CC BY
44
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ САРКОМЫМ-1КРЫ... 53
УДК 616-006.3.04:616.92.9:615.832.3 М.А. Каплан1, А.И. Малыгина1, Г.В. Пономарев2, А.А. Михайловская1, В.В. Дрожжина1, Л.М. Архипова1, Ю. С. Осипчук1 ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ САРКОМЫ М-1 КРЫС С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА АМИДАМИНХЛОРИНА 1 Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России, Обнинск 2ФГБНУ «НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича», Москва Контактная информация Михайловская Анастасия Александровна, зав. лабораторией экспериментальной фотодинамической терапии адрес: 249038 Калужская область, г. Обнинск, ул. Любого, д.11, кв. 83; тел. +7(484)399-70-29 e-mail: an [email protected] Статья поступила 09.07.2014, принята к печати 09.02.2015. Резюме В эксперименте на модели опухоли саркома М-1 изучена эффективность внутрибрюшинного введения амидоаминхлорина как фотосенсибилизатора при проведении ФДТ. Цель исследования - определить параметры минимально эффективной дозы ФС и лазерного излучения при ФДТ для достижения полной регрессии опухоли. Изучали динамику накопления фотосенсибилизатора в опухоли и здоровой ткани для определения времени проведения ФДТ и противоопухолевую эффективность при разных дозах ФС и различных параметрах лазерного излучения. В результате проведенного исследования был определен оптимальный срок проведения ФДТ и установлена минимально эффективная доза ФС и параметры лазерного излучения. Ключевые слова: опухоль, фотосенсибилизатор, лазер, динамика накопления.
M.A. Kaplan1, A.I. Malyg¡па1, G.V.Ponomarev2, A.A. Mikhailovskaya1, V.V. Drozhzhina1, L.M. Arkhipova1, J.S. Osipchuk1 PHOTODYNAMIC THERAPY OF RAT SARCOMA М-1 1WITH PHOTOSENSITIZER AMIDOAMINCHLORINE 1A. Cyb Scientific Centre of Radiology of the Hertsen Federal Medical Research Centre of the Ministry of Health of the Russian Federation, Obninsk 2Institute of biomedical chemistry, Moscow Abstract Efficacy of photodynamic therapy with intraperitoneal introduction photosensitizer Amidoaminchlorine on rat sarcoma M1 model was studied. The aim of this study was to determine minimum effective dose of photosensitizer and parameters of laser radiation for achievement of tumor full regress. Dynamics of photosensitizer accumulation in tumor and healthy tissues was studied to definite the time of photodynamic therapy. Antitumor efficacy different doses of photosensitizer and various parameters of laser radiation were investigated. As a result, optimal term of photodynamic therapy, photosensitizer minimum effective dose and parameters of laser irradiation were established. Key words: tumor, photosensitizer, laser, dynamics of accumulation. Введение точный терапевтический эффект при минимальном повреждении окружающих здоровых тканей и от- ФДТ - метод лечения злокачественных опу- сутствии общетоксического действия. В настоящее холей, основанный на способности ФС селективно время большой интерес в ФДТ злокачественных накапливаться в ткани опухоли вследствие особен- новообразований в качестве ФС вызывают произ-ностей биохимии злокачественной клетки и, при водные ряда хлорофилла [15]. Вновь созданный локальном воздействии лазерного облучения опре- амидоаминхлорин является химической модифика-деленной длины волны, генерировать образование цией периферических заместителей хлорина е6. синглетного кислорода и других активных радика- Спектральные характеристики амидоаминхлорина лов, оказывающих цитотоксический эффект на позволяют использовать его с теми же лазерами, опухолевые клетки [3; 4; 6-10; 12-14]. Кроме пря- которые используются для других ФС хлоринового мого цитотоксического воздействия ФДТ на опухо- ряда, т. е. с максимумом излучения при длине вол-левые клетки важную роль в деструкции новообра- ны 662 нм [1; 5; 16; 17]. зования играют: нарушение кровоснабжения за Цель работы - определить минимально эф-счет повреждения эндотелия кровеносных сосудов фективную дозу ФС и параметров лазерного излу-опухолевой ткани; цитокиновые реакции, обуслов- чения для достижения полной регрессии опухоли у ленные стимуляцией продукции фактора некроза 100 % животных. опухоли, активацией макрофагов, лейкоцитов и Задачи исследования: лимфоцитов. Прогресс ФДТ опухолей связан с соз- • изучить динамику накопления амидоа-данием эффективных ФС, обеспечивающих доста- минхлорина в опухоли и здоровой ткани;
№ 1/том 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
54 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ САРКОМЫ М-1 КРЫ...
• изучить противоопухолевую эффектив- см. Объём опухоли измеряли: до проведения ФДТ ность ФДТ саркомы М-1 при разных до- (У0), на 3; 7; 10; 14 и 21 сутки после ФДТ. Эффектив-зах ФС амидоаминхлорина (внутрибрю- ность ФДТ оценивали по коэффициенту абсолютного шинное введение) и различных парамет- прироста опухоли и по эффекту ингибирования роста рах лазерного излучения. опухоли (по рекомендации Фармкомитета по пред- клинической апробации препаратов [11]): Материалы и методы 1. По коэффициенту абсолютного прироста опухоли (К). Для этого сначала вычис-Исследования были проведены на 62 беспо- ляли объёмы опухолей по формул: родных крысах. В качестве экспериментальной модели опухоли использовали саркому М-1 крыс [2]. Опухоль перевивали под кожу в область бедра в у _ 1 ^ х d х d где виде кусочков опухоли донора. В опыт крыс брали 6 1 2 3 ' на 7-9 день, когда опухоль достигала 0,7-1,0 см в диаметре, шерстный покров депилировали. В качестве ФС использовали амидоаминхлорин, который <!3 - три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли, вводили внутрибрюшинно в разных дозах. V - объем опухоли, см3. Изучение динамики накопления ФС Коэффициент абсолютного прироста опухо-в опухоли и здоровой ткани крыс ли (К) рассчитывали по формуле: Для изучения динамики накопления амидоаминхлорин вводили крысам с саркомой М-1 внутрибрюшинно в дозе 2,5 мг/кг. к _ у — У0 Уровень накопления ФС оценивали по ин- к _ у , где тенсивности флуоресценции. Измерение уровня 0 накопления ФС в опухолевой и здоровой тканях изучали с помощью спектрофлуоресцентного мето- Vo - объем опухоли до воздействия, да на комплексе «ЛЭСА-01-Биоспек» (Россия). V - объем опухоли на определенный срок наблюдения. Датчики подводили к коже над опухолью и в трех т°чках под прямьш углом к объекту (центр, пери- 2. По торможению роста опухоли (ТРО, ферия 1 и периферия 2). Накопление в здоровой %). показатель вычисляли по формуле: ткани определяли на здоровой ткани бедра с опухолью (контроль 1) и на противоположенном бедре (контроль 2). Перед измерением шерстный покров Ук — Уо лп0/ депилировали. Время экспозиции составляло 1-2 с. 1ги _ х 10% , где В различные сроки времени после введения ФС у ук каждого животного измеряли спектры опухолевой и здоровой тканей. Первое измерение проводили до введения препарата (0 ч), а затем через 20 мин; 1,0; Vk - средний объем опухоли в контРольной группе' 15' 30' 4 0 и 55 ч Vo - средний объем опухоли в опытной группе. Для суждения о селективности накопления ФС в опухоли по отношению к здоровой ткани рас- 3. По проценту животных с полной регрес- считывали индекс контрастности (опухоль/здоро- сии (ПР, %) опухоли (К = -1,00). За пол-вая ткань). ную регрессию опухоли мы принимали отсутствие видимой и пальпируемой Изучение параметров опухоли. эффективной дозы ФС Статистическую обработку результатов ис-и лазерного излучения следований проводили в компьютерной программе В опыте было 5 групп животных. ФДТ про- «^йвйса» непараметрическими методами дга неводили разными дозами ФС и различными пара- жшиеимьк групп (описательная статистика, метод метрами лазерного излучения: и-теста Манна-Уитни). 1 группа - доза ФС 1,25 мг/кг, 100 Дж/см2, 0 34 Вт/см2; Результаты и обсуждение 2 группа - доза ФС 1,25 мг/кг, 150 Дж/см2, 0,34 Вт/см2; Изучение динамики накопления ФС 3 группа -' доза ФС 1,25 мг/кг, 150 Дж/см2, в опухоли и здоровой ткани 0,51 Вт/см2; Уровень и селективность накопления ФС в 4 группа -2 доза ФС 2,5 мг/кг, 150 Дж/см2, опухоли, а также скорость его выведения из нор-0,51 Вт/см2; мальной ткани являются важнейшими характери- 5 группа доза ФС 2,5 мг/кг, 300 Дж/см2, 0,51 стиками для ФДТ. Они влияют как на эффектив-Вт/см2. ность метода, так и на вероятность снижения по-Контроль - крысы-опухоленосители без ка- бочных эффектов. кого-либо воздействия. Из данных, представленных на рисунке, Животные при облучении находились под об- видно, что в течение 5,5 ч после внутрибрюшинно -щим тиопенталовым наркозом (внутрибрюшинно 2,5 го введения амидоаминхлорина в дозе 2,5 мг/кг % раствор в объеме 0,2 мл/100 г массы животного). происходит постепенное увеличение уровня накоп-Источником лазерного излучения служил ления его как в опухоли, так и в здоровой ткани. полупроводниковый лазерный аппарат «Аткус-2» Максимальный уровень накопления ФС в опухоли производства ЗАО «Полупроводниковые приборы» наблюдался через 3,0-5,5 ч после введения ФС. Что (Санкт-Петербург) с длиной волны излучения касается индекса контрастности, то самый высокий 662±1 нм. Диаметр светового пятна составлял 1,5 (1,8) мы наблюдали через 3 часа.
№ 1/том 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ САРКОМЫМ-1КРЫ..
55
Таблица
Динамика роста саркомы М-1 крыс после ФДТ при внутрибрюшинном введении амидоаминхлорина в разных дозах при различной плотности энергии и плотности мощности лазерного излучения_
№ гр Схема проведения ФДТ 1. Объём опухоли, V 2. Коэффициент прироста опухоли, К 3. Торможение роста опухоли, ТРО % 4. Полная регрессия опухоли, ПР %
Сроки наблюдений
3сутки 7 сутки 10 сутки 14 сутки 21 сутки
1 1,25 мг/кг 100 Дж/см2 0,34 Вт/см2 0,266±0,036 0,62±0,20* 57,6 0 0,392±0,150 1,59±1,07* 82,8 44,4 0,533±0,241 2,75±1,70* 86,2 55,6 0,929±0,430 5,62±3,14* 87.5 55.6 4,538±1,904 30,98±13,35 67,1 55,6
2 1,25 мг/кг 150 Дж/см2 0,34 Вт/см2 0,023±0,016 -0,85±0,10* 96,3 77,8 0,125±0,076 -0,14±0,52* 94,5 66,7 0,284±0,187 0,70±1,17* 92.6 66.7 1,082±0,685 5,52±4,32* 85,4 66,7 4,695±2,330 28,11±14,34 70,9 55,6
3 1,25 мг/кг 150 Дж/см2 0,51 Вт/см2 Полная регрессия опухоли у 100 % животных 0,046±0,035 -0,39±0,45* 98,0 62,5 0,088±0,051 0,16±0,67* 97,7 62,5 0,332±0,182 3,16±2,38* 95,6 50,0 I,035±0,453 II,88±6,07* 92,5 50,0
4 2,5 мг/кг 150 Дж/см2 0,51 Вт/см2 Полная регрессия опухоли у 100 % животных 0,006±0,006 -0,80±0,20* 99,8 87,5 0,083±0,039 -0,01±0,50* 98,9 50,0 0,288±0,144 3,79±2,68* 97,9 50,0
5 2,5 мг/кг 300 Дж/см2 0,51 Вт/см2 Полная регрессия опухоли у 100 % животных
Контроль (V, К) 0,627±0,055 2,97±0,50 2,287±0,204 14,01±2,05 3,858±0,433 20,73±2,04 7,461±1,014 36,00±3,85 13,787±1,543 65,31±7,70
*р<0,05 статистически достоверно по сравнению с контролем
Рис. амидоаминхлорина в опухоли и здоровой ткани крыс с саркомой М -1: А - уровень накопления; Б - индекс контрастности.
Таким образом, оптимальное время проведения лазерного облучения после введения ФС наступает через 3 часа - т.е. в это время мы имеем высокое накопление ФС в опухолевой ткани и минимальное содержание его в здоровых тканях.
Изучение параметров эффективной дозы ФС и лазерного излучения
Результаты исследований в 1 группе показали, что при дозе ФС 1,25 мг/кг при плотности энергии 100 Дж/см2 и плотности мощности 0,34 Вт/см2 лазерного излучения на 21 сутки после ФДТ полная регрессия отмечалась у 55,6 % крыс. У животных с ростом опухоли наблюдалось снижение темпа при-
роста новообразования по сравнению с таковым в контроле. И это снижение до 14 суток исследования достоверно значимо (р<0,001). И хотя на 21 сутки наблюдения коэффициент абсолютного прироста опухоли в опытной группе ниже, чем в контроле, и составлял 30,98±13,35, это снижение уже не было значимым по сравнению с таковым в контроле (65,31±7,70; р<0,142). ТРО на 21 сутки после ФДТ составляло 61,7 % (см. таблицу).
Во 2 группе при увеличении плотности энергии до 150 Дж/см2, но при той же дозе ФС и плотности мощности лазерного излучения (1,25 мг/кг, 0,34 Вт/см2) мы наблюдали увеличение процента ПР и ТРО до 14 суток исследования. Но на 21 сутки наблюдения процент ПР опухоли и ТРО практически не отличались от данных группы
56
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ САРКОМЫМ-1КРЫ..
1. Коэффициент абсолютного прироста опухоли у животных составил на 21 сутки 28,11±14,13 и также достоверно незначим по сравнению с таковым контроля (p<0,086).
В 3 группе при увеличении плотности мощности до 0,51 Вт/см2, но при той же дозе ФС и плотности энергии (1,25 мг/кг и 150 Дж/см2) мы получили хороший ингибирующий эффект. На 21 сутки наблюдения ТРО составляло 92,5 % при 50 % ПР опухоли. Снижение прироста опухоли на 21 сутки после ФДТ отмечалось по сравнению с группой 2 и достоверно ниже, чем в контроле (11,88±6,07; p<0,002).
В 4 группе при увеличении дозы ФС до 2,5 мг/кг, но при тех же параметрах лазерного облучения как в группе 3 (150 Дж/см2 и 0,51 Вт/см2), наблюдалось усиление противоопухолевого воздействия. До 7 суток исследования отмечалась полная регрессия опухоли у всех животных в группе. На 21 сутки исследования ТРО составляло 97,9 % при 50 % ПР опухоли, коэффициент абсолютного прироста у животных с ростом опухоли (3,79±2,68) отличался от коэффициента в группе 3 и значительно отличался от контроля (p<0,001).
В 5 группе при увеличении плотности энергии в 2 раза (300 Дж/см2) при той же дозе ФС и плотности мощности (2,5 мг/кг, 0,51 Вт/см2) до 21 суток после ФДТ наблюдалась полная регрессия опухоли у всех животных.
Таким образом, противоопухолевый эффект до 21 суток после ФДТ получен при всех исследуемых дозах ФС (1,25; 2,5 мг/кг) и параметрах лазерного облучения (100; 150 и 300 Дж/см2; 0,34 и 0,51 Вт/см2).
Литература
1. Бурмистрова Н.В., Каплан М.А., Пономарев Г.В., Малыгина А.И. Изучение фотодинамической активности Амидоамин-хлорина // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т. 8, № 2. - С. 30.
2. Гаркуша Н. Ф., Гончарова Н.Ю. Характеристика саркомы М-1 крыс // Науч. докл. высшая школа биол. науки. - 1990. -№6. - С. 154-60.
3. ГельфондМ.Л. Возможности ФДТ в онкологической практике // Физическая медицина. - 2005. - Т. 15, № 2. - С. 33-7.
4. Каплан М.А., Никитина Р.Г., Малыгина А.И. Экспериментальная разработка путей оптимизации фотодинамической терапии // Лазерная и фотодинамическая терапия. Тез. докл. междунар. конф. - Обнинск, 1999. - С. 17-8.
5. Каширцева И.В., Каплан М.А., Малыгина А.И. Сравнительная оценка противоопухолевой эффективности препарата Хлоринаминамида-1 в различной форме при фотодинамической терапии саркомы М-1 // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы ФД и ФДТ». Фотодинамическая терапия и фотодиагностика. - №1. - 2012. - С. 18-9.
6. Корчагина К.С., Гамаюнов С.В., Каров В.А. и др. Прогностическое значение параметров флюоресценции при фотодинамической терапии // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 1. - С. 100.
7. Меерович И.Г., Казачкина Н.И., Савицкий А.П. Изучение проявлений фотоиммунного отклика при фотодинамической терапии // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 1. - С. 110.
8. Меерович И.Г., Меерович Г.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Распределение света по глубине опухолевого очага и эффективность использования терапевтического излучения при фотодинамической терапии // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т. 5, № 3. - С. 93-7.
9. Отдельнова О.Б., Гельфонд М.Л., Хашукоева А.З. и др. Предклиническая оценка фотосенсибилизатора и источника света для оптимизации ФДТ // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т. 8, № 2. - С. 38-9.
10. Романко Ю.С., Цыб А.Ф., Каплан М.А., Попучиев В.В. Зависимость противоопухолевой эффективности фотодинамической терапии от плотности световой энергии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. - Т. 139, № 4. - С. 456-61.
11. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. - М.: Гриф и К, 2012. - Часть 1. - С.
12. Странадко Е.Ф. Основные этапы развития и современное состояние ФДТ в России // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 2. - С. 51.
13. Филоненко Е.Б. Флуоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия в онкологии // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 2. - С. 85.
14. Цыб А.Ф., Каплан М.А., Романко Ю.С., Попучиев В.В. Фотодинамическая терапия. - М.: Мед. информ. агентство, 2009. - 193 с.
15. Чан Тхи Хай Иен, Г.В. Раменская, Н.А. Оборотова. Фотосенсибилизаторы хлоринового ряда в фотодинамической терапии опухолей // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т. 8, № 4. - С. 99-105.
16. Kashirtseva I.V., Kaplan M.A., Ponomarev G.V., Malygina A.I. Comparative évaluation of antitumoral efficiency of préparation chlorine-amineamide-1 in a various forms for photodynamic therapy of sarcoma M-1 // Abstracts of Laser Helsinki 2012 International Congress Helsinki, Finland 24-29 August 2012. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2012. - 9(1). - S11.
17. Kashirtseva I.V., Kaplan M.A., Ponomarev G.V.et al. Comparative evaluation of antitumoral efficiency of various photosensi-tizers at photodynavic therapy of sarcoma M-1 // Abstracts of Laser Helsinki 2012 International Congress Helsinki, Finland 2429 August 2012. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2012. - 9(1). - S11-S12.
Противоопухолевая эффективность ФДТ зависела от дозы ФС, плотности энергии и плотности мощности лазерного излучения. Значительный ингибирующий эффект наблюдался уже при дозе ФС 1,25 мг/кг, при плотности энергии 150 Дж/см2 и плотности мощности 0,51 Вт/см2 лазерного излучения. Полная регрессия опухоли у 100 % животных до 21 суток после ФДТ отмечалась при использовании амидоаминхлорина в дозе ФС 2,5 мг/кг, при плотности энергии лазерного излучения 300 Дж/см2 и плотности мощности 0,51 Вт/см2.
Выводы
1. Оптимальное время проведения лазерного облучения после внутрибрюшинного введения амидоаминхлорина в дозе 2,5 мг/кг наступает через 3 часа, когда индекс контрастности достигает своего максимального значения.
2. Значительный ингибирующий эффект (ТРО - 92,5 % и ПР - 50 %) получен уже при внутрибрюшинном введении ФС в дозе 1,25 мг/кг, при плотности энергии 150 Дж/см2 и плотности мощности 0,51 Вт/см лазерного излучения.
3. Минимально эффективная доза ФС, приводящая к полной регрессии саркомы М-1 у 100 % животных на 21 сутки исследования после ФДТ, при внутри-брюшинном введении амидоаминхлори-на составляла 2,5 мг/кг при плотности энергии лазерного излучения 300 Дж/см2 и плотности мощности 0,51 Вт/см .
