CC BY
75
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Валентина Петровна Дерягина1, Наталья Ильинична Рыжова2, Ирина Сергеевна Голубева3
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ И ОБРАЗОВАНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ОКСИДА АЗОТА В ОРГАНИЗМЕ МЫШЕЙ С ПЕРЕВИВАЕМЫМИ ОПУХОЛЯМИ
1 К. б. н., старший научный сотрудник, группа профилактики канцерогенных воздействий отдела
химического канцерогенеза НИИ канцерогенеза РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
2 К. б. н., старший научный сотрудник, группа профилактики канцерогенных воздействий отдела
химического канцерогенеза НИИ канцерогенеза РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
3 К. б. н., ведущий научный сотрудник, группа первичного отбора, лаборатория биохимической фармакологии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, группа профилактики канцерогенных воздействий отдела химического канцерогенеза, Дерягина Валентина Петровна; e-mail: [email protected]
В экспериментах на мышах изучены в динамике функциональная активность фагоцитов крови и перитонеальной жидкости, а также образование производных N0 — нитратов и нитритов в организме мышей с перевиваемыми карциномой легкого Льюиса и карциномой Эрлиха. Показано, что рост ме-тастазирующей карциномы Льюиса сопровождается подавлением эндогенного образования производных N0 и снижением образования активных форм кислорода нейтрофилами крови в спонтанном состоянии. Суммарное количество нитросоединений, выделяемое с мочой у мышей с карциномой Льюиса, было на 22,5—70,7% меньше, чем в контроле. Концентрация нитросоединений в пересчете на нитраты в опухолевой ткани изменялась в пределах (2,83—5,16) х 10-6 моль/кг ткани и мало зависела от стадии роста карциномы Льюиса. Величина значимого снижения спонтанной хемилюминесцентной активности нейтрофилов крови составила при росте карциномы Льюиса 36,8—87% и карциномы Эрлиха — 44,7%. При этом фагоцитозависимая хемилюминесценция стимулированных нейтрофилов в крови мышей с опухолями была в 1,7—9 раз (р < 0,01) больше, чем в контроле. Спонтанная хемилюминесцентная активность перитонеальных макрофагов и моноцитов не отличалась от контроля, а фагоцитозависимая хемилюминесценция стимулированных клеток возрастала в 2,2—4,5 раза (р < 0,05; р < 0,01) на всех этапах роста карциномы Льюиса.
Ключевые слова: мыши, карцинома легкого Льюиса, карцинома Эрлиха, нейтрофилы, макрофаги, активные формы кислорода, производные оксида азота.
В системе противоопухолевой защиты важная роль принадлежит эффекторным клеткам неспецифической противоопухолевой резистентности, к которым относят естественные киллерные клетки, макрофаги, нейтрофи-лы, дендритные клетки и др. [1; 2].
© Дерягина В. П., Рыжова Н. И., Голубева И. С., 2011 УДК 616-006.6-092.9:616.155.3
Являясь первым барьером на пути возникновения, роста и распространения опухолевых клеток, макрофаги и нейтрофилы способны распознавать, подавлять и элиминировать их из организма. Цитотоксическое действие активированных макрофагов и нейтрофилов на опухолевые клетки осуществляется с помощью разных механизмов, в том числе в результате активации NADPH-зависимой оксидазы. Это приводит к образованию ряда
активных форм кислорода (АФК): супероксид-анион-ра-дикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода, а также оксида азота и др. Эти соединения обладают мощным окислительным и антимикробным потенциалом и в значительной мере определяют цитостатическое и цитотоксическое действие макрофагов и нейтрофилов, в том числе по отношению к опухолевым клеткам [3; 4]. Существует мнение, согласно которому локальное или системное подавление активности эффекторных клеток естественной резистентности рассматривается как необходимое условие развития опухоли и ее метастазов [5].
Помимо макрофагов и нейтрофилов оксид азота N0 секретируется некоторыми клетками и тканями: кардио-миоцитами, гепатоцитами, гладкомышечными элементами сосудов, опухолевой тканью и др. Многократное повышение образования N0 при опухолевом росте является следствием активации одной из изоформ N0-синтазы — индуцибельной N0-синтазы (iN0S) под влиянием цито-кинов: интерлейкина-1 и интерлейкина-2, интерферона-у или его комбинации с а- и Р-факторами некроза опухоли, а также с липидом А (Р) и т. д. [6; 7]. Малые размеры и отсутствие заряда обеспечивают молекуле N0 высокую проницаемость через мембраны клеток и субклеточных структур, а наличие одного неспаренного электрона придает ей высокую реакционную способность. Оксид азота вызывает разнонаправленные биологические эффекты, которые определяются многими факторами: природой донора N0, концентрацией, экспозицией, продуктами реакции с ключевыми реагентами (кислород и его активные формы, углекислый газ и др.) и мишенями (металлы, тиолсодержащие аминокислоты, белки и др.).
Роль N0 в канцерогенезе также неоднозначна. Повышенное образование N0 может обусловить повреждения структуры ДНК, стимулировать ангиогенез, инвазирование и метастазирование опухолей и др. В то же время N0 может запускать процессы апоптической гибели злокачественных клеток [8—11]. Ряд авторов рассматривают восстановление подавленной экспрессии iN0S в качестве терапевтической меры при прогрессировании и метастазировании опухолей [12; 13]. В ранее выполненных нами экспериментальных исследованиях нитропруссид натрия (источник N0) в зависимости от дозы проявлял разнонаправленное действие на рост карциномы Эрлиха (КЭ) [14]. В клинических исследованиях показана целесообразность использования препаратов — доноров N0, способных повышать эффективность ряда клинически значимых способов лечения онкологических заболеваний [12; 15; 16].
Согласно результатам экспериментальных и клинических исследований, экспрессия iN0S резко варьирует в зависимости от гистогенеза, стадии развития опухоли. В связи с этим существенный научный и практический интерес представляет изучение уровней биосинтеза N0 в организме на моделях опухолевого роста, а также реакции клеток врожденного иммунитета на рост трансплантированных опухолевых клеток у мышей в зависимости от стадии опухолевого процесса.
Целью настоящего исследования является изучение в динамике функциональной активности нейтрофилов крови и макрофагов перитонеального содержимого, а
также эндогенного образования N0 в организме мышей с перевиваемой карциномой Льюиса (КЛ) и КЭ.
В исследовании определены следующие задачи:
1) изучить функциональную активность нейтрофилов крови и макрофагов перитонеальной жидкости (ПЖ), определяемую по образованию АФК, в процессе роста КЛ у мышей;
2) изучить функциональную активность нейтрофилов крови и макрофагов ПЖ у мышей на поздних стадиях развития КЭ;
3) изучить эндогенное образование производных оксида
азота — нитритов и нитратов у мышей в процессе роста КЛ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проведены на 106 мышах массой 20—22 г разводки питомника «Столбовая» РАМН, с использованием двух моделей опухолевого роста: перевиваемой КЛ — 60 мышей-самцов Fl (С57В1хСВА) и перевиваемой КЭ — 14 мышей-самцов С57В1 и 32 мышей-самцов F1(C57BlхCBA). Мышей содержали в условиях вивария с обычным режимом питания. Опухолевые клетки КЛ и КЭ (штаммы получены из банка РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН) перевивали подкожно методом инокуляции соответственно в правую подмышечную или правую паховую область. Каждой мыши вводили по 50 мг опухолевой взвеси КЛ в среде 199 в разведении 1 : 10 (5 х 106 клеток) или 106 клеток КЭ в 0,5 мл раствора Хенкса. Мышей F1 (С57В1хСВА) разделили на 6 равноценных групп: I группа — здоровые (контроль); II—VI группы — мыши с перевиваемой КЛ. Функциональную активность нейтрофилов крови и макрофагов у мышей I—V групп определяли до перевивки опухоли и после нее на 6, 13, 20 и 27-е сутки. Выделение нитратов и нитритов с мочой за сутки определяли на 2, 9, 16, 21 и 30-й день роста КЛ у мышей VI группы. Функциональную активность нейтрофилов крови у мышей с КЭ определяли на 26, 33 и 37-е сутки роста опухоли в 3 опытах.
Схема эксперимента отражена в табл. 1, 2. Образование АФК фагоцитами крови и ПЖ (ней-трофилами, моноцитами и макрофагами) анализировали хемилюминесцентным методом, используя прибор Биолюмат, модель 9500 («ВегШооЫ», Германия) [17; 18]. Кровь, полученную после декапитации под эфирным наркозом животных (с добавлением гепарина 10 ед/мл), разводили в 4 раза раствором Хенкса, содержащим буфер HEPPES (5 мг на 100 мл раствора). Резидентные клетки ПЖ получали промыванием брюшной полости раствором Хенкса в объеме 2 мл. Клетки ПЖ осаждались на предметном стекле в термостате при температуре 37 °С в течение 20 мин, затем их фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому—Гимзе. Количество клеток в крови и ПЖ подсчитывали в камере Горяева, клеточный состав определяли в окрашенных мазках по морфологическим критериям.
Для постановки реакции спонтанной хемилюминес-ценции (СХЛ) и фагоцитозависимой хемилюминесцен-ции (ФЗХЛ) крови и клеток перитонеального содержимого смешивали с 0,2 мл раствора Хенкса + 0,1 мл люминола (0,56 мМ) + 0,1 мл разведенной крови или 0,1 мл ПЖ. В качестве активатора фагоцитоза использовали зимо-
Таблица 1
Лейкоцитарный состав крови мышей-самцов С57В1 и Р,(С57В!хСБА) с подкожно перевиваемой КЭ
Номер опыта (сутки после перевивки опухоли) Число живот- ных Число лейкоцитов, x 103/мкл Содержание в крови, %
эозинофилов моноцитов нейтрофилов лимфоцитов
Опыт 1
Мыши p1 контроль 8 4,7 ± G,6 G,5 ± G,8 (G,G2 ± G,G3) 3,3 ± 2,3 (G,16 ± G,11) 12,9 ± 4,G (G,61 ± G,19) 83,3 ± 4,9 (3,91 ± G,23)
Мыши P1 с Ю (26-е) 8 2,8 ± G,53 G ± G 2,4 ± 1,4 (G,G7 ± G,G4) 24,5 ± 4,4 (G,69 ± G,12)3 73,1 ± 4,4 (2,G4 ± G,12)
Опыт 3
Мыши С57ВІ контроль 5 3,77 ± G,45 G 8,8 ± 2,6 (G,33 ± G,1) 12,2 ± 3,2 (G,46 ± G,12) 79 ± 3,5 (2,98 ± G,13)
Мыши С57ВІ с га (37-е) 9 4,61 ± 1,8 G,4 ± G,7 (G,G2 ± G,G4) 12,4 ± 5,8 (G,57 ± G,27) 45,6 ± 9,4 (2,1 ± G,43)3 41,6 ± 9,6 (1,92 ± G,44)3
а р < G,G1 по сравнению со здоровыми животными.
зан или Candida albicans, опсонизированные сывороткой, которую получали от 10—12 здоровых доноров. Люминолзависимую хемилюминесценцию (ХЛ) измеря-
ли в течение 60 мин с интервалом 5 мин. Известно, что хемилюминесцентный ответ крови и ПЖ определяется в основном фагоцитирующими клетками: нейтрофилами,
Таблица 2
Хемилюминесцентная активность крови мышей C57BI и Fi(C5?BIxCBA) с перевиваемой КЭ
Номер опыта (сутки после перевивки КЭ) Число животных ХЛ, имп./мин на 103 нейтрофилов
СХЛ ФЗХЛ коэффициент усиления
Опыт 1
Мыши p1 контроль 8 63,G ± 21 379 ± 9G3 6,G
Мыши P1 с KЭ (26-е) 8 73 ± 3G 1G55 ± 255а б 14,4
Опыт 2
Мыши P1 контроль 8 4,3 ± 1,6 26,4 ± 9,6а 6,1
Мыши P1 с KЭ (33-е) 8 3,9 ± 2,5 237,6 ± 12G,G36 6G,9
Опыт 3
Мыши С57ВІ контроль 5 33,8 ± 4,7 113,8 ± 15,9в 3,4
Мыши С57ВІ с KЭ (37-е) 8 18,7 ± 13,3г 1G3,G ± 77,1в 5,5
а Клетки стимулированы зимозаном. б р < 0,01 по сравнению со здоровыми животными. в Клетки стимулированы С. а1Ысапэ. г р < 0,05 по сравнению со здоровыми животными.
макрофагам и моноцитами, способными продуцировать АФК. Учитывая клеточный состав, можно принять, что в крови уровень АФК определяется в основном нейтро-филами. Ввиду малого количества моноцитов в крови и более низкой хемилюминесцентной активности (почти в 10 раз) их вклад в общий хемилюминесцентный отклик крови незначительный [19]. В ПЖ хемилюминес-центный ответ определяется в основном макрофагами и моноцитами, количество которых намного больше, чем нейтрофилов. В то же время при опухолевом росте в ПЖ возможно увеличение доли нейтрофилов, более активно выделяющих АФК. В таком случае при расчете хемилюминесцентной активности (ХЛА) моноцитов и макрофагов необходимо учитывать и активность нейтрофилов. Принимая за единицу ХЛА 1 моноцита или макрофага (ХЛАм) и за 10 — ХЛА 1 нейтрофила и обозначая m, n соответственно число макрофагов и нейтрофилов, приходим к выводу, что:
ХЛА ПЖ — ХЛАпер.жид. = ХЛАм x (m + 10 n).
Отсюда ХЛА одного макрофага или моноцита может определяться как частное от деления:
ХЛАпер.ЖИд. / (m + 10 n).
Для сбора мочи по 5 мышей помещали в обменные клетки на сутки, лишив корма при свободном доступе к бидистиллированной воде. Во избежание окисления нитритов в емкости для сбора мочи вносили 0,3 мл 30% гидроксида натрия. Содержание нитритов в моче определяли общеизвестным методом Грисса, а нитраты предварительно восстанавливали свежеприготовленным кадмием до нитритов (рН 9,6) и анализировали тем же методом [20].
Статистическую обработку осуществляли с помощью t-критерия Стьюдента и регрессионного анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУжДЕНИЕ
Общее количество лейкоцитов в крови мышей с КЛ увеличивалось на 3-й неделе роста опухоли и достигало своего максимума к концу опыта до (8,03 ± 5,16) x 103/мкл, что в 2,4 раза (р < 0,05) выше, чем у животных контрольной группы. С нарастанием массы опухоли доля нейтрофилов и их абсолютное количество в крови мышей с КЛ также увеличивались, составляя соответственно 51,6 ± 9,3% и (4,14 ± 0,75) x 103/мкл, что в 4,2 и 10,1 раза превышало значения контроля. При этом оба показателя находились в положительной линейной зависимости от массы опухоли (коэффициент детерминации г составил 0,98 и 0,96 соответственно).
При определении СХЛ выявлено выраженное подавление на 36,8—87,0% образования АФК у мышей с КЛ по сравнению с контролем (табл. 3). В целом СХЛ нейтрофилов крови снижалась по мере развития опухолевого процесса; данные регрессионного анализа свидетельствуют, что СХЛ имеет с массой КЛ отрицательную линейную связь (коэффициент детерминации —0,70).
Результаты измерения ФЗХЛ нейтрофилов крови при их активации, которая раскрывает функциональные возможности гранулоцитов, показывают, что у мышей с КЛ эти клетки не утрачивают способность продуцировать метаболиты кислорода. Более того, активность нейтрофилов нарастает к 13-м суткам роста КЛ, превышая в 2,7 раза (р < 0,01) этот показатель у кон-
трольных мышей. На более поздних сроках роста опухоли ФЗХЛ нейтрофилов крови медленно снижается, но даже на 27-е сутки (окончание опыта) остается в 1,7 раза (р < 0,01) выше, чем в контроле.
По данным определения количества перитонеальных клеток и их видового состава у мышей с КЛ (табл. 4), к 6-м суткам число клеток несколько увеличивается, затем с 13-х по 20-е сутки уменьшается в 2,3—2,5 раза (р < 0,01). На заключительной стадии роста опухоли число перитонеальных клеток увеличивается, но не достигает уровня контроля. Следует отметить, что относительное количество макрофагов + моноцитов в ПЖ, начиная со 2-й недели роста КЛ, увеличивается до 49,5%. В то же время абсолютное количество клеток этого вида было снижено на 35,2—42,9% (р < 0,01) по сравнению с аналогичным показателем у здоровых животных.
При измерении СХЛ перитонеальных макрофагов и моноцитов у мышей с КЛ не выявлены различия по сравнению с аналогичным показателем у мышей контрольной группы (табл. 5). Однако при стимуляции макрофагов зимозаном показатель ФЗХЛ активности на стадии интенсивного роста КЛ и до конца опыта (на 13, 20 и 27-е сутки роста) был в 2,2—4,5 раза (р < 0,05; p < 0,01) выше, чем у здоровых мышей.
По данным сравнения коэффициентов усиления ХЛ фагоцитов при их стимуляции (рассчитанных как отношение ФЗХЛ к СХЛ) у мышей с КЛ способность ней-трофилов крови положительно реагировать на стимул в 3,9—13,4 раза, а способность перитонеальных макрофагов — в 1,6—3,2 раза выше, чем у мышей контрольных групп (см. табл. 3, 5).
Результаты определения функциональной активности фагоцитов у мышей с подкожно перевиваемой КЭ на поздней стадии ее развития (26, 33 и 37-е сутки) отражены в табл. 1, 2. Как и в экспериментах на мышах с перевиваемой КЛ, рост КЭ характеризовался повышением в 1,9—3,7 раза (р < 0,01) относительного количества нейтрофилов крови и тенденцией к снижению их спонтанной активности. Наряду с этим при стимулировании нейтрофилов C. albicans или зимозаном регистрировали увеличение в 2,8—9 раз (р < 0,01) ФЗХЛ по сравнению с таковой у здоровых мышей. Более высокие (в 1,6—10 раз) коэффициенты усиления хемилюминесцентной активности нейтрофилов у мышей с КЭ (см. табл. 2) указывают на более выраженную потенциальную способность их реагировать на стимул по сравнению с нейтрофилами крови контрольных мышей.
При определении нитратов и нитритов в моче мышей в разные сроки роста КЛ получены результаты, отражающие суммарное количество окисленных продуктов NO, которые образовались в организме (табл. 6). Согласно приведенным данным, только на 2-е сутки после перевивки КЛ отмечали увеличение выделения нитратов и нитритов с мочой, что может свидетельствовать об интенсификации их эндогенного образования. В дальнейшем, начиная со 2-й недели роста КЛ и по 30-е сутки включительно у мышей с опухолями общее выделение нитросоединений (НС) было снижено на 22,5— 70,7%. На всех сроках контроля у мышей с КЛ регистрировали уменьшение экскреции с мочой как нитритов, так и нитратов.
Таблица 3
СХЛ и ФЗХЛ нейтрофилов крови мышей Р, с перевиваемой КЛа
Группа, (сутки после перевивки опухоли) ХЛ, имп./мин на 103 нейтрофилов Масса опухоли, г
СХЛ ФЗХЛ коэффициент усиления ХЛ
I. Контроль — здоровые мыши 78,6 ± 51,6 471,2 ± 159,2 6,0 0
Опыт, мыши с КЛ
II (6-е) 27,3 ± 9,0б 643,0 ± 256,7 23,6 0,15 ± 0,07
III (13-е) 49,7 ± 30,1 1284,2 ± 854б 25,8 1,73 ± 0,61
IV (20-е) 15,0 ± 6,7б 1003,6 ± 407б 66,9 4,5 ± 1,6
V(27-е) 10,2 ± 6,1б 816,7 ± 245,5б 80,1 7,17 ± 1,28
а Приведены среднеарифметические значения ± стандартное отклонение (Бй). В группах по 10 животных. б р < 0,01 (при сравнении с соответствующим значением у животных контрольной группы; критерий Стьюдента).
Концентрация нитритов в опухолевой ткани была в пределах (2,82—4,65) х 10-6 моль/кг ткани, причем в процессе развития КЭ она монотонно нарастала. В то же время в большинстве образцов нитраты не определялись или концентрация их была низкой (табл. 7). Суммарная концентрация нитритов и нитратов в опухолевой ткани не превышала 5,16 х 10-6 моль/кг ткани (в пересчете на N0^) и практически не зависела от стадии роста КЛ. При сравнении с опухолевой тканью солидной КЭ, в которой концентрация НС составила 4,84 х 10-5 моль/кг,
выявлено, что опухолевая ткань КЛ содержала в 9,4 раза меньше НС [14].
Результаты, полученные в настоящей работе, согласуются с ранее опубликованными данными других исследователей, которые показали достоверное снижение базового образования АФК нейтрофилами крови у хомяков со спонтанной лимфосаркомой кишечника или опухолями, вызванными инокуляцией высокометастатических опухолевых клеток ХЭТР-МЛН-8 [21, 22]. Г. И. Дейчман и соавт. связывают подавление СХЛ с супрессорным дей-
Таблица 4
Клеточный состав ПЖ мышей Р, с перевиваемой КЛ
Группа (сутки после перевивки опухоли) Число животных Количество клеток, х 103/мкл Содержание в ПЖ, % (103/мкл)
макрофаги + моноциты нейтрофилы тучные клетки лимфоциты
I. Контроль — здоровые мыши 9 2,69 ± 0,77 33,9 ± 6,0 (0,91 ± 0,16) 0,7 ± 1,0 (0,02 ± 0,03) 2,7 ± 1,4 (0,07 ± 0,04) 62,7 ± 6,2 (1,69 ± 0,17)
Опыт, мыши с КЛ
II (6-е) 8 3,64 ± 2,15 29,4 ± 4,4 (1,07 ± 0,16) 0,1 ± 0,2 (0,01 ± 0,02) 1,6 ± 1,0 (0,06 ± 0,04) 68,9 ± 4,1 (2,5 ± 0,15)
III (13-е) 9 1,09 ± 0,32а 47,8 ± 4,7 (0,52 ± 0,05)а 0,7 ± 0,9 (0,01 ± 0,01) 1,6 ± 1,2 (0,02 ± 0,02) 49,9 ± 4,8 (0,54 ± 0,05)
IV (20-е) 10 1,19 ± 0,23а 49,5 ± 6,8 (0,59 ± 0,08)а 1,4 ± 1,0 (0,01 ± 0,01) 1,6 ± 1,1 (0,02 ± 0,01) 47,5 ± 7,1 (0,57 ± 0,08)
V(27-е) 8 1,87 ± 1,05 43,6 ± 4,7 (0,82 ± 0,09)а 1,6 ± 1,4 (0,03 ± 0,02) 2,1 ± 1,6 (0,04 ± 0,03) 52,7 ± 5,8 (0,98 ± 0,1)
а р < 0,01 по сравнению с контрольной группой (критерий Стьюдента).
Та6лица 5
Хемилюминесцентная активность макрофагов ПЖ мышей с перевиваемой КЛ
Группа (сутки после перевивки опухоли) Число животных ХЛ, имп./мин на 103 макрофагов
СХЛ ФЗХЛ коэффициент усиления
I. Контроль — здоровые мыши 1G 5,8 + 1,9 24,4 + 7,5 4,2
Опыт, мыши с КЛ
II (6-е) 8 6,1 + 3,4 42,G + 29,8 6,9
III (13-е) 8 8,2 + 2,8 11G,G + 73,2а 13,4
IV (2G^) 1G 4,5 + 2,9 53,6 + 33,36 11,9
V(27-е) 8 7,9 + 1,5 54,5 + 31,86 6,9
а р < G,G1 по сравнению с контрольной группой (критерий Стьюдента).
6 р < G,G5 по сравнению с контрольной группой (критерий Стьюдента).
ствием на нейтрофилы ПГЕ2, образование которого усилено при росте опухоли. В другой работе показано, что нейтрофилы могут лизировать опухолевые клетки без предварительной стимуляции, но при обязательной длительной инкубации с мишенями и высоком соотношении эффектора и мишени [23]. Если данные о супрессии спонтанной активности периферических нейтрофилов мышей с КЛ, полученные в нашем опыте, экстраполировать применительно к опухоль-ассоциированным ней-трофилам, то можно ожидать снижения их активности, что означало бы снижение лизисных свойств нейтрофи-лов по отношению к опухолевым клеткам. Что касается
Та6лица 6
Выделение НС с мочой у мышей Fi^yBlxCBA) с КЛ
объяснения результатов гиперпродукции АФК стимулированными нейтрофилами и макрофагами, то обнаруженный в исследовании рост люминолзависимой ХЛ нейтрофилов и моноцитов крови при их стимуляции у больных с лимфомой Ходжкина авторы связывают с усилением экспрессии рецепторов для зимозана (С3Ы). Цитокины, такие, как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, могут стимулировать экспрессию этих рецепторов на гранулоцитах и макрофагах и увеличивать ХЛ [24—26].
Необходимо иметь в виду, что оценка эндогенного синтеза N0 по показателю выделения с мочой произ-
Группы, сутки роста КЛ Выделение НС, мкг/кг массы мыши (моль/кг)а Сравнение с контролем, %
NO-2 NO-3 суммарное выделение, в эквиваленте NO-3
Контроль (здоровые мыши) 12,7 (2,76 x 1G-7) 1G7,27 (1,68 x 1G-6) 124,41 (1,94 x 1G-6) G
Мыши с КЛ
2-е 13,64 (2,96 x 1G-7) 219,G9 (3,42 x 1G-6) 237,5 (3,71 x 1G-6) + 9G,9
9-е G 49,G9 (7,67 x 1G-7) 49,G9 (7,67 x 1G-7) -6G,5
16-е 2,73 (5,93 x 1G-8) 32,73 (5,11 x 1G-7) 36,41 (5,69 x 1G-7) -7G,7
21-е G 75,45 (1,18 x 1G-6) 75,45 (1,18 x 1G-6) -39,4
3G^ G 96,36 (1,51 x 1G-6) 96,36 (1,51 x 1G-6) -22,5
а Приведено среднеарифметическое значение двух определений в суточной моче от 5 мышей. (-) — снижение выделения НС; (+) — увеличение выделения НС.
Таблица 7
Концентрация НС в опухолевой ткани мышей с КЛаб
Сутки роста КЛ Концентрация нитритов и нитратов в опухоли, мг/кг ткани [моль/кг]
NO2- NO3- в пересчете на NO3-
14-е 0,13 ± 0,05 [(2,83 ± 1,09) х 106] 0,0 0,18 ± 0,07 [(2,83 ± 1,09) х 106]
21-е 0,17 ± 0,07 [(3,70 ± 1,52) х 106] 0,1 ± 0,04 [(1,56 ± 0,6) х 106] 0,33 [5,16 х 106]
28-е 0,21 ± 0,07 [(4,56 ± 1,52) х 106] 0,0 0,28 ± 0,09 [(4,43 ± 1,4) х 106]
а Концентрация нитратов и нитритов выражена как среднеарифметическое значение ± стандартное отклонение (п = 6). б На 7-е сутки не определяли.
водных N0 (нитриты, нитраты) является интегральной. Она включает эндогенно синтезированный N0, необходимый для нормальной работы сердечно-сосудистой, иммунной, эндокринной и нервной систем организма. Считают, что синтез N0 конститутивными изоформами N0-синтаз (I и III) не сопровождается токсическими эффектами N0 и его производных, поскольку концентрация N0 не превышает 10-7 [27].
Воспаление, опухолевый рост могут резко увеличить образование НС вследствие индукции II изоформы N0-синтазы. В нашем опыте выделение нитритов и нитратов с мочой мышей с КЛ не превышало соответственно 2,96 х 10-7 и 3,42 х 10-6 моль/кг массы тела. Концентрация как нитритов, так и нитратов в опухолевой ткани мышей также была на низком уровне (см. табл. 7). Примечательно, что полученные нами ранее результаты отражали усиление экскреции НС с мочой в 15,5 раза у мышей с КЭ, причем выделение НС находилось в положительной линейной зависимости от объема КЭ. Это послужило основанием для испытания противоопухолевого действия ингибиторов N0-синтазы на данной модели опухолевого роста. При введении внутрибрюшинно неспецифических ингибиторов iN0S — N -нитро^-аргинина, аминогуанидина одного или в комбинации с ацетилсалициловой кислотой нами получено достоверное замедление роста солидной КЭ у мышей [14]. По-видимому, подавление образования производных N0 в организме мышей с КЛ во время роста опухоли может указывать на отсутствие активации N0-синтаз. Учитывая это, можно высказать предположение
о том, что применение ингибиторов iN0S на модели КЛ будет малоэффективным, скорее КЛ будет чувствительна к экзогенному поступлению доноров N0.
Следует также отметить, что для более полного выявления связи между развитием опухоли и эндогенным образованием N0 у мышей с опухолью необходимо дополнительно оценить ряд факторов. Прежде всего это касается скрытого N0, который может существовать в виде соединений N0 с белками и комплексов гемоглобина с N0. Известно, что N0 образуется в реакции окисления L-аргинина — аминокислоты, которая одновременно является предшественником эндогенного синтеза полиаминов. Это предполагает существование единого механизма регулирования относительных скоростей синтеза N0 и полиаминов [28]. Повышенный синтез полиаминов,
который существует при развитии опухолей, может истощать субстрат для N0-синтаз, тем самым оказывать корригирующее действие на активность этих ферментов.
заключение
Результаты исследования показали, что рост метаста-зирующей КЛ у мышей сопровождается подавлением эндогенного синтеза производных N0 и снижением образования АФК нейтрофилами крови в спонтанном состоянии. Не выявлено изменения спонтанной активности перитонеальных макрофагов и моноцитов на разных сроках роста КЛ. В то же время способность к образованию АФК стимулированными нейтрофилами крови и макрофагами ПЖ не только не утрачивается, но возрастает на всех контрольных сроках роста КЛ и на поздней стадии развития КЭ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Билынский Б. Т., Володько Н. А., Шпарык Я. В. Иммунологические механизмы естественной противоопухолевой резистентности. — Киев: Наукова думка, 1991. — 248 с.
2. Меджитов Р., Джаневей Ч. Врожденный иммунитет // Казанский мед. журн. — 2005. — № 3. — С. 161—167.
3. Nauseef W. M. Biological roles for the NOX family NADPH oxidases // J. Biol. Chem. — 2008. — Vol. 283. — Р. 16 961 — 16 965.
4. Rossi F., Zatti M. Biochemical aspects of phagocytosis in polymorphonuclear leucocytes. NADH and NADPH oxidation by the granules of resting and phagocytozing cells // Experientia. — 1964. — Vol. 20. — Р. 21—23.
5. Дейчман Г. И. Роль естественной резистентности в реакции организма на возникновение, рост и метастазирование опухолей / Итоги науки и техники / ВИНИТИ. Сер. Онкология. — 1984. — Т. 13. — С. 46—97.
6. Оксид азота в неопластическом процессе / Проскуряков С. Я., Коноплянников А. Г., Иванников А. И., Скворцов В. Г., Цыб А. Ф. // Вопр. онкол. — 2001. — Т. 47, № 3. — С. 257—269.
7. Laudanski P., Anchim T., Wolczynski S. The role of nitric oxide in carcinogenesis and progression of neoplastic processes // Ginekol. Pol. — 2001. — Vol. 72, N 4. — Р. 251—60.
8. Недоспасов А. А. Биогенный NO в конкурентных отношениях // Биохимия. — 1998. — Т. 63, № 7. — С. 881—904.
9. Lala P. K. and Chakraborty C. Role of nitric oxide in carcinogenesis and tumour progression // The Lancet Oncol. — 2001. — Vol. 2, N 3. — P. 149—156.
10. Nitric oxide-donating aspirin prevents pancreatic cancer in a hamster tumor model / Ouyang N., Williams J. L., Tsioulias G. J., Gao J., Latropoulos M. J., Kopelovich L., Kashfi K., Rigas B. // Cancer Res. — 2006. — Vol. 66, N 8. — P. 4503—4511.
11. Xie K., Huang S. Contribution of nitric oxide-mediated apopto-sis to cancer metastasis inefficiency // Free Radic. Bio. Med. — 2003. — Vol. 34, N 8. — P. 969—986.
12. Therapeutic potential of nitric oxide in cancer / Bonavida B., Kh-ineche S., Huerta-Yepez S., Garban H. // Drug Resist. Updat. — 2006. — Vol. 9, N 3. — P. 157—173.
13. iNOS as therapeutic target for treatment of human tumors / Fitzpatrick B., Mehibel M., Cowen R. L. and Stratford I. J. // Nitric oxide. — 2008. — Vol. 19, N 2. — P. 217—224.
14. Дерягина В. П., Рыжова Н. И. Действие модуляторов NO-синтаз на рост перевивной аденокарциномы Эрлиха // Вестн. РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 2007. — Т. 18, № 2. — С. 32—37.
15. Nitric oxide and some nitric oxide donor compounds enhance the cytotoxicity of cisplatin / Wink D. A., Cook J. A., Christodoulou D., Pacelli R., Kim S., DeGraff W., Gamson J., Vodovotz Y., Russo A., Mitchell J. B. // Nitric Oxide. — 1997. — Vol. 1, N 1. — P. 88—94.
16. Nitric oxide enhancement of melphalan-induced cytotoxicity / Cook J. A., Krishna M. C., Pacelli R., DeGraff W., Liebmann J., Mitchell J. B., Russo A., Wink D. A. // Br. J. Cancer. — 1997. — Vol. 76, N 3. — P. 325—334.
17. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В., Истамов Х. И. Экологическая иммунология. — М.: ВНИРО, 1995. — 219 с.
18. Дерягина В. П., Машковцев Ю. В., Ильницкий А. П. Экспериментальное изучение функциональной активности нейтрофилов и макрофагов в условиях воздействия нитрита натрия // Биомед. хим. — 2003. — Т. 49, № 1. — С. 19—26.
19. Chemiluminescence of granulocytes and monocytes in diluted whole blood samples: tumor marker? / Heberer M., Ernst M., Durig M., Harder F. // Cancer Detect. Prev. — 1983. — Vol. 6, N 1—2. — P. 273— 280.
20. Cortas N.K. and Wakid N.W. Determination of inorganig nitrate
in serum and urine by a kinetic cadmium-reduction method // Clin. Chem. — 1990. — Vol. 36. — P. 1440—1443.
21. Дейчман Г. И., Ключарева Т. Е., Кашкина Л. М. Подавляющая резистентность активность трансформированных клеток сирийского хомячка и их способность к метастазированию // Бюл. экспер. биол. — 1981. — № 11. — С. 596—598.
22. Кашкина Л. М., Прилуцкая М. О. Выделение активных форм кислорода нейтрофилами крови сирийских хомяков с первичными и перевиваемыми опухолями // Экспер. онкол. — 1988. — Т. 10, № 5. — С. 73—75.
23. Бережная Н. М., Чехун В. Ф. Иммунология злокачественного роста. — Киев: Наукова думка, 2005. — С. 421.
24. Increased luminol-enhanced chemiluminescence of blood monocytes and granulocytes in Hodgkins disease / Tullgren O., Giscombe R., Holm G., Johansson B., Mellstedt H., Bjorkholm M. // Clin. Exp. Immunol. — 1991. — Vol. 85. — Р. 436—440.
25. Barth J., Entzian P., Petermmann W. Increased release of free oxygen radicals by phagocytosing and nonphagocytosing cells from patients with active pulmonary sarcoidosis as revealed by luminol-de-pendent chemiluminescence // Klin. Wochenschr. — 1988. — Vol. 66, N 7. — Р. 292—297.
26. Мальцева В. Н., Сафронова В. Г. Неоднозначная роль нейтрофилов в онкогенезе // Цитология. — 2009. — Vol. 51, N 6. — P. 467— 474.
27. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих / Реутов В. П., Сорокина Е. Г., Охотин В. Е., Коси-цын Н. С. — М.: Наука, 1997. — 156 c.
28. Граник В. Г., Григорьев Н. Б. Оксид азота (NO). — М.: Вузовская книга, 2004. — 360 с.
Поступила 16.02.2011
Valentina Petrovna Deryagina1, Natalia Ilyinichna Ryzhova2, Irina Sergeyevna Golubeva3
PHAGOCYTE FUNCTIONAL ACTIVITY AND PRODUCTION OF NITRIC OXIDE COMPOUNDS IN MOUSE MODELS OF TUMOR XENOGRAFTS
1 MD, PhD, Senior Researcher, Carcinogenic Exposure Prevention Group, Chemical Carcinogenesis
Department, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
2 MD, PhD, Senior Researcher, Carcinogenic Exposure Prevention Group, Chemical Carcinogenesis
Department, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
3 MD, PhD, Leading Researcher, Primary Selection Group, Biochemical Pharmacology Laboratory,
Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS
(24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
Address for correspondence: Deryagina Valentina Petrovna, Carcinogenic Exposure Prevention Group, Chemical Carcinogenesis Department, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin Cancer Research Center RAMS, 24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478; e-mail: [email protected]
Changes in functional activity of phagocytes from blood and peritoneal fluid, and production of NO compounds — nitrates and nitrites, were studied in mouse models of Lewis carcinoma of the lung and Ehrlich carcinoma of the lung. Growth of metastatic Lewis carcinoma of the lung was shown to be associated with inhibition of endogenic production of NO compounds and decreased spontaneous release of free oxygen radicals by blood neutrophils. Total amount of nitric compounds in urine from Lewis carcinoma-bearing mice was 22.5—70.7% lower than in the control. Concentration of nitric compounds as calculated for nitrates in tumor tissue varied from (2.83—5.16) x 106 mol/kg tissue and was poorly associated with Lewis carcinoma stage. Significant decrease in spontaneous chemiluminescence of blood neutrophils associated with tumor growth was 36.8—87% for Lewis carcinoma and 44.7% for Ehrlich carcinoma. Spontaneous chemiluminescence of peritoneal macrophages and monocytes was similar to that in the control, while phagocyte-dependent chemiluminescence of stimulated cells rose 2.2- to 4.5-fold (p < 0.05; p < 0.01) at all stages of Lewis carcinoma growth.
Key words: mice, Lewis carcinoma of the lung, Ehrlich carcinoma of the lung, neutrophils, macrophages, free oxygen radicals, nitric oxide compounds.
