CC BY
1
Оригинальное исследование УДК 615.31
http://dx.doi.org/10.35177/1994-5191-2023-4-12
ФОТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО КОНЪЮГАТА
Ольга Вячеславовна Шевченко1Н, Наталья Геннадьевна Плехова2
1,2Тихоокеанский государственный медицинский университет, Владивосток, Россия 1 нtarakovaolga@gmaiLcom, https://orcid.org/0000-0002-3113-3995 [email protected], https://orcid.org/0000-0002-8701-7213
Аннотация. Проведено исследование фотодинамического потенциала соединения, содержащего природный фотосенсибилизатор (ФС) порфиринового ряда Хлорин Е6 и редкоземельный металл европий (полиэти-ленимин/Хлорин Е6/диэтилентриаминпентауксусная кислота/фолиевая кислота/европий, РЕ1/е6ЮТРА^А/ Ей). Спектрофотометрическим способом подтвержден состав молекулярного конъюгата, содержащего ФС. Показано, что при воздействии полупроводниковым лазером красного света (^=645 нм) в течение 20 мин. молекулярный конъюгат в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) способен продуцировать активные формы кислорода (АФК). После 1 сут. контакта с 1,56 мкг/мл молекулярного конъюгата и культурой асцитной аденокарциномы Эрлиха количество некротизированных клеток составляло 78,0±3,9 %, что указывало на его цитотоксическое действие. Наибольший фототоксический эффект РЕ1/е6ЮТРА^А/Би проявлялся через 4 сут. После контакта клеток с 12,5 мкг/мл РЕ1/е6/БТРА^А/Еи и облучения процент нежизнеспособных составил 81,5±4,1 %, тогда как, для свободного Хлорина Е6 47,4±2,4 %. Полученные результаты являются перспективной основой для дальнейших исследований потенциального фотосенсибилизатора.
Ключевые слова: фотосенсибилизатор, Хлорин Е6, европий, молекулярный конъюгат, фототоксичность, клетки аденокарциномы Эрлиха, красный свет, фотодинамическая терапия
Для цитирования: Шевченко О.В. Фототоксическое действие молекулярного конъюгата на основе Хлорина Е6 / О.В. Шевченко, Н.Г. Плехова // Дальневосточный медицинский журнал. - 2023. - № 4. - С. 69-73. http://dx.doi.org/10.35177/1994-5191-2023-4-12.
Olga V. Shevchenko1H, Natalia G. Plekhova2
1,2Pacific State Medical University, Vladivostok, Russia 1 [email protected], https://orcid.org/0000-0002-3113-3995 [email protected], https://orcid.org/0000-0002-8701-7213
Abstract. The photodynamic potential of a compound containing a natural photosensitizer (PS) of the porphyrin series Chlorin e6 and rare earth metal europium (polyethyleneimine/Chlorin e6/diethylenetriaminepentaacetic acid/folic acid/ europium, PEI/e6/DTPA/FA/Eu) was studied. Spectrophotometric method confirmed the composition of the molecular conjugate containing PS. It has been shown that due to the expose of a semiconductor laser of red light (^=645 nm) for 20 min the molecular conjugate in phosphate-buffered saline (PBS) is capable to produce reactive oxygen species (ROS). After 1 day of contact with 1,56 ^g/ml of the molecular conjugate and the culture of Ehrlich's ascitic adenocarcinoma the number of necrotic cells was 78,0±3,9 %, indicating its cytotoxic effect. The higher phototoxic effect of PEI/e6/ DTPA/FA/Eu was manifested after 4 days. After contact of cells with 12,5 ^g/ml PEI/e6/DTPA/FA/Eu and irradiation the percentage of non-viable cells was 81,5±4,1 %, while for free Chlorin e6 it was 47,4±2,4 %. The results obtained are a promising basis for further studies of a potential photosensitizer.
Keywords: photosensitizer, Chlorin e6, europium, molecular conjugate, phototoxicity, Ehrlich adenocarcinoma cells, red light, photodynamic therapy
НА ОСНОВЕ ХЛОРИНА Е6
PHOTOTOXIC EFFECT OF A NEW MOLECULAR CONJUGATE
BASED ON CHLORIN E6
FAR EASTERN MEDICAL JOURNAL / 2023 / № 4 FUNDAMENTAL MEDICINE
For citation: Shevchenko O.V. Phototoxic effect of a new molecular conjugate based on Chlorin E6 / O.V. Shevchenko, N.G. Plekhova // Far Eastern medical journal. - 2023. - № 4. - P. 69-73. http://dx.doi.org/10.35177/ 1994-5191-2023-4-12.
Перспективы применения метода фотодинамической терапии (ФДТ) связаны с неинвазивностью и селективностью в отношении опухолевых клеток. Известные в настоящее время ФС обладают рядом свойств, таких как многоступенчатый дорогостоящий синтез, поэтапная очистка, малая растворимость вещества в биологических жидкостях, нестабильность на свету, которые в целом могут оказывать влияние на финансовые затраты применяемого метода терапии [1]. Одним из направлений исследований в области ФДТ является разработка ФС нового
Материалы
Определение оптической плотности растворов фотосенсибилизаторов Хлорина Е6 и молекулярного конъюгата полиэтиленимин/Хлорин Е6/диэтилентри-аминпентауксусная кислота/фолиевая кислота/европий (PEI/e6/DTPA/FA/Eu) и построение спектра их поглощения в фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) проводили на спектрофлуориметре Synergy H1 (BioTek, США) в диапазоне длин волн 300-700 нм с интервалом 1 нм при температуре 21 °С. Оптимальное время облучения ФС красным светом полупроводникового лазера (ООО «Свет и жизнь», Россия) с ^=645 нм подбирали в диапазоне от 5 до 30 мин с интервалом в 5 мин в условиях отсутствия прямого солнечного света в концентрациях от 10 до 50 мкг/мл в ФСБ.
Биологические эффекты молекулярного конъюгата в концентрациях 0,78; 1,56; 3,125; 6,25; 12,5; 25,0; 50,0 мкг/мл оценивали при воздействии на культуру клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха (ААЭ), которую получали путем внутрибрюшинной инокуляции половозрелым самцам мышей ICR линии CD-1, полученных из нПП «Питомник лабораторных животных» (Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова). Манипуляции с животными проводились в соответствии с положениями Хельсинкской декларации, требований Европейской конвенции по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, дизайн исследования одобрен междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 5 от 17.01.2022 г.).
Суспензию клеток разносили в 96-луночные планшеты по 200 мкл в концентрации 1*106 кл/мл в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (Dulbecco's modified Eagles medium, DMEM, Lonza, Verviers, Бельгия), содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (Life Technologies Inc., США) и 0,05 % ген-тамицина (Sigma Aldrich, США). Подготовленную культуру помещали в инкубировали при 5 % CO2, 37 °C в течение суток, производили замену среды и вносили Хлорин Е6 и PEI/E6/DTPA/FA/Eu в концентрациях 1,56; 3,125; 6,25 и 12,5 мкг/мл и через сутки
поколения методами модификации физико-химических свойств природных компонентов [2, 3]. Возможным вариантом проведения целенаправленного синтеза является включение тяжелых металлов в структуру ФС для улучшения фотостабильности, фотофизических и фотохимических свойств [4]. Целью настоящего исследования является оценка фототоксического эффекта молекулярного конъюгата на основе фотосенсибилизатора Хлорина Е6 на клетки асцитной аденокарциномы Эрлиха.
и методы
тестировали на жизнеспособность с помощью метода, позволяющего оценивать способность восстанавливать 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид (MTT) в формазан. В каждую лунку планшета с клетками и препаратами вносили по 10 мкл MTT (Merk, США) и инкубировали 4 часа. Далее добавляли по 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, Химреактив, Россия) для разрушения образовавшегося формазана. Оптическую плотность суб-тратов определяли спектрофотометрически при длине волны 570 нм, используя абсорбцию при А=800 нм в качестве референса. Поскольку используемые методики основываются на оптических методах, в качестве исследуемых концентраций выбирали диапазон от 0,78 мкг/мл до 50 мкг/мл в целях соблюдения основного закона светопоглощения (закон Бугера-Ламберта-Бера), так как изучаемые ФС представляют собой растворы темно-зеленого цвета.
Фототоксический эффект молекулярного конъю-гата PEI/e6/DTPA/FA/Eu в отношении клеток оценивали методом проточной цитометрии после окрашивания 1 мкг/мл 7-Аминоактиномицином Д (7-AAD, Abcam, США). Клетки с Хлорином Е6 и PEI/e6/DTPA/ FA/Eu облучали полупроводниковым лазером красного света с ^=645 нм в течение 20 мин. и инкубировали в течение 1 и 4 сут. с последующим окраши-ваением [5]. Количество флуоресцирующих клеток с включением зонда 7-AAD оценивали на проточном лазерном цитофлуориметре MACSQuant® Analyzer 10 (Miltenyi Biotech GmbH, Германия) при возбуждении ^=520 нм и 570 нм. Обработку данных проводили, используя программу MACSQualify™ Software v/2/5 (Miltenyi Biotec GmbH, Германия).
Полученные данные обрабатывали с помощью пакета программ Microsoft Exсel 2010, STATISTICA 12.0 (StatSoft Inc., США). Проверка на нормальное распределение количественных показателей выборок проводилась с использованием критериев Шапиро-Уилка и Крамера-Мизеса-Смирнова (ю2). Различия считались достоверными при уровне значимости p<0,05.
Результаты
Хлорин Е6 представляет собой светочувствительное соединение порфиринового ряда, выделяемое из сине-зеленых водорослей [6, 7]. На основе Хлорина Е6 получен ряд фотосенсибилизаторов второго поколения, широко применяемых для проведения ФДТ [8-10]. Особенностью этого ФС является высокий коэффициент поглощения красного света в области 405 и 660 нм, излучаемых медицинскими лазерами [8].
Синтезированный нами раннее [11] молекулярный конъюгат имеет максимумы поглощения в области 403 и 662 нм, характерные для входящего в состав Хлорина Е6 (рис. 1).
и обсуждение
Е6 уменьшилось от 183,81±18,83 мкг/мл до 136,27±13,63 мкг/мл, в то время как молекулярного конъюгата от 200,73±20,07 мкг/мл до 154,91±15,49 мкг/мл. Стоит отметить, что наибольшая интенсивность выгорания отмечалась для ФС в концентрации 7 мкг/мл, причем после 30 мин. воздействия красным светом концентрация Хлорина Е6 составляет 3,89±0,19 мкг/мл и 6,11±0,31 мкг/мл для PEI/e6/DTPA/FA/Eu.
Рис. 1. Спектр поглощения Хлорина Е6 и молекулярного конъюгата РЕ1/Е6ШТРА/РА/Еи в концентрации 50 мкг/мл
Примечание. В правом верхнем углу расположено изображение синтезированного молекулярного конъюгата.
Одним из недостатков метода ФДТ является неконтролируемое уменьшение количества ФС («фотовыгорание») за счет его деградации при дневном свете и в процессе облучения. Молекулы ФС в таком случае повреждаются и теряют способность флуоресцировать, что приводит к уменьшению или полному отсутствию сигнала и их способности излучать энергию. Известно, что изменение величины флуоресценции пропорционально степени окисления молекул зонда активными формами кислорода, что позволяет определить оптимальное время облучения и оценить степень «фотовыгорания» ФС [12].
В рамках настоящего исследования с применением флуорогенного зонда 2',7'-дихлорфлуоресцин диацетата, который под действием АФК окисляется до 2',7'-дихлорфлуоресцеина показано, что наиболее оптимальным временем воздействия красного света с >=645 нм на синтезируемое соединение является 20 мин (рис. 2).
Процесс облучения светочувствительных соединений неизбежно сопряжен с изменением оптической плотности ФС после воздействия источника излучения. По окончании 30 мин. воздействия на вещества, растворенные в ФСБ, содержание Хлорина
Рис. 2. Флуоресценция свободного и конъюгированного 15 мкг/мл Хлорина Е6 в присутствии 4 мкг/мл зонда при облучении красным светом лазера >,=645 нм
Результаты исследования жизнеспособности опухолевых клеток показали, что при концентрации 0,78 мкг/мл РЕ1/е6ЮТРА^А/Еи через сутки инкубации, количество жизнеспособных составило 80,0±4,0 %, тогда как, при 1,56; 3,125; 6,25 и 12,5 мкг/мл этот процент варьировал от 78,0±3,9 % до 55±2,8 %. При более высоких концентрациях показатель возрастал и составил 78-80 %. Для контрольных интактных клеток без воздействия ФС отмечена 100 % выживаемость клеток.
Исследование цитотоксического эффекта ФС с применением интеркалирующего красителя 7-ААБ позволяет идентифицировать клетки с неповрежденными плазматическими мембранами, поскольку не проникает в них. Установлено, что количество нежизнеспособных клеток Эрлиха через 1 сут. после контакта с конъюгатом в минимальной концентрации 1,56 мкг/мл и облучения составило 3,54±0,18 % со свободным Хлорином Е6 22,52±1,13 %. При максимальной концентрации 12,5 мкг/мл ФС через 4 сут. составило 81,49±4,07 % и 47,37±2,37 % соотве-ственно, что указывало на более мощный цитотокси-ческий потенциал РЕ1/е6ЮТРА^А/Еи по сравнению с Хлорином Е6.
таким образом, проведено исследование фотодинамических свойств нового молекулярного конъюгата РЕ1/е6ЮТРА^А/Еи и его эффективности в качестве потенциального ФС, эффективного в отношении гибели опухолевых клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха.
Выводы
1. Синтезированный молекулярный конъюгат качественно и количественно подтверждает включе-состава РЕ1/е6/БТРА^А/Еи имеет в спектре погло- ние фотосенсибилизатора Хлорина Е6 в структуру щения максимумы в областях 403 и 662 нм, что вещества.
Р^и FAR EASTERN MEDICAL JOURNAL / 2023 / № 4 FUNDAMENTAL MEDICINE
2. Оптимальным временем воздействия красного света с ^=645 нм на растворы молекулярного конъю-гата и Хлорина Е6 является 20 мин. интервал.
3. Установлено, что молекулярный конъюгат РЕ1/ е6ЮТРА/РА/Еи в совокупности с 20 мин. облучением
красным светом с ^=645 нм облучением обладает более мощным цитотоксическим потенциалом в отношении опухолевых клеток Эрлиха, чем свободный Хлорин Е6.
Список источников
1. Клименко И.В., Лобанов А.В. Биосовместимые супрамолекулярные системы на основе Хлорина Е6 // Актуальные аспекты химической технологии биологически актив-А43. - 2020. - С. 179.
2. Миронычева А.М., Кириллин М.Ю., Хилов А.В., Малыгина А.Ш., Куракина Д.А., Гутаковская В.Н., Гамаю-нов С.В. Комбинированное применение двухволнового флуоресцентного мониторинга и бесконтактной термометрии при фотодинамической терапии базальноклеточного рака кожи // Современные технологии в медицине. - 2020. - Т. 12, № 3. - С. 47-54.
3. Мищенко Т.А., Митрошина Е.В., Турубанова В.Д., Альзеибак Р., Балалаева И.В., Ведунова М.В. Сравнительный анализ действия фотосенсибилизаторов фотосенс, фотодитазин и гиперицин на клетки глиомы и первичные нейрональные культуры in vitro // Современные технологии в медицине. - 2019. - Т. 11, № 4. - С. 52-63.
4. Amirshaghaghi A., Yan L., Miller J., Daniel Y., Stein J.M., Busch T.M., Tsourkas A. Chlorin e6-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticle (SPION) nanoclusters as a theranostic agent for dual-mode imaging and photodynamic therapy // Scientific reports. - 2019. - Т. 9, № 1. - P. 2613. doi.org/10.1038/s41598-019-39036-1.
5. Dymek M., Sikora E. Liposomes as biocompatible and smart delivery systems - The current state // Advances in Colloid and Interface Science. - 2022. - P. 102757, doi.org/10.1016/j.cis.2022.102757.
6. Haussmann K., Streitz M., Takvorian A., Grund J., Skenderi Z., Tietze-Bürger C., Bullinger L. Widely applicable, extended flow cytometric stem cell enumeration panel for quality control of advanced cellular products // Scientific Reports. - 2022. - Т. 12, № 1. - P. 17995, doi.org/10.1038/s41598-022-22339-1.
7. Kawasaki R., Ohdake R., Yamana K., Eto T., Sugikawa K., Ikeda A. Photodynamic therapy using self-assembled nanogels comprising chlorin e6-bearing pullulan //Journal of Materials Chemistry B. - 2021. - Т. 9, № 32. -P. 6357-6363, doi.org/10.1039/D1TB00377A.
8. Kubrak T.P., Kolodziej P., Sawicki J., Mazur A., Koziorowska K., Aebisher, D. Some natural photosensitizers and their medicinal properties for use in photodynamic therapy // Molecules. - 2022. - Т. 27, № 4. - P. 1192. doi.org/10.3390/molecules27041192.
9. Nguyen, V N., Yan, Y., Zhao, J., & Yoon, J. Heavy-atom-free photosensitizers: from molecular design to applications in the photodynamic therapy of cancer // Accounts of chemical research. - 2020. - Т. 54, № 1. - P. 207-220, doi.org/10.1021/acs.accounts.0c00606.
10. Shevchenko O.V, et al. Europium-Containing Conjugate for Photodynamic Therapy of Malignant Neoplasms // Russian Journal of Inorganic Chemistry. - 2022. - Т. 67, № 9. - P. 1361-1367, doi.org/10.1134/S003602362209011X.
11. Shi J., Zeng Q., Wang P., Chang Q., Huang J., Wu M., Wang H. A novel chlorin e6 derivative-mediated photodynamic therapy STBF-PDT reverses photoaging via the TGF-ß pathway // Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. -2023. - Т. 41. - P. 103321, doi.org/10.1016/j.pdpdt.2023.103321.
12. Sztandera K., Gorzkiewicz M., Klajnert-Maculewicz B. Nanocarriers in photodynamic therapy - in vitro and in vivo studies // Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. - 2020. - Т. 12, № 3. -P. e1509, doi.org/10.1007/s11051-023-05701-w.
References
1. Klimenko I.V, Lobanov A.V Biocompatible supramolecular systems based on Chlorin E6 // Current aspects of chemical technology biologically active-A43. - 2020. - P. 179.
2. Mironycheva A.M., Kirillin M.Yu., Khilov A.V, Malygina A.Sh., Kurakina D.A., Gutakovskaya VN., Gamayunov S.V. Combined use of dual-wave fluorescent monitoring and non-contact thermometry in photodynamic therapy of basal cell skin cancer // Modern Technologies in Medicine. - 2020. - Vol. 12, № 3. - P. 47-54.
3. Mishchenko T.A., Mitroshina E.V, Turubanova VD., Alzeibak R., Balalaeva I.V., Vedunova M.V. Comparative analysis of the effects of photosensitizers photosens, photoditazine and hypericin on glioma cells and primary neuronal cultures in vitro // Modern Technologies in Medicine. - 2019. - Vol. 11, № 4. - P. 52-63.
4. Amirshaghaghi A., Yan L., Miller J., Daniel Y., Stein J.M., Busch T.M., Tsourkas A. Chlorin e6-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticle (SPION) nanoclusters as a theranostic agent for dual-mode imaging and photodynamic therapy // Scientific reports. - 2019. - Т. 9, № 1. - P. 2613. doi.org/10.1038/s41598-019-39036-1.
5. Dymek M., Sikora E. Liposomes as biocompatible and smart delivery systems - The current state // Advances in Colloid and Interface Science. - 2022. - P. 102757, doi.org/10.1016/j.cis.2022.102757.
6. Haussmann K., Streitz M., Takvorian A., Grund J., Skenderi Z., Tietze-Burger C., Bullinger L. Widely applicable, extended flow cytometric stem cell enumeration panel for quality control of advanced cellular products // Scientific Reports. - 2022. - T. 12, № 1. - P. 17995, doi.org/10.1038/s41598-022-22339-1.
7. Kawasaki R., Ohdake R., Yamana K., Eto T., Sugikawa K., Ikeda A. Photodynamic therapy using self-assembled nanogels comprising chlorin e6-bearing pullulan //Journal of Materials Chemistry B. - 2021. - T. 9, № 32. -P. 6357-6363, doi.org/10.1039/D1TB00377A.
8. Kubrak T.P., Kolodziej P., Sawicki J., Mazur A., Koziorowska K., Aebisher D. Some natural photosensitizers and their medicinal properties for use in photodynamic therapy // Molecules. - 2022. - T. 27, № 4. - P. 1192. doi. org/10.3390/molecules27041192.
9. Nguyen V N., Yan Y., Zhao J. & Yoon J. Heavy-atom-free photosensitizers: from molecular design to applications in the photodynamic therapy of cancer // Accounts of chemical research. - 2020. - T. 54. - № 1. - P. 207-220, doi. org/10.1021/acs.accounts.0c00606.
10. Shevchenko O.V, et al. Europium-Containing Conjugate for Photodynamic Therapy of Malignant Neoplasms // Russian Journal of Inorganic Chemistry. - 2022. - T. 67, № 9. - P. 1361-1367, doi.org/10.1134/S003602362209011X.
11. Shi J., Zeng Q., Wang P., Chang Q., Huang J., Wu M., Wang H. A novel chlorin e6 derivative-mediated photodynamic therapy STBF-PDT reverses photoaging via the TGF-P pathway // Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. - 2023. - T. 41. - P. 103321, doi.org/10.1016/j.pdpdt.2023.103321.
12. Sztandera K., Gorzkiewicz M., Klajnert-Maculewicz B. Nanocarriers in photodynamic therapy - in vitro and in vivo studies // Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. - 2020. - T. 12, № 3. -P. e1509, doi.org/10.1007/s11051-023-05701-w.
Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article.
The authors declare no conflicts of interests.
Статья принята к публикации 11.10.2023.
The article was accepted for publication 11.10.2023.
□□□
