CC BY
31
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2020, том 55, № 1, с. 66-76
УДК 633.15:581.132 doi: 10.15389/agrobiology.2020.1.66rus
ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПИГМЕНТЫ И ФОТОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ЛИСТЬЕВ КУКУРУЗЫ (Zea mays L.) ПОД ВЛИЯНИЕМ ТИАМЕТОКСАМА*
Д.А. ТОДОРЕНКО1, О.В. СЛАТИНСКАЯ1, J. HAO2, Н.Х. СЕЙФУЛЛИНА1, C.N. RADENOVIC3, Д.Н. МАТОРИН1, Г.В. МАКСИМОВ1, 4
В последнее десятилетие неоникотиноидные инсектициды активно используются для защиты растений от вредителей. При этом мало изучено их воздействие на сами растения, в частности на состояние фотосинтезирующих пигментов. В настоящей работе впервые показано, что обработка листьев кукурузы (Zea mays L.) инсектицидом тиаметоксамом (TMX) приводит к снижению функциональной активности фотосистемы II и уменьшению энергизации мембран ти-лакоидов. Кроме того, эффект воздействия тиаметоксама зависит от генотипа кукурузы. Цель работы заключалась в изучении действия пестицида тиаметоксама на фотосинтетические пигменты и фотохимическую активность фотосинтетического аппарата листьев кукурузы двух генотипов. Опыты проводили в 2018-2019 годах. Объектом исследования служили образцы листьев кукурузы инбредной линии zppl 225 и гибрида zp 341 с высокими показателями всхожести, качества зерна и урожайности (Institut za kukuruz «Zemun Polje», г. Белград, Сербия). Семена проращивали до появления корешков (длина не менее 5 мм), после чего высаживали в грунт (смесь вермикулит: чернозем — 1:1) и выращивали в условиях 16-часового светового дня при постоянной температуре 25 °С. При появлении 3-го настоящего листа (длина более 4 см) растения опрыскивали раствором TMX в концентрации 0,2 мг/л. В качестве контроля использовали растения, выращенные в аналогичных условиях без опрыскивания TMX. Измерения проводили при достижении 5-м настоящим листом размера 12-14 см. Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофилла a, b и каротиноидов) определяли спектрофотометрически в 100 % экстракте ацетона и рассчитывали по формулам Хольма-Веттштейна. Изменение конформации молекул каротиноидов регистрировали методом спектроскопии комбинационного рассеяния (КР). Светоиндуци-рованные кинетики быстрой флуоресценции (БФ), замедленной флуоресценции (ЗФ) и модулированного отражения при X = 820 нм (МР) регистрировали одновременно с помощью мульти-функционального анализатора растений M-PEA-2 («Hansatech Instruments», Великобритания). Индукционные кривые БФ (OJIP-кривые) анализировали с помощью стандартного JIP-теста. Установлено, что в фазу 5-го настоящего листа у инбредной линии zppl 225 содержание хлоро-филлов в присутствии TMX снижалось с 0,74 до 0,61 мг/г: количество хлорофилла а уменьшилось на 17 %, хлорофилла b — на 24 %. Напротив, в листьях гибрида zp 341 при воздействии TMX изменений в пигментном составе не выявляли. OJIP-кривые у контрольных и обработанных TMX листьев имели типичный вид кривых с характерными фазами O-J, J-I и I-P, которые отражали процессы последовательного восстановления переносчиков в электрон-транспортной цепи фотосинтеза (ЭТЦ) между двумя фотосистемами. Воздействие пестицида на листья двух генотипов кукурузы проявлялось в снижении функционального состояния фотосистемы II, определенного по параметру флуоресценции (PIabs), который был получен на основании анализа OJIP-кривых с помощью JIP-теста. Сравнение PIabs в контроле и при воздействии TMX выявило статистически значимые (p < 0,05) различия: в листьях у образцов zppl 225 и zp 341, обработанных TMX, параметр PIabs снижался соответственно на 29 и 24 %. В листьях кукурузы были обнаружены изменения в быстрой фазе замедленной флуоресценции, связанные с уменьшением энергизации тилакоидной мембраны при воздействии TMX. Анализ максимальных скоростей окисления и восстановления Р700 (кинетика МР) свидетельствует об уменьшении пула акцепторов на акцепторной стороне ФИ в листьях zppl 225 при воздействии TMX. Обнаружено, что реакционные центры (РЦ) ФИ zp 341 проявили устойчивость к воздействию TMX (отсутствие изменений в редокс-превращениях Р700). TMX вызывал изменения конформации молекул каро-тиноидов, но не менял их содержание в листе. Предложенная комбинация методов быстрой флуоресценции, замедленной флуоресценции, модулированного отражения при X = 820 нм и спектроскопии комбинационного рассеяния может стать основой для формирования эффективной технологии диагностики ранних дефектов состояния фотосинтетических пигментов при попадании пестицидов в интактное растение.
Ключевые слова: кукуруза, пестициды, тиаметоксам, хлорофилл, каротиноид, флуоресценция, комбинационное рассеяние, Рамановская спектроскопия.
*
Работа выполнена по гранту РФФИ 20-04-00465 А. 66
В последнее десятилетие нейроактивные инсектициды на основе никотина (имидаклоприд, ацетамиприд, динотефуран, тиаметоксам) широко используются для защиты растений от вредителей. Неоникотиноиды действуют как агонисты ацетилхолина, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина (nAChR) на постсинаптической мембране, что вызывает блокирование синаптической передачи, торможение проведения возбуждения и гибель насекомого (1). Однако нет единого мнения о влиянии неоникотиноидов на состояние самого растения (2). С одной стороны, неоникотиноиды способны улучшать морфологические и физиологическое характеристики некоторых растений даже в стрессовых условиях, что способствует их росту и повышению урожайности (3), с другой — существуют данные о фитотоксичности неоникотиноидов (4, 5).
Известно, что производство кукурузы осложняется воздействием различных абиотических и биотических факторов, а также способностью фитофагов повреждать растение на самых ранних стадиях развития. Перспективно исследовать изменения состояния пигментного состава растений кукурузы при действии неоникотиноидов как в лабораторных, так и полевых условиях.
Фотосинтетический аппарат (ФСА) высших растений, состоящий из пигмент-белковых комплексов, включает два типа пигментов — хлоро-филлы и каротиноиды. После поглощения квантов света молекулы пигментов антенны переносят энергию на реакционные центры (РЦ) двух фотосистем, в возбужденном состоянии отдающих электроны акцепторам, которые далее восстанавливают НАДФ+ до НАДФН, синтезируют АТФ и впоследствии органические вещества. Состояние ФСА — один из чувствительных индикаторов стресса у растений (6). При его изучении эффективны флуоресцентные методы, обладающие высокой чувствительностью и позволяющие выявить нарушения состояния пигментов задолго до появления морфологических изменений (7, 8). При исследовании состояния молекул каротиноидов широко используется метод спектроскопии комбинационного рассеяния света (КР), который позволяет контролировать изменения конформации молекулы каротиноидов антенны фотосистемы II (ФСП), оценивая вклад валентных колебаний С=С-связей (I1520/I1006), переходы из плоской конфигурации молекулы в изогнутую (I960/I1006), а также изменения длины полиеновой цепи (I1520/I1160) (9).
В настоящей работе впервые показано, что обработка листьев кукурузы инсектицидом тиаметоксамом (TMX) приводит к снижению функциональной активности фотосистемы II и уменьшению энергизации мембран тилакоидов. Кроме того, эффект воздействия тиаметоксама зависит от генотипа кукурузы. Так, у инбредной линии zppl 225 показано уменьшение содержания хлорофилла и пула акцепторов на акцепторной стороне ФС1. Тиаметоксам вызывает противоположные изменения конформации молекул каротиноидов в антенне, но не меняет их содержание.
Цель работы заключалась в изучении действия пестицида тиаме-токсама на фотосинтетические пигменты и фотохимическую активность фотосинтетического аппарата листьев кукурузы двух генотипов.
Методика. Опыты проводили в 2018-2019 годах. Исследовали образцы листьев кукурузы (Zea mays L.) инбредной линии zppl 225 и гибрида zp 341 с высокими показателями всхожести, качества зерна и урожайности (Institut za kukuruz «Zemun Polje», г. Белград, Сербия) (10). Семена проращивали до появления корешков (длина не менее 5 мм), после чего выса-
живали в грунт (смесь вермикулита с черноземом 1:1) и выращивали в условиях 16-часового светового дня при постоянной температуре 25 °С. При появлении 3-го настоящего листа длиной более 4 см (10-е сут после проращивания) растения опрыскивали раствором тиаметоксама [5-ме-тил-3-(2-хлортиазол-5-илметил)-1,3,5-оксадиазинан-4-илиден-^нитроамин] в концентрации 0,2 мг/л. В качестве контроля использовали листья кукурузы, выращенные в аналогичных условиях без опрыскивания тиамет-оксамом. Измерения проводили при достижении 5-м настоящим листом размера 12-14 см.
Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофиллов a, b и ка-ротиноидов) определяли спектрофотометрически в 100 % экстракте ацетона на приборе Hitachi-557 («Hitachi», Япония) и рассчитывали по формулам Хольма-Веттштейна (11). Изменение конформации молекул кароти-ноидов регистрировали методом спектроскопии КР при помощи КР-спектрометра ДФС 24 («ЛОМО», Россия) с лазером 473 нм (Ciel, «Euro-lase», Германия) и системой регистрации МОРС 1/3648 («ЛОМО», Россия) на базе линейной ПЗС-матрицы TCD1304DG («Toshiba», Япония) с фильтром LP02-473RS-50 («Shemrock», США). В эксперименте фрагмент листовой пластинки фиксировали на предметном столике и регистрировали сигнал КР в течение 5 с, мощность лазера на образце 3 мВт.
Светоиндуцированные кинетики быстрой флуоресценции (БФ), замедленной флуоресценции (ЗФ) и модулированного отражения при X = 820 нм (МР) регистрировали одновременно с помощью мультифунк-ционального анализатора растений M-PEA-2 («Hansatech Instruments», Великобритания). Интенсивность действующего света и продолжительность освещения составляли соответственно 3000 мкмоль квантов • м-2 • с1 и 60 с. Измерения проводили на адаксиальной стороне интактных листьев, помещенных в измерительный блок в специальной клипсе-прищепке. Перед измерением растения адаптировали к темноте в течение 15 мин, чтобы реакционные центры (РЦ) фотосистем перешли в «открытое» состояние с окисленным Qa. Три сигнала регистрировали при чередовании световых и темновых интервалов, длительность которых подробно описана R.J. Strasser с соавт. (12).
Индукционные кривые БФ (OJIP-кривые) анализировали с помощью стандартного JIP-теста, описывающего потоки энергии через различные участки электрон-транспортной цепи фотосинтеза (13) при 20 мкс (Fo), 270 мкс ^270мкс), 2 мс (Fj), 30 мс (Fj) и максимальной степени флуоресценции (Fm). Эти характеристики использовали для расчета максимального квантового выхода фотохимии ФС11 как отношения переменной флуоресценции (Fy) к максимальной (Fm) Fv/Fm = 1 - Fo/Fm, вероятности транспорта электронов за пределы Qa- Veo = 1 - (Fj -Fo)/(Fm - Fo), потока энергии (ABS), поглощаемой одним активным реакционным центром (RC), как ABS/RC = 4 х ^емкс - Fo) * (Fm - Fo)-3 * (Fj - Fo)-1 * Fm и показателя функциональной активности ФС11, отнесенной к поглощаемой энергии (индекс производительности ФС11): PIabs = (ABS/RC)-1 х Fv/Fm * х (1 - Fv/Fm)-1 х veo * (1 - Veo)-1 (13).
Кинетики модулированного отражения/поглощения света при X = 820 нм (МР) характеризуют окислительно-восстановительные превращения пигмента ФС1 (Р700) и пластоцианина (12). В нашем исследовании сигнал МР был нормирован по МР0 и представлен как МР/МР0 - 1, где МР0 — интенсивность сигнала рассеяния при 0,7 мс.
Статистическую обработку полученных данных проводили, используя непараметрический критерий для множества независимых переменных Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis test) с помощью пакета Statistica v.10 («StatSoft, Inc.», США). Значения p < 0,05 считались статистически значимыми. В таблице представлены значения среднего (M) и стандартные ошибки среднего (+SEM).
Результаты. Пигментный состав листьев мало различался у двух генотипов кукурузы (zppl 225 и zp 341), но после действия тиаметоксама были обнаружены явные изменения, зависящие от генотипа. Так, в листьях у инбредной линии zppl 225 в присутствии TMX выявили снижение содержания хлорофиллов с 0,74 до 0,61 мг/г: количество хлорофилла а уменьшилось на 17 %, хлорофилла b — на 24 % (p < 0,05). Напротив, при воздействии TMX на листья гибрида zp 341 изменений в пигментном составе не обнаружили.
Индукционные кривые БФ (OJIP) как у контрольных, так и у обработанных TMX листьев имели типичный вид кривых с характерными фазами O-J, J-I и I-P, которые отражали процессы последовательного восстановления переносчиков в электрон-транспортной цепи фотосинтеза (ЭТЦ) между двумя фотосистемами (13) (рис. 1, А, Г). Исходный уровень O (origin) соответствует интенсивности флуоресценции при «открытых» РЦ ФС11 (Fo), когда все акцепторы в фотосистеме II (ФСП) находятся в окисленном состоянии и способны принять электрон. Нарастание флуоресценции в фазе O-J обусловлено светоиндуцированным восстановлением состояний Qa". Последующие фазы J-I-P отражают дальнейший рост флуоресценции, связанный с накоплением состояний Qa" в результате восстановления акцепторов Qb, пула хинонов и первичных акцепторов фотосистемы I (ФС1) (14).
Рис. 1. Индукционные кривые (OJIP) быстрой флуоресценции (БФ) листьев кукурузы (Zea mays L.) (А, Г), кривые в виде относительной переменной флуоресценции Vt = (Ft - Fo)/(Fm - Fo) после нормирования на уровни O и P (Б, Д) и разности значений функций AVt = Vt(TMX) - ^(коиГроль) (В, Е) для инбредной линии zppl 225 (А, Б, В) и гибрида zp 341 (Г, Д, Е) в контроле (1) и при
опрыскивании тиаметоксамом (2). O, J, I и P — пики на кривой индукции, наблюдаемые соответственно при 20 мкс, 2 мс, 30 мс и 300 мс.
При воздействии TMX у инбредной линии zppl 225 и гибрида zp 341 наблюдались небольшие изменения в форме OJIP (см. рис. 1, А, Г). Для более детального анализа индукционные кривые были дважды нормированы (на уровни O и P) и представлены в виде относительной перемен-
ной флуоресценции (Vt) (см. рис. 1, Б, Д) и как разность значений функций Vt между контролем и образцами, обработанными TMX (AVt) (см. рис. 1, В, Е). Воздействие пестицида на листья двух генотипов кукурузы проявлялось в увеличении AVt в фазе O-J, что свидетельствует о накоплении восстановленного Qa в результате увеличения доли QB-невосстанав-ливающих центров ФСП, то есть центров, не способных к передаче электрона по электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) (15). В листьях инбредной линии zppl 225 изменения в фазе O-J оказались более выражены, чем у гибрида zp 341. Кроме того, в листьях zppl 225 эффект воздействия TMX сопровождался увеличением амплитуды фазы J-I: AVt увеличивалось в фазах O-J и J-I, что свидетельствует о накоплении восстановленных форм Qa и молекул пластохинонов, которые не способны к передаче электронов для темновых реакций фотосинтеза (8).
Параметры JIP-теста, полученные после анализа индукционных кривых OJIP, для листьев растений кукурузы (Zea mays L.) двух генотипов при действии ти-аметоксама (TMX) (M±SEM)
Параметр флуоресценции
zppl 225
zppl 225 + TMX
zp 341
zp 341 + TMX
Fv/FM 0,740±0,004 (100 %) 0,740±0,004 (99 %) 0,740±0,010 (100 %) 0,710±0,010 (97 %)
ТСо 0,69±0,01 (100 %) 0,65±0,01 (93 %)* 0,67±0,01 (100 %) 0,66±0,02 (100 %)
ABS/RC 2,62±0,09 (100 %) 2,93±0,13 (112 %) 2,57±0,12 (100 %) 2,95±0,18 (115 %)
PIABs_ 2,50±0,10 (100 %) 1,77±0,15 (71 %)* 2,24±0,23(100 %) 1,70±0,09 (76 %)*
Примечание. Fv/Fм — максимальный квантовый выход фотохимии ФСП, уео — вероятность транспорта электронов за пределы QA~, ABS/RC — поток энергии, поглощаемый одним активным рекционным центром (РЦ), PIABS — показатель функциональной активности ФСП, отнесенной к поглощаемой энергии. В скобках представлены значения в процентах от контроля. * Различия с контролем статистически значимы (р < 0,05).
Индукционные кривые БФ анализировали с помощью ЛР-теста (13) (табл.). Известно, что наиболее адекватный параметр ЛР-теста — величина отношения Fv/Fм, которое коррелирует с максимальным квантовым выходом первичной фотохимической реакции ФС11 и используется как показатель эффективности фотосинтеза (6). Величина Fv/Fм в контроле в фазу 5-го листа у zppl 225 и zp 341 составила 0,74±0,01. Полученные значения фотосинтетической активности, определенные по Fv/Fм, были сопоставимы со значениями Fv/Fм, полученными для растений С4-фотосинтеза (16). При воздействии ТМХ в листьях zppl 225 и zp 341 статистически значимых различий по параметру Fv/Fм не выявляли (р > 0,05).
В отличие от параметра Fv/Fм, индекс производительности PIABS существенно менялся при воздействии ТМХ. Известно, что PIABS коррелирует с жизнеспособностью растения и отражает текущее состояние работы ФСА в условиях стресса (17). Сравнение PIABS в контроле и при воздействии ТМХ выявило статистически значимые ф < 0,05) различия: в листьях у образцов zppl 225 и zp 341, обработанных ТМХ, параметр PIABS снижался соответственно на 29 и 24 %.
PIABS — интегральный показатель, который включает в себя три независимых параметра: долю активных РЦ (ABS/RC), эффективность переноса электронов захваченным экситоном в цепи переноса электронов за пределы QA (уео) и вероятность того, что экситон будет связан в РЦ (Fv/Fм) (13). Снижение PIABS в листьях zppl 225 в присутствии ТМХ было обусловлено значительным уменьшением эффективности электронного транспорта на акцепторной стороне ФСП (уео), что подтверждается изменениями в индукционных кривых БФ, представленных выше ф < 0,05). Напротив, снижение PIABS в листьях zp 341 могло быть связано с незначительным уменьшением доли активных РЦ (увеличение ABS/RC) и фото-
химии ФС11 (Fv/Fm).
А Б
Ю1 10IJ I01 102 ° Ю1 10 a 101 10= 103
Время, мс
Рис. 2. Светоиндуцированные кинетики модулированного отражения при X = 820 нм (Mí) (А, В) и замедленной флуоресценции (ЗФ), нормированные на минимальный уровень сигнала D2 при 200 мс (Б, Г), у листьев кукурузы (Zea mays L.) инбредной линии zppl 225 (А, Б) и гибрида zp 341 (В, Г) в контроле (1) и при опрыскивании тиаметоксамом (2). Кинетики МР нормированы и представлены в виде МР/МРо — 1, где МРо — интенсивность сигнала при 0,7 мс. I1, I2, Di, D2 — максимумы и минимумы на индукционной кривой ЗФ.
Окислительно-восстановительные превращения реакционных центров молекул ФС1 (P700) в присутствии TMX мы оценивали по поглощению света при X = 820 нм (МР) (18) (рис. 2, А, В). Известно, что кинетика светоиндуцированного спада сигнала МР в первые 15-20 мс отражает процесс окисления Р700 (быстрая фаза) и достигает минимума при ~ 20 мс (МРмин). МРмин — переходное устойчивое состояние с равными скоростями окисления и ре-восстановления Р700. Впоследствии скорость ре-восстановления преобладает над скоростью окисления за счет донирова-ния электронов от ФСП, приводя к уменьшению величины поглощения при X = 820 нм и росту сигнала МР (медленная фаза) до максимума при ~ 200 мс (МРмакс) (12).
В присутствии TMX в листьях кукурузы инбредной линии zppl 225 и гибрида zp 341 были выявлены изменения в окислительно-восстановительных превращениях Р700 (см. рис. 2, А, В). Отметим, что у хлорофилла в листьях zppl 225 были обнаружены изменения в быстрой и медленной фазах МР, связанные с уменьшением амплитуды при ~ 20 мс (см. рис. 2, А). Анализ максимальных скоростей окисления и восстановления Р700 (кинетика МР) свидетельствует об уменьшении образования окисленных и увеличении — восстановленных форм акцепторов ФС1 (P700) при воздействии TMX на листья zppl 225. Вероятно, это связано с уменьшением пула акцепторов, таких как P700, на акцепторной стороне ФС1. Напротив, РЦ ФС1 листьев гибрида zp 341 проявляли резистентность к воздействию TMX (отсутствие изменений в МР кинетиках) (см. рис. 2, В).
Степень энергизации тилакоидных мембран мы оценивали по пикам I1 и I2 замедленной флуоресценции, измеренной в микросекундном временн0м диапазоне (0-0,09 мс). Известно, что ЗФ пропорциональна скорости реакций рекомбинаций в ФСП, на которые влияет энергизация тилакоидной мембраны (6). В процессе работы мы анализировали быст-
рую фазу ЗФ, связанную с формированием потенциала на мембране. Известно, что быстрая фаза ЗФ имеет два пика ^ (~ 7 мс) и ^ (~ 100 мс), после чего падает до минимума D2 (~ 200 мс) (19). На рисунке 2 (Б, Г) представлены индукционные кривые ЗФ листьев zppl 225 и zp 341, обработанных ТМХ, нормированные на уровень минимальной флуоресценции D2. При действии ТМХ в листьях zppl 225 и zp 341 снижалась амплитуда пика I! по сравнению с контролем соответственно на 23 и 21 %. Уменьшение пика ^ в микросекундном временном диапазоне могло быть вызвано снижением скорости ре-окисления QA (нарушение на акцепторной стороне ФСП) и/или уменьшением восстановления от 4МпСа кластера кислород-выделяющего комплекса (КВК) (19).
10г 101 10" 10' ю-г ю-1 10" 1С1
Время, мс
Рис. 3. Относительная переменная флуоресценция Woj = (Ft - Fo)/(Fj - Fo) между уровнями O и J (А, В) и разность значений функций AWoj = Woj(tmx) - Wojomm^b) (Б, Г) у листьев кукурузы (Zea mays L.) инбредной линии zppl 225(А, Б) и гибрида zp 341 (В, Г) в контроле (1) и при опрыскивании тиаметоксамом (2). O, K, J — пики на кривой индукции, наблюдаемые соответственно при 20 мкс, 300 мкс и 2 мс.
Состояние КВК и его способность донировать электрон для Р680+ через Z+ мы контролировали по появлению дополнительного пика на индукционной кривой БФ. Для этого рассчитывали относительную флуоресценцию между пиками O и J как Woj = (Ft - Fo)/(Fj - Fo) (см. рис. 3, А, В) и разность значений функций между контролем и образцами, обработанными TMX как AWoj = Woj(tmx) - WoJ(контроль) (см. рис. 3, Б, Г). В листьях zppl 225 и zp 341 при действии TMX был обнаружен дополнительный пик между O и J при ~ 300 мкс (пик К) (см. рис. 3, Б, Г), который характерен для высокотемпературного стресса за счет ограничения переноса электронов к РЦ из-за нарушений в работе КВК (13).
В спектрах комбинационного рассеивания (КР) листьев кукурузы были выявлены характерные для каротиноидов полосы (960, 1006, 1156, 1190, 1200 и 1520 см1), обусловленные валентными колебаниями электронов в полиеновой цепочке молекулы (рис. 4). Максимальные изменения амплитуды полос спектра КР наблюдались для соотношений I1520/I1006 (вклад валентных колебаний —С=С— связей полиеновой цепи каротинои-да), I1520/I1160 (изменение вклада —С=С— связей по отношению к —С—С— связям полиеновой цепи) и I1006/I960 (расположение полиеновой цепи ка-ротиноида относительно пиррольных колец) (20). Наличие в спектрах КР
Рис. 4. Изменение спектров комбинационного рассеивания (КР) каротиноидов в листьях кукурузы (Zea mays L.) двух генотипов при опрыскивании тиаметоксамом (TMX):
а — инбредная линия zppl 225, б — zppl 225 + ТМХ, в — гибрид zp 341, г — гибрид zp 341 + ТМХ. Звездочкой обозначены статистически значимые различия (p < 0,05). На вставке представлен спектр КР кароти-ноида листа кукурузы инбредной линии zppl 225.
пиков на 1190 и 1200 см1 указывало на состояние каротиноидов, характерное для 15-^ конформации (данные не представлены).
После опрыскивания листьев кукурузы ТМХ наблюдалось увеличение соотношения полос 1960Д1006 (см. рис. 4), что может указывать на изменение конформации молекул каротиноидов в антенне ФСА. При действии ТМХ в листьях инбредной линии zppl 225 менялась кон-формация полиеновой цепи молекулы каротиноидов, что проявлялось в снижении вклада валентных колебаний —С=С— на 26 % (соотношение 11520Л1006). В листьях гибрида zp 341 в присутствии ТМХ было отмечено увеличение величины соотношений 11520/11160 и 11520/11006 соответственно на 16 и 43 %, что свидетельствует об изменении в листьях гибрида zp 341 конформации кароти-ноидов, но не их содержания.
В настоящей работе мы исследовали влияние пестицида ТМХ на фотосинтетические пигменты и фотохимическую активность фотосинтетического аппарата листьев кукурузы двух генотипов с помощью современных спектральных и флуоресцентных методов.
Инбредная линия кукурузы zppl 225 была подвержена большим изменениям при опрыскивании листьев ТМХ, чем гибрид zp 341. У инбредной линии zppl 225 выявлено уменьшение содержания хлорофиллов, которое, вероятно, свидетельствует о том, что при действии ТМХ снижается синтез этих пигментов. Отметим, что в листьях zppl 225 выявлено уменьшение соотношения хлорофиллы (а + Ь)/каротиноиды, что, как правило, коррелирует с увеличением содержания каротиноидов в условиях стресса (21). Напротив, у листьев гибрида zp 341 изменений в пигментном составе не выявлено. Ранее на примере хлопка показано, что неоникотиноиды не влияют на содержание хлорофиллов, тогда как у листьев бамии при воздействии ацетамиприда зарегистрировано постепенное увеличение общего содержания хлорофилла (22). В то же время ТМХ может выступать в качестве биоактиватора, увеличивая физиологическую и метаболическую активность такой культуры, как рис (23)
Влияние ТМХ на состояние ФСП, ФС1, электронных переносчиков между фотосистемами в листьях кукурузы zppl 225 и zp 341 оценивали, исходя из набора параметров, полученных после анализа кинетических кривых БФ, ЗФ и МР. Анализ кинетических кривых БФ с помощью ЛР-теста, который описывает потоки энергии через различные участки электрон-транспортной цепи фотосинтеза (13), позволил выявить, что ТМХ оказывал незначительное (р > 0,05) воздействие на фотохимию
ФС11 (Fv/Fm) в листьях двух изученных генотипов. Обнаружены изменения на акцепторной стороне ФСП, связанные со снижением вероятности электронного транспорта после акцептора Qa~ (veo), в листьях инбредной линии zppl 225. Снижение эффективности электронного транспорта на акцепторной стороне ФС11 (уе0) вызывало уменьшение функциональной активности ФС11 (PIabs). Другие неоникотинодные пестициды, такие как ацетамиприд, также не оказывают воздействия на Fv/Fm и приводят к значительному снижению функциональной активности ФС11 за счет уменьшения размера пула и снижения электронного транспорта на акцепторной стороне ФС11 у цианобактерий Synechocystis sp. (24).
Таким образом, при опрыскивании растений кукурузы пестицидом тиаметоксамом (TMX) было выявлено снижение содержания хлорофилла в листьях инбредной линии zppl 225 по сравнению с гибридом zp 341. Кроме того, в листьях zppl 225 обнаружено уменьшение пула акцепторов на акцепторной стороне фотосистемы I (ФС1). Установлено, что TMX воздействует на функциональную активность фотосистемы II (ФСП), уменьшая параметр PIabs, и снижает формирование потенциала на тилакоидной мембране (Ij) как у zppl 225, так и у zp 341. TMX вызывал противоположные изменения конформации молекул каротиноидов в антенне, но не менял их содержание, что, по-видимому, связано с более эффективным рассеянием избыточной энергии через систему каротиноидов в листьях zp 341 по сравнению с zppl 225. Предложенная комбинация методов позволяет эффективно оценивать функциональное состояние фотосинтетического аппарата в листьях в полевых и лабораторных условиях как при биомониторинге, так и при сравнении различных линий сельскохозяйственных культур.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ensley S.M. Neonicotinoids. Veterinary toxicology (third edition). Basic and clinical principles /R.C. Gupta (ed.). Academic Press, 2018: 521-524 (doi: 10.1016/C2016-0-01687-X).
2. Georgieva M., Tsenov B., Dimitrova A. Dual effects of N-nitroguanidine neonicotinoids on plants. Genetics and Plant Physiology, 2017, 7(3-4): 107-120.
3. da Silva Almeida A., Villela F.A., Nunes J.C., Meneghello G.E., Jauer A. Thiamethoxam: an inseticide that improve seed rice germination at low temperature insecticides. In: Insecticides — Development of safer and more effective technologies /T. Trdan (ed.). IntechOpen, 2013: 417-426 (doi: 10.5772/53207).
4. Shakir S.K., Irfan S., Akhtar B., Rehman S.U., Daud M.K., Taimur N., Azizullah A. Pesticide-induced oxidative stress and antioxidant responses in tomato (Solanum lycopersicum) seedlings. Ecotoxicology, 2018, 27(7): 919-935 (doi: 10.1007/s10646-018-1916-6).
5. Qavu§oglu K., Yalijm E., Turkmen Z., Yapar K., Sagir S. Physiological, anatomical, biochemical, and cytogenetic effects of thiamethoxam treatment on Allium cepa (amaryllidaceae) L. Environmental Toxicology, 2012, 27(11): 623-670 (doi: 10.1002/tox.20680).
6. Маторин Д.Н., Рубин А.Б. Флуоресценция хлорофилла высших растений и водорослей. М.Ижевск, 2012.
7. Matorin D.N., Todorenko D.A., Seifullina N.Kh, Zayadan B.K., Rubin A.B. Effect of silver nanoparticles on the parameters of chlorophyll fluorescence and P700 reaction in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Microbiology, 2013, 82(6): 809-814 (doi: 10.1134/S002626171401010X).
8. Kalaji H.M., Jajoo A., Oukarroum A., Brestic M., Zivcak M., Samborska I.A., Cetner M.D., Lukasik I., Goltsev V., Ladle R.J., D^browski P., Ahmad P. The use of chlorophyll fluorescence kinetics analysis to study the performance of photosynthetic machinery in plants. In: Emerging Technologies and Management of Crop Stress Tolerance. V. 2 /P. Ahmad, S. Rasool (eds.). Elsevier, USA, 2014: 347-384 (doi: 10.1016/B978-0-12-800875-1.00015-6).
9. Merlin J.C. Resonance Raman spectroscopy of carotenoids and carotenoid-containing systems. Pure and Applied Chemistry, 1985, 57(5): 785-792 (doi: 10.1351/pac198557050785).
10. Тютяев Е.В., Шутова В.В., Максимов Г.В., Раденович Ч.Н., Гродзинский Д.М. Состояние фотосинтетических пигментов в листьях инбредных линий и гибридов кукурузы.
Физиология растений и генетика, 2015, 47(2): 147-159.
11. von Wettstein D. Chlorophyll-letale und der submikroskopische Formwechsel der Plastiden. Experimental Cell Research, 1957, 12(3): 427-506 (doi: 10.1016/0014-4827(57)90165-9).
12. Strasser R.J., Tsimilli-Michael M., Qiang S., Goltsev V. Simultaneous in vivo recording of prompt and delayed fluorescence and 820-nm reflection changes during drying and after rehydration of the resurrection plant Haberlea rhodopensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, 2010, 1797(6-7): 1313-1326 (doi: 10.1016/j.bbabio.2010.03.008).
13. Strasser R.J., Tsimilli-Michael M., Strivastava A. Analysis of the chlorophyll a fluorescence transient. In: Chlorophyll a fluorescence: advances in photosynthesis and respiration series, V. 19 /G.C. Papageorgiou, Govindjee (eds.). Springer, Dordrecht, 2004: 321-362 (doi: 10.1007/978-1-4020-3218-9_12).
14. Stirbet A., Govindjee. Chlorophyll a fluorescence induction: a personal perspective of the thermal phase, the J-I-P rise. Photosynthesis Research, 2015, 113(1-3): 15-61 (doi: 10.1007/s11120-012-9754-5).
15. Lazar D. The polyphasic chlorophyll a fluorescence rise measured under high intensity of exciting light. Functional Plant Biology, 2006, 33(1): 9-30 (doi: 10.1071/FP05095).
16. Nieva F.J.J., Castellanos E.M., Figueroa M.E., Gil F. Gas exchange and chlorophyll fluorescence of C3 and C4 saltmarsh species. Photosynthetica, 1999, 36(3): 397-406 (doi: 10.1023/A: 1007024019133).
17. Zivcak M., Olsovska K., Slamka P., Galambosova J., Rataj V., Shao H.B., Brestic M. Application of chlorophyll fluorescence performance indices to assess the wheat photosynthetic functions influenced by nitrogen deficiency. Plant, Soil and Environment, 2014, 60(5): 210-215 (doi: 10.17221/73/2014-PSE).
18. Schansker G., Srivastava A., Govindjee, Strasser R.J. Characterization of the 820-nm transmission signal paralleling the chlorophyll a fluorescence rise (OJIP) in pea leaves. Functional Plant Biology, 2003, 30(7): 785-796 (doi: 10.1071/FP03032).
19. Goltsev V., Chernev P., Zaharieva I., Strasser R.J. Delayed fluorescence in photosynthesis. Photosynthesis Research, 2009, 101(2-3): 217-232 (doi: 10.1007/s11120-009-9451-1).
20. Кэри П. Применение спектроскопии КР и РКР в биохимии /Под ред. Б.В. Локшина. М., 1985.
21. Соловченко А.Е., Мерзляк М.Н. Оптическое экранирование как фотозащитный механизм растений. М., 2010.
22. Preetha G., Stanley J. Influence of neonicotinoid insecticides on the plant growth attributes of cotton and okra. Journal of Plant Nutrition, 2012, 35(8): 1234-1245 (doi: 10.1080/01904167.2012.676134).
23. Macedo W.R., Araujo D.K., de Camargo e Castro P.R. Unravelling the physiologic and metabolic action of thiamethoxam on rice plants. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2013, 107(2): 224-249 (doi: 10.1016/j.pestbp.2013.08.001).
24. Li L., Chen Xi., Zhang D., Pan X. Effects of insecticide acetamiprid on photosystem II (PSII) activity of Synechocystis sp. (FACHB-898). Pesticide Biochemistry and Physiology, 2010, 98(2): 300-304 (doi: 10.1016/j.pestbp.2010.06.022).
1ФГБОУ ВО Московский государственный университет Поступила в редакцию им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, 30 июля 2019 года
119234 Россия, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ,
e-mail: [email protected] Н, [email protected], [email protected], [email protected];
2Shenzhen MSU-BIT University, No 299, Ruyi Road, Longgang District, Shenzhen, Guangdong, 518172 China, e-mail: [email protected];
3Institut za kukuruz «Zemun Polje», 11185 Beograd-Zemun, ul. Slobodana Bajica 1, Srbija, e-mail: [email protected];
4ФГАОУ ВО Национальный исследовательский технологический университет МИСиС, 119049 Россия, г. Москва, Ленинский просп., 4, e-mail: [email protected]
Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2020, V. 55, № 1, pp. 66-76
PHOTOSYNTHETIC PIGMENTS AND PHYTOCHEMICAL ACTIVITY OF PHOTOSYNTHETIC APPARATUS OF MAIZE (Zea mays L.) LEAVES UNDER THE EFFECT OF THIAMETHOXAM
D.A. Todorenko1, O.V. Slatinskaya1, J. Hao2, N.Kh. Seifullina1, C.N. Radenovic3,
D.N. Matorin1, G. V. Maksimov1, 4
1Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, 1-12 Leninskie Gory, Moscow, 119991 Russia, e-mail [email protected] (H corresponding author), [email protected], [email protected], [email protected]; 2Shenzhen MSU-BIT University, No 299, Ruyi Road, Longgang District, Shenzhen, Guangdong, 518172 China, e-mail [email protected];
3Maize Research Institute, Zemun Polje, ul. Slobodana Bajicha 1, 11185 Belgrade-Zemun, Serbia, e-mail [email protected];
4National Research Technological University MISIS, 4, Leninskii prosp., Moscow, 119049 Russia, e-mail gmaksi-
ORCID:
Todorenko D.A. orcid.org/0000-0002-7344-0256 Radenovich C.N. orcid.org/0000-0001-7218-9015 Hao J. orcid.org/0000-0003-4256-5969 Matorin D.N. orcid.org/0000-0002-6164-5625
Slatinskaya O.V. orcid.org/0000-0002-9908-2637 Maksimov G.V. orcid.org/0000-0002-7377-0773 Seifullina N.Kh. orcid.org/0000-0002-6313-794X The authors declare no conflict of interests Acknowledgements:
Supported financially by Russian Foundation for Basic Research, grant No. 20-04-00465 A
Received July 30, 2019 doi: 10.15389/agrobiology.2020.1.66eng
Abstract
In the last decade, neonicotinoid insecticides have been actively used to protect plants from pests. Moreover, their effect on the plants, in particular on the state of photosynthetic pigments, has been studied paucity. In the present work, it was shown for the first time that treatment of maize (Zea mays L.) leaves with a thiamethoxam (TMX) insecticide leads to a decrease in the functional activity of photosystem II and a decrease in the energyzation of thylakoid membranes. In addition, the effect of thiamethoxam depends on the genotype of maize. The aim of the work was to study the effect of thiamethoxam pesticide on photosynthetic pigments and the photochemical activity of the photosynthetic apparatus of corn leaves of two genotypes. The experiments were carried out in 2018-2019. The object of the study was samples of maize leaves of the inbred line zppl 225 and hybrid zp 341 with high rates of germination, grain quality and yield (Institut za kukuruz "Zemun Polje", Belgrade, Serbia). The seeds were germinated until the roots appeared (length not less than 5 mm), after which they were planted in the soil (vermiculite: chernozem mixture, 1: 1) and grown under 16-hour daylight at a constant temperature of 25 °C. When the third true leaf appeared (more than 4 cm in length), the plants were sprayed with a TMX solution at a concentration of 0.2 mg/l. Plants grown under similar conditions without TMX spraying were used as controls. The measurements were carried out when the fifth true leaf reached a size of 12-14 cm. The content of photosynthetic pigments (chlorophyll a, b and carotenoids) was determined spectrophotometrically in 100 % acetone extract and calculated using the Holm-Wetstein formula. A change in the conformation of carotenoid molecules was recorded by Raman spectroscopy. Light-induced kinetics of prompt fluorescence (PF), delayed fluorescence (DF) and modulated reflection at X = 820 nm (MR) were recorded simultaneously using a multifunctional plant efficiency analyzer M-PEA-2 (Hansatech Instruments, Great Britain). PF induction curves (OJIP curves) were analyzed using a standard JIP-test. It was found that in the phase of the fifth true leaf, in the inbred line zppl 225, the chlorophyll content in the presence of TMX decreased from 0.74 to 0.61 mg/g: the amount of chlorophyll a decreased by 17 %, chlorophyll b by 24 %. In contrast, no changes in pigment composition were detected in the leaves of the zp 341 hybrid when exposed to TMX. The OJIP curves of the control and TMX-treated leaves had a typical curve with characteristic O-J, J-I, and I-P phases, which reflected the processes of sequential reduction of carriers in the electron transport chain of photosynthesis (ETC) between two photosystems. The effect of the pesticide on the leaves of two maize genotypes was manifested in a decrease in the functional state of photosystem II, determined by the fluorescence parameter (PIabs), which was obtained based on the analysis of OJIP curves using the JIP-test. Comparison of PIabs in the control and under the influence of TMX revealed statistically significant (p < 0.05) differences: in the leaves of zppl 225 and zp 341 samples treated with TMX, the PIabs parameter decreased by 29 and 24%, respectively. Changes in the fast phase of delayed fluorescence, associated with a decrease in the energyzation of the thylakoid membrane upon exposure to TMX, were detected in the leaves of maize. An analysis of the maximum oxidation and reduction rates of P700 (MR kinetics) indicates a decrease in the acceptor pool on the acceptor side of PSI in zppl 225 leaves when exposed to TMX. It was found that the reaction centers (RCs) of PSI zp 341 showed resistance to TMX (no change in the redox transformations of P700). TMX caused changes in the conformation of carotenoid molecules, but did not change their content in the leaf. The proposed combination of methods for prompt fluorescence, delayed fluorescence, modulated reflection at X = 820 nm and Raman spectroscopy can be the basis for the formation of an effective technology for the diagnosis of early defects of photosynthetic pigments when pesticides enter an intact plant.
Keywords: Zea mays L., pesticides, Raman spectroscopy, thiamethoxam, chlorophyll, carotenoids, chlorophyll fluorescence.
