технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, выделенный из лёгких телёнка. Изолят культивировался на жидкой питательной среде "УРЕАПЛАЗМА-среда"
(ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург).
В качестве источника ДНК крупного рогатого скота были использованы образцы крови. Отбор венозной крови производился с использованием вакуумных систем забора крови с антикоагулянтом ЭДТА S-Monovette (Sarstedt, Германия).
В качестве контрольных образцов для оценки специфичности системы были использованы препараты ДНК изолятов, хранящихся в рабочей коллекции Отдела новых технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, в том числе Mycoplasma hominis (30 изолятов), U. parvum (7 изолятов), U. urealyticum (7 изолятов). Изоляты M. hominis культивировались на жидкой питательной среде "МИКОПЛАЗМА-среда" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург), изо-ляты микроорганизмов рода Ureaplasma культивировались на жидкой питательной среде "УРЕАПЛАЗМА-среда". Также были взяты образцы ДНК, выделенной из биологического материала от крупного рогатого скота, в которых методом ПЦР в реальном времени было установлено присутствие M. bovis и M. bovigenitalium.
Выделение ДНК. Очистка ДНК из культур микроорганизмов проводилась после их осаждения из культуральной жидкости путём центрифугирования в объёме 1,5 мл при 14100 g.
Выделение ДНК проводилось с использованием набора "ДНК-сорб-B" (ООО "Интерлабсервис", Москва). Для разрушения структур бактериальных клеток к осадку добавляли 300 мкл лизирующего раствора, входящего в состав набора. Осадок ресуспензиро-вали в лизирующем растворе путём вортексирования и помещали на 5 мин в твердотельный термостат для осуществления лизиса при температуре 65 °С. По окончании лизиса пробирки извлекали из твердотельного термостата и в каждую пробирку вносили по 25 мкл сорбента на основе кремниевых частиц. После сорбции в течении 7 мин сорбент очищали от белковых и других примесей путём ресуспендирования в 300 мкл Отмывочного раствора 1, последующего осаждения центрифугированим при 5000 g и удаления супер-натанта (однократно), ресуспендирования в 500 мкл Отмывочного раствора 2 с последующим осаждением сорбента центрифугированием при 10 000 g и удаления супернатанта (двукратно). По окончании процедуры отмывки осадок сорбента высушивали 5 минут при 65 °С, элюцию ДНК проводили в объеме 50 мкл буфера ТЕ 5 минут при 65 °С.
Постановка полимерной цепной реакции. Приготовление реакционных смесей для ПЦр в реальном времени осуществлялось на основе готовой реакционной смеси qPCRmix-HS (ООО "Евроген", Москва) с добавлением раствора MgCl2, 25 ммоль (ООО "Синтол", Москва), олигонуклеотидных праймеров и зондов (синтезированы ООО "Бигль", Санкт-Петербург) и дистиллированной деионизированной воды. Праймеры и зонд имели следующую структуру:
Праймер прямой U.div1 F: 5'-TGCATAGTCAATAGCGGCTTGA-3' Праймер обратный U.div1: R 5'-TTGGCAGGTGTGGACATTCA-3' Зонд: U.div1 Pr:
5'-FAM AACCATTGTCATTGAGACGATTTAGGA-BHQ1-3'
Общий объём реакционной смеси составлял 25 мкл. Перед проведением реакции смесь готовили в общем объёме из расчёта 23 мкл на образец, в том числе 5 мкл реакционной смеси qPCRmix-HS на 1 обра-
зец и 1 мкл раствора MgCl2, 25 ммоль на 1 образец, по 1,5 мкл растворов каждого праймера и зонда с концентрацией 10 пмоль на 1 образец, 12,5 мкл дистиллированной деионизированной воды на 1 образец. Полученную смесь распределяли по пробиркам в соответствии с необходимым числом образцов, по 23 мкл в каждую пробирку. В реакционную смесь вносили по 2 мкл исследуемого препарата ДНК. Контроль температурного режима реакции и детекция накопления флуоресцентного сигнала в ходе реакции ПЦР в реальном времени осуществлялись в термоцик-лере реального времени CFX 96 (Bio-Rad, США). Программа термоциклирования была следующей:
1. Плавление ДНК — 94° С, 4 мин
2. Циклы амплификации ДНК
- плавление ДНК — 94 °С, 15 с
- отжиг праймеров — 60 °С, 30 с
- элонгация — 72 °С, 30 с (с детекцией флуоресцентного сигнала)
Биоинформационный анализ. Подбор праймеров проводился с использованием программы Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Контроль температуры плавления разработанных олиго-нуклеотидов проводился с использованием программы OligoCalc (http://biotools.nubic.northwestern.edu/Oligo-Calc.html). Оценка специфичности праймеров и зондов in silico проводилась с использованием алгоритма nBLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Интерпретация результатов пЦр в реальном времени проводилась с использованием программного обеспечения CFX Manager (BioRad, США)
Результаты и обсуждение
Структура генетической мишени. Выбор мишени для разработки специфических праймеров для выявления ДНК U. diversum проводился на основании анализа структуры генома штамма U. diversum Howard and Gourlay размещенной в базе данных GenBank под номером CP009770.1. При выборе адекватной последовательности учитывались следующие критерии:
1. Содержание Гц. Последовательности с более высоким содержанием ГЦ являются наиболее пригодными для подбора специфических праймеров и зондов. Также гены с более высоким содержанием ГЦ, как правило, являются более стабильными и более значимыми для поддержания жизнедеятельности бактерии. По указанным причинам, искомая последовательность должна была характеризоваться содержанием ГЦ выше среднего показателя для генома U. diversum, то есть более 28,1 %.
2. Данные о функции гена. Искомая последовательность должна была входить в состав жизненно-важного гена, утрата которого привела бы к гибели организма.
На основании указанных критериев в качестве мишени для праймеров и зондов был выбран участок JM47_01780, соответствующий гену 16S рРНК мети-лтрансферазы и содержащий 29 % ГЦ. Ферменты данного семейства участвуют в процессе синтеза белка и являются консервативными жизненно-важными белками. К данному участку генома была подобрана система из пары праймеров (праймер F и праймер R) и зонда. Для осуществления подбора праймеров была использована программа Primer BLAST, температура их плав-
ления составила 60,5 °С. Температура плавления зонда составила 64,6 °С.
Оценка специфичности праймеров и зондов in si'lico. Для оценки пригодности разработанной системы для дальнейшего использования с целью выявления ДНК U. diversum в клиническом материале было проведено её исследование с использованием биоинформационных методов. Сопоставление последовательностей праймеров и зондов с последовательностями ДНК других организмов, депонированных в базе данных GenBank, проведённое с помощью с помощью алгоритма nBLAST, показало, что имеющиеся совпадения структуры парймеров и зондов с последовательностями в геномах других организмов не превышают 57 % и не связаны с возможностью неспецифического взаимодействия компонентов системы с ДНК, представленной в клиническом материале от крупного рогатого скота. Были выявлены фрагментарные совпадения с ДНК люцерны усечённой (Medicago truncatula), Moraxella catarrhalis, американского ламантина (Trichechus manatus), дрожжей вида Kockovaella imperatae, тиляпии нильской (Oreochromis nl/oticu£), чёрного ринопитека (Rhinopithecus bieti) и карликового цепня (Hymenolepis nana).
Присутствие генетического материала данных организмов в репродуктивном и респираторном системе крупного рогатого скота маловероятно, а прекрёст-ное взаимодействие разработанной системы прайме-ров и зондов с ним исключается, поскольку выявленные комплементарные участки соответствуют только отдельным фрагментам её компонентов.
Оценка специфичности праймеров и зондов in vitro. С целью контроля аналитической специфичности разработанной системы праймеров и зондов была проведена постановка ПЦР в реальном времени с различными образцами ДНК M. hominis, U. parvum, U. ureaiyticum, а также из биологического материала от крупного рогатого скота, содержавшего M. bovis и M. bovigenitalium. Данный материал был выбран в качестве контрольных образцов по следующим причинам:
1. Указанные бактерии относятся к одному семейству с U. diversum.
2. M. bovis и M. bovigenitalium способны вызывать заболевания, сходные по симптоматике уреаплазмозом крупного рогатого скота.
В ходе контроля аналитической специфичности разработанной системы праймеров и зондов было подтверждено отсутствие неспецифического взаимодействия компонентов системы с ДНК M. hominis, M. bovis, M. bovigenitalium, U. parvum, U. ureaiyticum, а также отсутствие неспецифического взаимодействий компонентов системы, с ДНК крупного рогатого скота. Эти, полученные экспериментальным путём, данные об аналитической специфичности разработанных прайме-ров и зондов позволяют сделать заключение об их пригодности для выявления ДНК U. diversum в клиническом материале от крупного рогатого скота.
Таким образом, на основании биоинформационного анализа и экспериментальных данных, можно заключить, что выбранный участок генома является видоспецифичным для U. diversum и отсутствует у близкородственных бактерий.
Аналитическая чувствительность системы праймеров и зондов к участку гена 16 S рРНК метилтрансферазы. Важными параметрами систем
ПЦР в реальном времени являются аналитическая чувствительность реакции.
Под аналитической чувствительностью подразумевается минимальное число копий ДНК, выявляемых системой. Для проведения оценки данного параметра оптимизации были подготовлены образцы, содержащие ДНК и. сТмвгвит в концентрации 1000, 100, 10 и 1 геномных эквивалентов (ГЭ) на мкл, что соот-
ветствовало 10000, 1000, 100 и 10 ГЭ на аликвоту объёмом 10 мкл. С использованием разработанной системы праймеров и зондов ДНК и. с1мвгвит была выявлена во всех образцах. При параллельно проведённом исследовании отрицательного контрольного образца, содержавшего деионизированную дистиллированную воду, ДНК и. бмвгБит выявлено не было (рисунок).
- л
*•■ / / /
У / /
А/ /
/ У /
///
// A
.............///......i.............^.....
/ //
/ // /
» — l _____
10 20 30 40
Cycles
Standard Curv«
Log Starting Quantity
15 Standard X Unknown
I AM I - Ml «*. 97П Slúpe^-З.ЗвО y-uil*:M !>№
Рисунок. Графики накопления продукта в ПЦР в реальном времени с праймерами к гену 16Б рРНК метилтрансферазы и. diversum при постановке реакции с образцами, содержащими 10000, 1000, 100 и 10 ГЭ.
Заключение
В данном исследовании была предложена система праймеров и зондов, комплементарных видоспе-цифическому участку в составе генома U. diversum. Данный участок является частью консервативного жизненно-важного гена 16S рРНК метилтрансферазы. Высокая аналитическая чувствительность ПЦР в реальном времени с разработанными праймерами и зондами и отсутствие их перекрёстных взаимодействий с генетическими структурами других организмов позволяют рассматривать её в качестве метода диагностики уреаплазмоза крупного рогатого скота.
Литература
1. Le Grand D, Poumarat F, Mattel J.L. Genital Ureaplasma diversum infection: investigations in cattle in France // Vet Res. 1995. V.2. N. 1. P. 11-20.
2. Petit T, Spergser J,, Aurich J,, Rosengarten R. Prevalence of Chlamydiaceae and Mollicutes on the genital mucosa and serological findings in dairy cattle // Vet Microbiol. 2008. Vol. 127. N. 3-4. P. 325-333. DOI: 10.1016/j.vetmic.2007.08.022.
3. Syrjala, P, Anttila, M, Dillard, K, Fossi M, Collin K, Nyuund M., Autio T. Causes of bovine abortion, stillbirth and neonatal death in Finland 1999-2006 // Acta Vet Scand. 2007. Vol. 49. N. 1. P. 3. D0I:10.1186/1751-0147-49-S1-S3.
4. Gagea M.I, BBateman K.G, van Dreumel T, McEwen B.J, Carman S, Archambault M, Shanahan R.A, Caswell J.L. Diseases and pathogens associated with mortality in Ontario beef feedlots // J Vet Diagn Invest. 2006. Vol .18. N. 1. P. 18-28. DOI: 10.1177/104063870601800104.
5. Tegtmeier C, Uttenthal A, Friis N.F, Jensen N.E, Jensen H.E. Pathological and microbiological studies on pneumonic lungs from Danish calves // Zentralbl Veter-inarmed B. 1999. V. 46. N. 10. P. 693-700.
6. Larsen L.E., Tegtmeier C., Pedersen E. Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) pneumonia in beef calf herds despite vaccination // Acta Vet. Scand. 2001. Vol.
42. N. 1. P. 113-121. DOI: 10.1186/1751-0147-42-113.
7. Krieg N.R. , Staley J.T, Brown D.R. [et al,]. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 4. 2nd Edition. NY: Springer-Verlag, 2011. 949 p. DOI: 10.1007/978-0-387-68572-4.
8. Stel/recht K.A, Woron A.M., Mishirik N.G, Ve-nezia R.A. Comparison of multiplex PCR assay with culture for detection of genital mycoplasmas // J. Clin. Microbiol. 2004. Vol. 42. N. 4. P. 1528-1533. DOI: 10.1128/JCM.42.4.1528-1533.2004.
9. Kishimoto M, Tsuchiaka S., Rah paya S.S., Hasebe A, Otsu K, Sugimura S, Kobayashi S, Komatsu N, Nagai M, Omatsu T, Naoi Y, Sano K, Okazaki-Terashima S, Oba M, Katayama Y, Sato R, Asai T, Mi-zutani T. Development of a one-run real-time PCR detection system for pathogens associated with bovine respiratory disease complex // J. Vet. Med. Sci. 2017. Vol. 79. N. 3. P. 517-523. DOI: 10.1292/jvms.16-0489.
10. León B.A, Campos E, Bolaños H, Caballero M. Risk factors for Ureaplasma diversum infections in cattle of a tropical environment // Rev Biol Trop. 1995. Vol.
43. N. 1-3. P. 21-25.
11. Santos S.B., Pinheiro-Júnior J.W, Mota A.R, Santos A.S, Alves B.H.L.S, Oliveira J.M.B, Silva L.B.G, Mota R.A. Recovery of Mollicutes from the reproductive tract of dairy cattle in the state of Pernambuco, Brazil // Pesq. Vet. Bras. 2015. Vol. 35. N. 6. P. 491-496. DOI: 10.1590/S0100-736X2015000600001.
12. Tramuta C, Lacerenza D, Zoppi S, Goria M, Dondo A, Ferroglio E, Nebbia P., Rosati S. Development of a set of multiplex standard polymerase chain reaction assays for the identification of infectious agents from aborted bovine clinical samples // J. Vet. Diagn. Invest. 2011. V. 23. N. 4. P. 657-664. DOI: 10.1177/1040638711407880.
13. Tully G.J., Razin S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology: Diagnostic Procedures Elsevier, Cambridge. 1996. 466 p. DOI: 10.1016/B978-0-12-583805-4.X5000-6.
14. Vottaretii DC, de Alcantara B.K, Lunardi M, A/fieri A.F, de Arruda Leme R, Alfíeri A.A. Anested-PCR strategy for molecular diagnosis of mollicutes in uncultured biological samples from cows with vulvovaginitis // Anim Reprod Sci. 2018. Vol. 188. P. 137-143. DOI: 10.1016/j.anireprosci.2017.11.018.
15. Sosa C, Tirante L, Chaves J,, Pol M, Am-brogi A., Giraudo J.A,, Tamiozzo P. Identification of species of Mycoplasma and Ureaplasma diversum from Argentinian dairy herds // Rev Argent Microbiol. 2018. Vol. 50. N. 1. P. 31-35. DOI: 10.1016/j.ram.2017.02.010.
16. Pollack J.D. The necessity of combining genomic and enzymatic data to infer metabolic function and pathways in the smallest bacteria: amino acid, purine and pyrimidine metabolism in Mollicutes // Front Biosci. 2002. N. 7. P. 1762-1781.
17. Marques L.M., Guimaraes A.M., Martins H.B., Rezende I.S, Barbosa M.S., Campos G.B., do Nascimento N.C., Dos Santos A. P., Amorim A.T, Santos V.M., Messick J.B., Timenetsky J. Genome Sequence of Ureaplasma diversum Strain ATCC 49782 // Genome Announc. 2015. Vol. 3. N. 2. P. 314-315. DOI: 10.1128/genomeA.00314-15.
18. Bäbäar C., Pereyre S., Peuchant O. Mycoplasma pneumoniae, susceptibility and resistance to antibiotics // Future Microbiol. 2011. Vol.6. N. 4. P. 423-431. DOI: 10.2217/fmb.11.18.
19. Marques L.M, Buzinhani M, Guimaraes A.M., Marques R.C., Farias S.T., Neto R.L., Yamagut i M, Oliveira R.C., Timenetsky J. Intraspecific sequence variation in 16S rRNA gene of Ureaplasma diversum isolates // Vet Microbiol. 2011. Vol. 152. N. 1-2. P. 205-211. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.04.007.
20. Citti C, Dordet-Frisoni E, Nouvel L.X., Kuo C.H, Baranowski E Horizontal Gene Transfers in Mycoplasmas (Mollicutes) // Curr Issues Mol Biol. 2018. V. 29. N. 3. P. 22. DOI: 10.21775/cimb.029.003.
