CC BY
148
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.1 13.(7 + 4): 547.327
Фосфорилгуанидины. Новый класс аналогов нуклеиновых кислот
М. С. Купрюшкин, Д. В. Пышный, Д. А. Стеценко*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8 *E-mail: [email protected] Поступило в редакцию 28.09.2014
РЕФЕРАТ Описан новый класс аналогов нуклеиновых кислот, содержащих фосфорилгуанидиновую группу. Окисление связанного с полимерным носителем динуклеозид-Р-цианэтилфосфита йодом в присутствии 1,1,3,3-тетраметилгуанидина приводит к образованию динуклеотида, содержащего незаряженную тетра-метилфосфорилгуанидиновую группу (Tmg), в качестве основного продукта. Tmg-группа устойчива в условиях твердофазного олигонуклеотидного синтеза, последующего удаления защитных групп и отщепления олигонуклеотида от полимерного носителя аммонолизом. Олигонуклеотиды, содержащие Tmg-группу, способны связываться с комплементарными последовательностями ДНК и РНК со сродством, лишь незначительно отличающимся от сродства природных олигодезоксирибонуклеотидов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА аналоги нуклеиновых кислот, модифицированный олигонуклеотид, твердофазный синтез, тетраметилгуанидин, фосфорилгуанидин, фосфит.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ MALDI-TOF - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с последующим применением времяпролетного масс-анализатора; ОФ-ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; TMG - 1,1,3,3-тетраметилгуанидин.
Аналоги нуклеиновых кислот различной структуры широко используются в молеку-лярно-биологических исследованиях, а также рассматриваются в качестве перспективных терапевтических средств и зондов для молекулярной диагностики [1, 2]. Однако в настоящее время главным препятствием, сдерживающим широкое внедрение производных нуклеиновых кислот, является недостаточное проникновение олигонуклео-тидов в клетки в отсутствие особых трансфекцион-ных агентов или доставочных платформ. Считается, что одна из основных причин неэффективного проникновения олигонуклеотидных производных в клетку - их большой суммарный отрицательный заряд.
За последние 20 лет относительно хорошо были изучены только два типа аналогов нуклеиновых кислот с формально электронейтральным остовом - пептидные нуклеиновые кислоты (РПА) [3] и фосфор-диамидные морфолиноолигонуклеотиды (РМО) [4]. Аналоги обоих типов способны к комплементарному связыванию с природными молекулами ДНК и РНК, и в силу этого они нашли применение как в молекулярной биологии, так и, в особенности, в медицине в качестве потенциальных лекарственных препаратов [5, 6]. Таким образом, поиск новых аналогов нуклеиновых кислот, на основе которых возможна разработка олигонуклеотидных терапевтических
средств, способных эффективно проникать в клетки в отсутствие трансфекционных агентов или иных средств доставки, остается весьма актуальной задачей.
Мы показали, что окисление 3',5'-дитимидин-Р-цианэтилфосфита йодом в пиридине в присутствии 1,1,3,3-тетраметилгуанидина (ТМ^) приводит к образованию динуклеотида с межнуклеотидной тетра-метилфосфорилгуанидиновой группой (Тmg) в качестве основного продукта (рисунок А) (аналогично, окисление триалкилфосфитов йодом в пиридине в присутствии первичного амина приводит к образованию фосфорамидов [7]). Твердофазный олиго-нуклеотидный синтез был продолжен до получения гексатимидилата. Олигонуклеотид отщепляли от полимера 25% водным раствором аммиака при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего аммиак удаляли в вакууме, и раствор, содержащий олиго-нуклеотид, анализировали при помощи ОФ-ВЭЖХ и масс-спектрометрии MALDI-ТOF.
На профиле элюции реакционной смеси (рисунок Б) видно, что основным продуктом является олигонуклеотид 5'^(Т5р*Т), где р* обозначает положение Тmg-группы. Модифицированному олиго-нуклеотиду соответствуют два пика с тн 16.7 и 17.6 мин, которые можно отнести к отдельным диастере-омерам в силу хиральности межнуклеотидной фос-
Н3С —N
1200 и
1000-
д. 800-
е
л. с 600
у
О 6 400
<
200
0
— 5 '-d(TTTTTp*T)
dT5 + dT6
12 16 20
А
Время удерживания, мин Б
—1
24
4
А - структура олигонуклеотида с межнуклеотидной тетраметилфосфорилгуанидиновой группой (Tmg). Б - профиль элюции олигонуклеотида 5'-d(T5p*T), где р* - положение Tmg-группы. ОФ-ВЭЖХ проводили на хроматографе Agilent 1200 (США), используя колонку Zorbax SB-C18 (5 мкм) 4.6 х 150 мм в градиенте ацетонитрила (0 — 40%) в 20 мМ ацетате триэтиламмония, рН 7 в течение 30 мин, скорость элюции 2 мл/мин
форилгуанидиновой группы. В качестве побочного продукта присутствует также немодифицированный олигонуклеотид dТ6 с тн 14.3 мин, который, вероятно, образуется в результате гидролиза промежуточного реакционноспособного йодфосфониевого производного следами влаги. Следует отметить выраженный гидрофобный характер Tmg-группы, проявляющийся в увеличении времени удерживания тн олигонуклеотида с Tmg-группой по сравнению со временем удерживания немодифицированного олигонуклео-тида. Были синтезированы модифицированные оли-готимидилаты длиной до 20 нуклеотидов с одной
или двумя Tmg-группами в разных положениях олигонуклеотидной цепи. Наличие тетраметилфос-форилгуанидиновых групп в составе олигонуклео-тидов подтверждено данными масс-спектрометрии MALDI-TOF (таблица).
Эксперименты по термической денатурации с оптической регистрацией сигнала при концентрации каждого олигонуклеотида 10-5 М в 10 мМ Па-какодилатном буфере рН 7.2, содержащем 100 мМ ПаС1 и 5 мМ MgCl2, выявили относительно незначительное влияние изолированной Tmg-группы на З'-конце и в середине цепи
Структура и молекулярные массы фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов, содержащих Tmg-группу
№ Нуклеотидная последовательность, 5' ^ 3' Молекулярная масса*
расчет [M] эксперимент
[M + H]+ [M-H]-
1 d(TTTTTp*T) 1860.39 1860.35 1857.54
2 d(Tp*TTTTT) 1860.39 1860.34 1858.63
3 d(TCp*A) 941.80 942.17 938.97
4 d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTp*T) 6119.16 6121.13 6113.80
5 d(TTTTTTTTTTTp*TTTTTTTTT) 6119.16 6121.54 -
6 d(TTp*TTTTTTTTTTTTTTTTTT) 6119.16 6120.01 6114.19
7 d(TTp*TTTTTTTTTTTTTTTTTp*T) 6216.33 - 6221.11
р* - положение Tmg-группы.
#Спектры MALDI-TOF регистрировали на приборе Bruker Reflex III Autoflex Speed (Германия) в варианте положительных или отрицательных ионов с использованием 3-гидроксипиколиновой кислоты в качестве матрицы.
124 | ACTA NATURAE | ТОМ 6 № 4 (23) 2014
на стабильность комплементарного комплекса, образованного модифицированными олигодезоксири-бонуклеотидами с матрицами поли^А) и поли(гА) по сравнению с контрольным олигонуклеотидом dT20. Температуры плавления (Т ) комплексов на матрице поли(гА) составили 48оС для 5'-d(T19р*T) и 46.5оС для 5'-d(T11р*T9), 54 и 52.5оС на матрице поли(dA) соответственно, что достаточно близко к Т комплексов, образованных олигонуклеотидом dТ20 на тех же матрицах - 48 и 55оС соответственно. Индивидуальные диастереомеры d(T19р*T), которые смогли разделить при помощи ОФ-ВЭЖХ, на матрице dC2A20C2 показали незначительно различающиеся значения Т - 45.8оС у диастереомера с меньшим временем удерживания и 45.1оС у диастереомера с большим временем удерживания по сравнению с 45оС у немодифицированного олигонуклеотида dT20. Комплекс олигонуклеотида с модификацией в середине цепи d(T11р*T9), полученного в виде смеси диа-стереомеров, плавился при 44.7оС. Эти результаты тем более неожиданные, поскольку при замещении межнуклеотидного фосфата тетраметилфосфорил-гуанидиновой группой на место одного атома кислорода входит группировка из 20 атомов (считая и атомы водорода). Полученные данные свидетельствуют, что модифицированные Tmg-группами олигодезок-сирибонуклеотиды могут образовывать устойчивые комплементарные комплексы с ДНК и РНК, лишь незначительно отличающиеся по своей термической стабильности от нативных, что, в частности, необходимо для проявления терапевтической активности.
Таким образом, нами описан новый класс фос-форилгуанидиновых аналогов нуклеиновых кислот [8], третий в мировой практике класс формально электронейтральных производных олигонуклеоти-дов наряду с уже известными пептидными нуклеиновыми кислотами и морфолиновыми олигоме-рами. Полученные результаты свидетельствуют, что окисление межнуклеотидного фосфита йодом в пиридине в присутствии 1,1,3,3-тетраметилгуани-дина может служить удобным методом получения производных олигонуклеотидов с тетраметилфос-
форилгуанидиновой (Tmg) группой. Важно отметить, что, в отличие от предложенных ранее оли-гонуклеотидных аналогов, а именно РПА и РМО, синтез фосфорилгуанидиновых производных можно проводить в рамках обычной амидофосфитной химии с использованием стандартного синтезатора ДНК. Появляется возможность получения разнообразных фосфорилгуанидиновых олигомеров с использованием широкого спектра коммерчески доступных амидофосфитных мономеров, включая модифицированные по углеводным остаткам и гетероциклическим основаниям.
Показано, что Tmg-группа устойчива в условиях твердофазного олигонуклеотидного синтеза, последующего удаления защитных групп и отщепления от полимерного носителя гетерогенных олигодезоксирибонуклеотидов при помощи 25% водного раствора аммиака в течение 16 ч при 55оС. Олигонуклеотиды, содержащие одну или несколько Tmg-групп, связываются с комплементарными последовательностями ДНК и РНК со сродством, лишь незначительно отличающимся от сродства природных олигодезоксирибонуклеотидов, несмотря на пространственно-затрудненный характер Tmg-группы. Полученные результаты, по нашему мнению, свидетельствуют о возможности использования нового класса фосфорилгуанидиновых аналогов нуклеиновых кислот для создания новых биологически активных производных олигонуклеотидов. •
Авторы выражают благодарность М. Касакину за помощь в регистрации масс-спектров и А. Ломзову за проведение экспериментов по термической денатурации.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Правительства Российской Федерации для научных проектов, выполненных под руководством ведущих мировых ученых (соглашение № 14.В25.31.0028 с С. Альтманом как ведущим ученым), и гранта РФФИ № 13-04-01176.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Therapeutic Oligonucleotides: Methods and Protocols. Methods Mol. Biol. / Ed. Goodchild J. N.Y.: Humana Press, 2011.
V. 764. 340 p.
2. Bell N.M., Micklefield J. // ChemBioChem. 2009. V. 10. № 17. P. 2691-2703.
3. Egholm M., Buchardt O., Nielsen P.E., Berg R.H. // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. № 5. P. 1895-1897.
4. Summerton J., Weller D. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. № 3. P. 187-195.
5. Nielsen P.E. // Mol. Biotechnol. 2004. V. 26. № 3. P. 233-248.
6. Karkare S., Bhatnagar D. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 71. № 5. P. 575-586.
7. Jäger A., Levy M.J., Hecht S.M. // Biochemistry. 1988. V. 27. № 19. P. 7237-7246.
8. Стеценко Д.А., Купрюшкин М.С., Пышный Д.В. Заявка на WO патент PCT/RU2014/000647, приоритет от 22.08.2014.
