CC BY
28doi: 10.17116/terarkh2015871266-72 © Коллектив авторов, 2015
Фундаментальные основы использования биорезорбируемых микроносителей на основе фиброина шелка в терапевтической практике на примере регенерации кожи
М.М. МОЙСЕНОБИЧ1, Д.А. КУЛИКОВ2, А.Ю. АРХИПОВА1, Н.В. МАЛЮЧЕНКО1, М.С. КОТЛЯРОВА1, А.В. ГОНЧАРЕНКО1, А.Б. КУЛИКОВ3, А.Е. МАШКОВ2, И.И. АГАПОВ4, Ф.Н. ПАЛЕЕВ2, А.А. СВИСТУНОВ5, М.П. КИРПИЧНИКОВ1
'ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия; 2ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского», Москва, Россия; 3ФГБУН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики» РАН, Москва, Россия; 4ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова» Минздрава России, Москва, Россия; 5ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия
Fundamental bases for the use of silk fibroin-based bioresorbable microvehicles as an example of skin regeneration in therapeutic practice
M.M. MOISENOVICH1, D.A. KULIKOV2, A.YU. ARKHIPOVA1, N.V. MALYUCHENKO1, M.S. KOTLYAROVA1, A.V. GONCHARENKO1, A.V. KULIKOV3, A.E. MASHKOV2, I.I. AGAPOV4, F.N. PALEEV2, A.A. SVISTUNOV5, M.P. KIRPICHNIKOV1
'M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia; 2M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute, Moscow, Russia; institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; 4Acad. V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russia; 5I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russia
резюме
Цель исследования. Оценка возможности использования микроносителей (МН) на основе фиброина шелка для культивирования фибробластов (ФБ) и кератиноцитов (КЦ) — ключевых клеточных компонентов в регенерации повреждений кожи. Материалы и методы. МН получали криоизмельчением из фиброиновых и композитных матриксов на основе фиброина с 30% содержанием желатина. Для исследования структуры матриксов и МН методом конфокальной микроскопии конъюги-ровали полимер с красителем тетраметилродаминизотиоцианат. Распределение микрочастиц по размеру оценивали посредством гранулометрического анализа. В целях изучения пригодности МН на основе фиброина для культивирования клеток, участвующих в регенерации кожи, использовали мышиные ФБ линии 3Т3 и первичную культуру КЦ мыши, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP). Рост КЦ анализировали методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии по флуоресценции GFP, экспрессируемого клетками. Скорость пролиферации ФБ и КЦ оценивали методом МТТ-теста. результаты. Получены два типа МН: на основе фиброина и композитные, содержащие фиброин и 30% желатин. На фиброиновых МН без желатина ФБ клеточной линии 3Т3, начиная с 1-го дня, активно пролиферировали, а наличие желатина в МН снижало пролиферацию таких клеток. Показано, что фиброиновые МН пригодны для эффективного культивирования in vitro КЦ, экспрессирующих цитокератины-5 и -14 — основные маркеры КЦ базального слоя. Желатин не приводил к ускорению роста КЦ. Продемонстрирована возможность регуляции пролиферации ФБ на МН, что имеет большое значение при доставке клеток в область повреждения, поскольку интенсивная пролиферация ФБ может приводить к развитию фиброза и формированию рубцовых тканей. Сбалансированный рост ФБ важен для создания оптимальных условий роста КЦ в композитных тканеинженерных конструкциях.
Заключение. Применение фиброиновых МН перспективно для разработки новых терапевтических материалов и инъекционной клеточной терапии различных патологий.
Ключевые слова: микроноситель, фиброин, фибробласты, кератиноциты.
Aim. To assess whether silk fibroin-based microvehicles (MVs) may be used to grow fibroblasts (FBs) and keratinocytes (KCs), key cellular components in skin regeneration after injury.
Materials and methods. Cryogrinding was applied to derive MVs from fibroin-based and fibroin- and 30% gelatin-containing composite matrices. To examine the structure of the matrices and MVs, confocal microscopy was used to conjugate the polymer with the dye tetramethylrhodamine isothiocyanate. Microparticle size distribution was estimated by granulometric analysis. 3T3 mouse FBs and cultured primary mouse KCs expressing green fluorescent protein (GFP) were used to study whether fibroin-based MVs might be suitable for growing the cells involved in skin regeneration. KC growth was analyzed by confocal laser scanning microscopy from cellular GFP expression. The proliferation rate of FBs and KCs was estimated by a MTT assay. Results. There were two derived MV types: fibroin-based and fibroin and 30% gelatin-containing composite ones. On day 1, 3T3 mouse FBs on the fibroin-based gelatin-free MVs actively proliferated and the presence of gelatin in MVs diminished the proliferation of these cells. Fibroin-based MVs were shown to be suitable for the effective in vitro growth of KCs expressing cytokeratins 5 and 14, the major markers of KCs in the basal layer. Gelatin did not give rise to accelerated KC growth. The investigation has demonstrated that is possible to regulate FB proliferation on MVs, which is of great importance in delivering the cells into the site of injury since intensive proliferation of FBs may lead to the development of fibrosis and the formation of scar tissue. Balanced FB growth is essential to the creation of optimal conditions for KC growth in composite tissue-engineering constructions. Conclusion. The use of fibroin-based MVs is promising for the design of novel therapeutic materials and injectable cell therapy for different diseases.
Keywords: microvehicle, fibroin, fibroblasts, keratinocytes.
КЛСМ — конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
КЦ — кератиноциты МН — микроносители
ОП540 — оптическая плотность при длине волны 540 нм ФБ — фибробласты
Ф-МН — МН на основе фиброина
ФЖ-МН — МН на основе композитного материала, содержащего фиброин и 30% желатина ФСБ — фосфатно-солевой буфер ОБР — зеленый флуоресцентный белок ТЫТС — тетраметилродаминизотиоцианат
Заживление кожных ран — сложный, протекающий на различных структурных уровнях, процесс, в результате которого происходит устранение повреждения с полным или частичным восстановлением нормальной ткани. Нарушение процесса заживления кожных ран негативно влияет на функциональные характеристики, а также внешний вид кожи. Существующие методы восстановления кожного покрова совершенствуются с использованием клеточных технологий. Подобная клеточная терапия перспективна в лечении таких дефектов кожи, как ожоги, глубокие и длительно незаживающие раны, трофические язвы, а также для косметологической коррекции рубцов и исправления возрастных изменений кожи [1]. Одним из традиционных методов является введение компетентных для регенерации клеток (кератиноцитов — КЦ и фибро-бластов — ФБ) в области кожных повреждений [2]. С этой целью клетки наращивают в достаточном количестве in vitro, а затем вносят в травмированные участки кожи. Зачастую при снятии адгезивных культур с подложек культивирования, например при ферментативной обработке эпителиальных пластов, происходят выраженное повреждение КЦ и значительная контракция пласта. Одним из способов преодоления проблемы является культивирование клеток на биодеградируемых субстратах с последующим введением витализированных носителей в организм. В качестве материала для приготовления таких носителей предпочтение отдается изделиям на основе полимеров
Сведения об авторах:
Куликов Дмитрий Александрович — к.б.н., ученый секретарь МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского
Архипова Анастасия Юрьевна — м.н.с. межкафедральной лаб. конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
Малюченко Наталия Валериевна — к.б.н., доцент кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Котлярова Мария Сергеевна — асп. 1 года биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
Гончаренко Анна Владимировна — в.н.с. межкафедральной лаб. конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
Куликов Александр Владимирович — д.б.н., зав. лаб. клеточ-но-тканевых механизмов компенсации функций биообъектов Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН Машков Александр Евгеньевич — д.м.н., рук. отд-ния детской хирургии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского Агапов Игорь Иванович — д.б.н., проф., зав. лаб. бионанотех-нологий ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова
Палеев Филипп Николаевич — д.м.н., проф., дир. МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского
Свистунов Андрей Алексеевич — д.м.н., проф., дир. НИИ фармации Первого МГМУ им. И.М. Сеченова
Кирпичников Михаил Петрович — акад., декан биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
природного происхождения [3]. Одним из таких материалов, обладающих свойствами, необходимыми для культивирования клеток, является фиброин — основной компонент шелка тутового шелкопряда [4—7]. Работы по исследованию фиброина как субстрата для культивирования клеток, задействованных в регенерации кожных ран, показывают перспективность его использования: фиброин шелка эффективно поддерживает адгезию и пролиферацию клеток эпидермиса и ФБ [8—12].
Важной характеристикой субстрата является не только материал, но форма и размер носителя. Для развития методов клеточной терапии перспективно использование микроносителей (МН) — небольших частиц от 50 до 400 мкм [13]. Применение МН для культивирования клеток, а также для доставки клеток в область повреждений обладает рядом преимуществ. МН создают благоприятные условия для развития клеток в трехмерном пространстве и приближают их к состоянию in vivo [14]. МН являются удобной формой для инъекционного введения, что позволяет исключить травматичные для клеток стадии снятия культуры с подложки.
Цель данной работы — оценка применимости МН, изготовленных из фиброина, для культивирования ФБ и КЦ. В дальнейшем будет исследован эффект интрадер-мального введения витализированных МН в модели пол-нослойной кожной раны.
Материалы и методы
Матриксы из фиброина и композитные матриксы на основе фиброина с 30% содержанием желатина получали по методике, описанной ранее [6]. Из матриксов путем криоизмельчения получены МН — соответственно на основе фиброина (Ф-МН) и на основе композитного материала, содержащего фиброин и 30% желатина (ФЖ-МН). Для исследования структуры матриксов и МН методом конфокальной микроскопии конъюгировали полимер с красителем тетраметилродаминизотиоцианат (TRITC). Для оценки распределения микрочастиц по размеру проводили гранулометрический анализ. Фракции микрочастиц получены после пропускания через сита лабораторные с отверстиями 100 и 250 мкм (ООО «Крафт», Российская Федерация). Размеры микрочастиц различных фракций определяли методами световой микроскопии. Затем определяли массу МН после высушивания на приборе HCP-2 criticalpointdryer («Hitachi Ltd», Япония). Для изучения пригодности МН на основе фиброина для культивирования клеток, участвующих в регенерации кожи, использовали мышиные ФБ линии 3Т3 и первичную культуру КЦ мыши. Первичную культуру мышиных КЦ, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), получали из новорожденных GFP+ C57BL/6N мышей на 0—3-й день развития по методике [2]. Для получения GFP+ мы-
Контактная информация:
Мойсенович Михаил Михайлович — к.б.н., зав. межкафедральной лаб. конфокальной микроскопии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова; e-mail: [email protected]
Рис. 1. Фиброиновые МН.
а, б — матрикс из фиброина шелка: а — макрофотография матрикса; б — пористая структура матрикса; в — МН из фиброина; г — МН из фиброина и желатина; изображения б—г получены методом КЛСМ, матриксы и МН конъюгированы ТЫТС.
шей-самок линии C57BL/6N скрещивали с самцом с убиквитар-ной экспрессией GFP. Фрагмент кожи обеззараживали антибио-тиком/антимикотиком (Gibco) следующего состава: 100 ЕД/мл пенициллина, 100 ЕД/мл стептомицина и 0,25 мкг/мл амфотери-цина в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в течение 5 мин. Далее в течение ночи при температуре 4 °С обрабатывали 0,025% раствором трипсин/ЭДТА. Затем дерму удаляли, а эпидермис измельчали и центрифугировали при 200 g в среде FAD следующего состава: DMEM/Ham's F12 («Lonza», Швейцария) в соотношении 3,5:1,1 с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 0,18 ммоль аденина, 0,5 мкг/мл гидрокортизона, 5 мкг/мл инсулина, 0,1 нмоль холерного токсина, 10 нг/мл EGF, 2 ммоль глутамина, 1 ммоль пирува-та, с последующим ресуспендированием. Характеристику полученной из суспензии первичной культуры КЦ проводили путем выявления цитокератинов-5 и -14 на поверхности клеток посредством непрямой иммунофлуоресценции с использованием мышиных моноклональных антител к цитокератину-5 с поликлональ-ными козьими антителами против иммуноглобулина G мыши, меченных CF™ 555, и кроличьих моноклональных антител к цито-кератину-14 с поликлональными козьими антителами против иммуноглобулина G кролика, меченных CF™ 633. Использовали антитела производства «Sigma-AIdrich» (США). Оптимальная концентрация КЦ в инокулируемой суспензии подобрана на основе анализа роста клеток на МН методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) на микроскопе Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 («Nikon Corporation», Япония) по флуоресценции GFP, экспрессируемому клетками. Пролиферацию ФБ линии 3Т3 и КЦ на МН оценивали методом МТТ-теста. Клетки на МН наносили следующим образом: в лунки 96-луночного планшета вносили по 50 мкл суспензии МН в среде культивирова-
ния, в концентрации 40 мг/мл, добавляли суспензию ФБ или КЦ по 20 тыс. и 40 тыс. клеток на лунку соответственно. Через 4 ч МН с прикрепившимися клетками переносили в лунки 24-луночного планшета, содержащие по 1 мл среды культивирования. Через 1, 3, 5 и 7 сут вносили по 200 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в ФСБ) и инкубировали при температуре 37 °С в течение 4 ч. Среду с МН отбирали и центрифугировали при 14 500 g, осадок растворяли в ДМСО и проводили колориметрические измерения при 540 нм. В качестве отрицательного контроля использовали МН, инкубированные в среде культивирования. Самки мышей категории SPF (specific pathogen free) получены из питомника для лабораторных животных «Пущино», трансгенные самцы с убиквитарной экспрессией GFP предоставлены Н.Н. Логуновой (ЦНИИ туберкулеза РАМН).
Статистический анализ различий между группами осуществляли с использованием критерия t Стьюдента для зависимых (внутри одной группы) и независимых (между «Ф-МН» и «ФЖ-МН») выборок. Результаты считали статистически значимыми при _р<0,05.
результаты
На основе матриксов из фиброина криоизмельчени-ем получены Ф-МН. Тем же способом получены микроносители из композитных матриксов, содержащих 70% фиброина с добавлением 30% желатина (ФЖ-МН). Фиброиновые МН как Ф-МН, так и ФЖ-МН сохраняют сходную с исходными матриксами пористую структуру (рис. 1) и имеют большую доступную для адгезии клеток
Оценка размеров частиц МН
Показатель Фиброин (Ф) Фиброин-желатин (ФЖ)
Размер, мкм 50—100 100—250 250—400 50—100 100—250 250—400
%, масса 10,92+2,68 65,03+4,86 23,83+2,64 10,17+2 66,93+3,74 23,12+3,76
Примечание. Критерий t для независимых выборок: Ф50—100 против ФЖ50—100, р=0,536444 — отличий нет; Ф100—250 против ФЖ100—250, р=0,442890 — отличий нет; Ф250—400 против ФЖ250—400, р=0,604456 — отличий нет.
поверхность, что продемонстрировано с использованием КЛСМ (см. рис. 1, в, г).
Количественный анализ распределения МН по размеру показал, что преобладают микрочастицы от 100 до 250 мкм (см. таблицу). Такой размер позволяет использовать микрочастицы в инъекционной форме. По соотношению количества частиц в каждой из исследованных фракций от 50 до 100 мкм, от 100 до 250 мкм, от 250 до 400 мкм не наблюдали статистически значимых различий между Ф-МН и ФЖ-МН.
Для изучения способности МН на основе фиброина поддерживать адгезию и пролиферацию клеток использовали мышиные ФБ линии 3Т3. Клетки вносили в количестве 20 тыс. с 2 мг МН на лунку 96-луночного планшета, инкубировали в течение 4 ч. МН с прикрепившимися клетками переносили в свежую культуральную среду и культивировали до 7 дней. В качестве метода оценки пролиферации клеток на МН, позволяющего оценить рост клеток на тотальной выборке МН от 50 до 400 мкм, использован МТТ-тест. Полученные данные представлены на рис. 2.
Характер роста ФБ на Ф-МН и ФЖ-МН (20 тыс. клеток на лунку с 2 мг Ф или с 2 мг ФЖ) существенно различался. На Ф-МН ФБ линии 3Т3 активно пролифе-рировали, начиная с 1-го дня культивирования (см. рис. 2) вплоть до 7-го дня. На носителях с желатином с 1-го по 3-й день оптическая плотность при длине волны 540 нм — ОП540 (коррелирующая с количеством живых 3Т3 клеток) существенно не изменялась. Для этих МН ОП540 увеличивалась к 5-му дню. На 5-й день ОП540 для ФЖ-МН
Рис. 2. Культивирование мышиных ФБ линии 3т3 на МН двух типов.
Данные МТТ-теста представлены в виде средних значений и величины стандартного отклонения (по числу трех независимых экспериментов). * — выявленное различие на 3-й день культивирования между Ф-МН и ФЖ-МН (р=0,0037, критерий t для независимых выборок).
день различий между Ф-МН и ФЖ-МН по ОП540 также не наблюдали.
В ходе работы также оценивали применимость МН для культивирования КЦ. Выделенная первичная культура КЦ проверена на типичные маркеры КЦ базального слоя: цитокератин-5 и -14 [15]. Более 95% клеток содержали на своей поверхности данные маркеры (рис. 3). Первичные КЦ мыши культивировали на МН, используя различные плотности первоначально внесенных в лунку клеток: 40 тыс. и 20 тыс. клеток на лунку на 2 мг суспензии микрочастиц. Каждые 2 дня образцы фиксировали и исследовали методом конфокальной микроскопии по флуоресценции ОБР, экспрессируемому клетками. При использовании плотности 20 тыс. клеток на лунку КЦ не делились (данные не представлены). При высокой плотности клеток, первоначально внесенных в лунку с микрочастицами (40 тыс. клеток), наблюдалось увеличение количества КЦ на МН в течение 7 дней (см. рис. 3; рис. 4). При этом наличие желатина не оказывало значительного влияния на пролиферацию клеток.
Обсуждения
Получено два типа МН, пригодных для доставки клеточных популяций в область регенерации повреждений тканей. Основой для их создания выбран фиброин шелка, который является одним из наиболее перспективных материалов при разработке тканеинженерных конструкций и биодеградируемых систем доставки. Желатин использовали для введения в состав МН функциональной инте-гринраспознающей КОО-последовательности (сигнальной последовательности аргининглицинаспарагиновая кислота, содержащаяся в белках внеклеточного матрикса и являющаяся лигандом для интегринов), а также с целью повышения гидрофильности изделий [16]. Пористая структура МН обеспечивает свободный доступ питательных веществ и газообмен и создает благоприятные условия для культивирования клеток.
ФБ — важный клеточный компонент, участвующий в процессах регенерации тканей и органов. Клетки данного
не отличалась от ОП_.п для Ф-МН (см. рис. 2). На 7-й
Рис. 3. Культивирование КЦ на МН.
а — GFP-позитивные КЦ на поверхности МН из фиброина экс-прессируют маркеры базального слоя: цитокератин-5 и -14; представлена горизонтальная проекция серии оптических срезов, полученных на микроскопе Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 («Nikon Corporation», Япония) с объективом Nikon Plan Fluor 40x/1.3 — Oil. Линейка 10 мкм; б — культивирование первичных КЦ мыши на двух типах МН: данные МТТ-теста представлены в виде средних значений и величины стандартного отклонения (по числу трех независимых экспериментов).
типа обеспечивает синтез компонентов внеклеточного матрикса, в том числе фибронектина, образующих субстрат для миграции клеточных элементов воспаления и формирования грануляционной ткани. Кроме того, ФБ секретируют различные факторы роста и протеазы, необходимые для заживления ран: фактор-2 роста ФБ (БОР2), фактор роста эндотелия сосудов (УБОР), фактор роста ге-патоцитов (НОБ) и другие факторы, стимулирующие миграцию и пролиферацию клеток различных типов, участвующих в процессах регенерации [10, 11]. Поэтому способность МН поддерживать адгезию и пролиферацию ФБ является важным показателем возможности их применения для клеточной терапии кожных ран.
Ранее при использовании более высокой первоначальной клеточной плотности (40 тыс. на лунку, на 2 мг МН) разницы в характере роста ФБ между двумя МН — Ф-МН и ФЖ-МН не обнаруживали [17]. В данной работе уменьшение первоначальной клеточной плотности (20 тыс. на лунку) позволило выявить некоторые особенности роста ФБ в зависимости от субстрата культивирования. Наблюдаемые отличия в характере роста клеток на разных носителях не связаны с размером микрочастиц, поскольку разницы в соотношении распределения частиц разного размера между Ф-МН и ФЖ-МН не отмечено (см. табли-
Рис. 4. Культивирование КЦ на МН на основе фиброина с 30% желатином.
а — КЦ; б — их наложение на проекцию микрочастиц в проходящем свете. Изображения получены методом КЛСМ. Клетки содержат GFP.
цу). При этом в другой работе нами показано, что введение желатина в состав макроносителей на основе фиброина в виде трехмерных пористых матриксов, таких как представлены на рис. 1, а, б, приводило к усилению про-лиферативной активности ФБ линии клеток 3Т3 [6].
Таким образом, характер роста ФБ на макро- и микроносителях существенно различается. Скорее всего такие различия объясняются тем, что в матриксах при достижении высокой плотности клеток в одном слое существует возможность их миграции в более глубокие слои (см. рис. 1, б) и, таким образом, у клеток сохраняется высокий пролиферативный потенциал. Варьируя начальную концентрацию клеток, можно добиваться регулируемого роста ФБ на МН, что имеет большое практическое значение при применении МН для доставки ФБ в кожные раны. Излишне высокий пролиферативный потенциал ФБ может в ряде случаев приводить к аномальному раноза-живлению и фиброзу [18].
КЦ представляют основную массу клеток эпидермиса и являются одним из наиболее важных клеточных компонентов, участвующих в регенерации кожи [15]. Впервые культивирование КЦ осуществлено в 1975 г. с появлением методики Рейнвальда и Грина. Существуют сложности при культивировании КЦ in vitro, связанные с необходимостью ферментативной обработки клеток, которая дает значительный повреждающий эффект. Одним из возможных решений проблемы является использование биоре-зорбируемых МН для культивирования КЦ, которые позволяют непосредственно вводить частицы с сорбированными клетками в раневое ложе.
В ходе исследований получены два типа МН, способных поддерживать эффективный рост КЦ в культуре. Предлагаемые в данной работе МН на основе фиброина шелка являются биорезорбируемыми, поэтому могут выступать не только в качестве подложки культивирования, но и инструментом доставки КЦ в раневые участки без процедуры снятия клеток. Другая важная особенность полученных фиброиновых МН — способность поддерживать значительную часть КЦ в состоянии, когда они экс-прессируют маркеры базального слоя. Известно, что в эпидермисе в ходе дифференцировки от плюрипотентной клетки базального слоя до КЦ ороговевающего слоя происходит смена синтеза цитокератинов [15]. КЦ базального слоя экспрессируют цитокератины-5 и -14, сохраняют мультипотентные свойства и способность дедифференци-ровки в клетки других типов при введении в область кожных повреждений. Известны примеры, когда репрограм-мирование КЦ в плюрипотентные клетки способствовало более активному ранозаживлению [19] и облегчало формирование кровеносных сосудов [20].
Заключение
В целом проведенное исследование свидетельствует, что полученные Ф-МН и ФЖ-МН могут быть использо-
ваны для культивирования in vitro ФБ и КЦ — основных типов клеток, участвующих в регенерации кожи. Варьируя начальными концентрациями клеток и добавками, вносимыми в фиброин, можно добиться регулируемого роста ФБ, что очень важно при создании тканеинженер-ных композитных конструкций. В подобных аналогах кожи используются клетки нескольких типов, задействованных в регенерации, но неизменными компонентами в них являются КЦ и ФБ. Одна из существенных проблем при создании клеточных композитов — доминирующий рост ФБ, который преобладает по скорости над КЦ. Использование фиброиновых носителей с добавлением желатина позволит сбалансировать пролиферацию ФБ и создать оптимальные условия для нормального развития КЦ. В дальнейшем на основе полученных результатов нами планируется использование фиброи-новых МН для оптимизированного совместного роста первичных культур КЦ и ФБ с целью их последующей доставки в области полнослойных ран. Полученные МН имеют широкие перспективы для использования в терапевтической практике.
Работа осуществляется при поддержке Минобрнауки РФ по Соглашению о предоставлении субсидии от 27 ноября 2014 г. №14.604.21.0148 «Биорезорбируемые микроносители для доставки клеток в область заживления и регенерации ран», уникальный идентификатор соглашения RFMEFI60414X0148.
Работа выполнена с использованием оборудования, приобретенного за счет средств Программы развития Московского университета и на оборудовании ЦКП Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.
Конфликт интересов отсутствует.
AMTEPATYPA
1. You HJ, Han SK. Cell therapy for wound healing. J Korean Med Sci. 2014;29(3):311-319.
doi:10.3346/jkms.2014.29.3.311.
2. Petrof G, Abdul-Wahab A, McGrath JA. Cell therapy in dermatology. Cold Spring Harb Perspect Med. 2014;4(6):pii:a015156.
doi:10.1101/cshperspect.a015156.
3. Bonartsev A, Yakovlev S, Boskhomdzhiev A, Zharkova I, Bagrov D, Myshkina V, Mahina T, Kharitonova E, Samsonova O, Zernov A, Zhuikov V, Efremov Y, Voinova V, Bonartseva G, Shaitan K. The terpolymer produced by Azotobacter chroococcum 7B: effect of surface properties on cell attachment. PLoS One. 2013;8(2): e57200.
doi: 10.1371/journal.pone.0057200.
4. Moisenovich MM, Pustovalova OL, Arhipova AY, Vasiljeva TV, Sokolova OS, Bogush VG, Debabov VG, Sevastianov VI, Kirpi-chnikov MP, Agapov II. In vitro and in vivo biocompatibility studies of a recombinant analogue of spidroin 1 scaffolds. J Biomed Mater Res A. 2011;96(1):125-131.
doi:10.1002/jbm.a.32968.
5. Moisenovich MM, Pustovalova OL, Shackelford J, Vasiljeva TV, Druzhinina TV, Kamenchuk YA, Guzeev VV, Sokolova OS, Bogush VG, Debabov VG, Kirpichnikov MP, Agapov II. Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroin 1 scaffolds. Biomaterials. 2012;33(15):3887-3898.
doi:10.1016/j.biomaterials.2012.02.013.
6. Orlova AA, Kotlyarova MS, Lavrenov VS, Volkova SV, Arkhipova AY. Relationship between gelatin concentrations in silk fibroin-based composite scaffolds and adhesion and proliferation of mouse embryo fibroblasts. Bull Exp Biol Med. 2014;158(1):88-91.
doi:10.1007/s10517-014-2699-2.
7. Moisenovich MM, Arkhipova AY, Orlova AA et al. Composite Scaffolds Containing Silk Fibroin, Gelatin, and Hydroxyapatite for Bone Tissue Regeneration and 3D Cell Culturing. Acta Naturae. 2014;6(1):96-101.
8. Guan G, Zuo B, Li M, Wu Z, Li Y, Wang L. Promoted dermis healing from full-thickness skin defect by porous silk fibroin scaffolds (PSFSs). Biomed Mater Eng. 2010;20(5):295-308. doi:10.3233/BME-2010-0643.
9. Kanokpanont S, Ratanavaraporn J, Aramwit P. An innovative bi-layered wound dressing made of silk and gelatin for accelerated wound healing. Int J Pharm. 2012;436(1-2):141-153. doi:10.1016/j.ijpharm.2012.06.046.
10. Wang Y, Vunjak-Novakovic G, Kaplan DL. Stem cell-based tissue engineering with silk biomaterials. Biomaterials. 2006;27(36):6064-6082.
doi: 10.1016/j.biomaterials.2006.07.008.
11. Min BM, Kim SH, Nam YS, Lee TS, Park W. Electrospinning of chitin nanofibers: degradation behavior and cellular response to normal human keratinocytes and fibroblasts. Biomaterials. 2006;27(21):3934-3944.
doi: 10.1016/j.biomaterials.2006.03.016.
12. Mei N, Chen G, Zhou P, Chen X, Shao ZZ, Pan LF, Wu CG. Biocompatibility of Poly(e-caprolactone) Scaffold Modified by Chitosan — The Fibroblasts Proliferation in vitro. J Biomater Appl. 2005;19(4):323-339.
doi: 10.1177/0885328205048630.
13. Sun LY, Lin SZ, Li YS, Harn HJ, Chiou TW. Functional cells cultured on microcarriers for use in regenerative medicine research. Cell Transplant. 2011;20(1):49-62.
doi: 10.3727/096368910X532792.
14. ChenAK, Reuveny S, Oh SK. Application ofhuman mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 2013;31(7): 1032-1046.
doi: 10.1016/j.biotechadv.2013.03.006.
15. Presland RB, Dale BA. Epithelial structural proteins of the skin and oral cavity: function in health and disease. Crit Rev Oral Biol Med. 2000;11(4):383-408.
doi: 10.1177/10454411000110040101.
16. Huang Y, Onyeri S, Siewe M, Moshfeghian A, Madihally SV. In vitro characterization of chitosan-gelatin scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 2005;26(36):7616-7627.
doi:10.1016/j.biomaterials.2005.05.036.
17. Архипова А.Ю., Котлярова М.С., Новичкова С.Г., Агапова О.И., Куликов Д.А., Куликов А.В., Друцкая М.С., Агапов И.И., Мойсенович М.М. Новые биорезорбируемые микроносители на основе фиброина шелка. БЭБиМ. 2015;160(10): 497-501.
18. Fathke C, Wilson L, Hutter J, Kapoor V, Smith A, Hocking A, Isik F. Contribution ofbone marrow-derived cells to skin: collagen deposition and wound repair. Stem Cells. 2004;22(5):812-822. doi: 10. 1634/stemcells .22 -5-812.
19. Mannik J, Alzayady K, Ghazizadeh S. Regeneration of multilin-eage skin epithelia by differentiated keratinocytes. J Invest Derma-tol. 2010;130(2):388-397.
doi:10.1038/jid.2009.244.
20. Lugo LM, Andreadis ST. Vascularization of the dermal support enhances wound re-epithelialization by in situ delivery of epidermal keratinocytes. Tissue Eng Part A. 2011;17(5-6):665-675.
doi:10.1089/ten.TEA.2010.0125.
Поступила 06.11.2015
