CC BY
73
Т. М. Свиткина1, Е. А. Буланова2, О. Ю. Чага1, Д. М. Виджневич1,
Ш.-И. Койма', Г. Г. Борисы'
ФОРМИРОВАНИЕ ФИЛОПОДИЙ ПОСРЕДСТВОМ РЕОРГАНИЗАЦИИ
ДЕНДРИТНОЙ СЕТИ
1 Университет Норд-Вестерн, Чикаго, США 2НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Филоподии ползающих клеток содержат внутри пучок акгиновых филаментов, полимеризация которых обеспечивает продвижение мембраны вперед. Механизм возникновения новых фи-лоподий до сих пор неясен. Мы провели коррелятивный кинетический и структурный анализ инициации филоподий в клетках мышиной меланомы B16F1 посредством цифровой цейтрафер-ной микроскопии живых клеток, экспрессирующих меченные GFP белки, и электронной микроскопии платиновых реплик цитоскелета. Мы показали, что филоподии возникали не из какого-либо нуклеирующего центра, а путем реорганизации ветвящейся сети актиновых филаментов, составляющей основу ламеллоподий. Механизм реорганизации можно сравнить со слиянием зрелых филоподий, но происходящим на уровне отдельных филаментов. А именно, часть независимо нуклеированных ламеллоподиальных филаментов приобретала способность к продолжительному росту. В процессе удлинения эти филаменты сталкивались и склеивались плюс-конца-ми, образуя внутри ламеллоподий конусообразные уплотнения, которые мы назвали Л-предшественниками. Постепенное слияние равномерной флюоресценции GFP-VASP на ведущем крае в отдельные точки, соответствующие вершинам Л-предшественников, являлось ранним маркером возникновения филоподий. Напротив, повышенной концентрации комплекса Агр2/3 в возникающих филоподиях не наблюдалось. Актин-связывающий белок фасцин появлялся в вершинах уже сформированных Л-предшественников, что запускало сшивание филаментов в пучок и завершало формирование филоподии. Мы предлагаем модель возникновения филоподий, согласно которой некоторые филаменты внутри ламеллоподиальной сети приобретают особый статус, связывая на плюс-концах набор молекул (включая VASP), защищающих их от кэппирования и обеспечивающих взаимодействие плюс-концов друг с другом.
Ключевые слова: актин, Агр2/3 комплекс, VASP, фасцин, филоподии.
A filopodium protrudes by elongation of bundled actin filaments in its core. However, the mechanism of filopodia initiation remains unknown. Using live cell imaging with GFP-tagged proteins and correlative electron microscopy, we performed a kinetic-structural analysis of fflopodial initiation in B16F1 melanoma cells. Filopodial bundles arose not by a specific nucleation event, but by reorganization of the lamellipodial dendritic network analogous to fusion of established filopodia but occurring at the level of individual filaments. Subsets of independently nucleated lamellipodial filaments elongated and gradually associated with each other at their barbed ends, leading to formation of cone-shaped structures that we termed Л-precursors. An early marker of initiation was the gradual coalescence of GFP-VASP fluorescence at the leading edge into discrete foci. The GFP-VASP foci were associated with Л-precursors, whereas Arp2/3 was not. Subsequent recruitment of fascin to the clustered barbed ends of Л-precursors initiated filament bundling and completed formation of the nascent filopodium. We propose a convergent elongation model of filopodia initiation, stipulating that filaments within the lamellipodial dendritic network acquire privileged status by binding a set of molecules (including VASP) to their barbed ends, which protect them from capping and mediate association of barbed ends with each other.
Key words: actin, Arp2/3, VASP, fascin, filopodia.
© Свиткина Т. М., Буланова E. А., Чага О. Ю., Виджневич Д. М., Койма Ш.-И., Бориси Г. Г., 2003 УДК 576.3/.7
Движение клетки по субстрату происходит посредством образования псевдоподий на ведущем крае клетки, координированного с последующим подтягиванием тела клетки. Движущей силой для продвижения ведущего края вперед является полимеризация актина в ламеллоподиях и филоподи-ях — двух типах псевдоподий, резко различающихся по структуре, динамике и способу регуляции [12; 41]. В широких и плоских ламеллоподиях актиновые филаменты образуют ветвящуюся сеть [40; 42]. Современные модели описывают динамику актина в ламеллоподиях как повторяющиеся циклы дендритной нуклеации, элонгации, кэппирования и деполимеризации актиновых филаментов, приводящие к тредмиллингу всей сети [6; 31]. Белковый комплекс Агр2/3, который активируется белками семейства WASP [14], нукле-ирует новый филамент в виде веточки на предсуществующем филаменте. Новый филамент растет и толкает мембрану. Когда длина филамента превышает некую эффективную для толкания длину, его рост блокируется каптирующим белком [8], но ему на смену приходят новые филаменты, нуклеиро-ванные комплексом Агр2/3, что приводит к созданию ветвящейся системы сравнительно коротких филаментов. Деполимеризация осуществляется белками семейства ADF/кофилин [2]. Дополнительные белки играют вспомогательную роль в тредмиллинге дендритной сети; профилин обеспечивает рост актинового филамента специфически на плюс-конце [7], белки семейства Ena/VASP защищают растущие плюс-концы от кэппирования [4], кортактин стабилизирует точки ветвления [44], а филамин А [ 11 ] и а-акгинин стабилизируют и объединяют сеть в единое целое.
В нитевидных псевдоподиях — филоподиях — длинные одинаково ориентированные актиновые филаменты образуют плотные параллельные пучки [24; 37; 38]. Предполагается,
что динамика актина в филоподиях осуществляется посредством тредмиллинга индивидуальных актиновых филаментов — механизма, первоначально предложенного для объяснения движения как ламеллоподий, так и филоподий [36]. Согласно этому механизму, все актиновые филаменты в пучке тредмиллируют, т. е. удлиняются на плюс-конце и разбираются на минус-конце. Имеющиеся экспериментальные данные подтверждают эту модель. Наличие длинных невет-вящихся филаментов в филоподиях [40] предполагает, что сборка актина происходит за счет поддержания старых, а не нуклеации новых актиновых филаментов. В соответствии с идеей тредмиллинга, флюоресцентно меченные субъединицы актина включаются в полимер на кончиках филоподий, движутся назад с обратным током и исчезают ближе к телу клетки [26]. Обмен субъединиц в филоподиях идет медленно, что коррелирует с представлением о длинных тредмилли-рующих филаментах.
Набор молекул, необходимый для образования филоподий, точно не установлен. Однако белки, сконцентрированные в филоподиях, могут играть важную роль в их формировании. Один из них — это актин-связывающий белок фасцин, сшивающий филаменты в пучок [3; 22]. Несколько белков, например Епа/УАБР [23; 35], М^УУАБР и СШ6 [15], миозин X [5], талин [9], синдапин I [32] и Уау [20], локализуются на кончиках филоподий. Функции этих белков неизвестны, за исключением белков семейства Епа/УАБР. Недавно было показано, что в ламеллоподиях белки Епа/УАБР взаимодействуют с плюс-концами актиновых филаментов и защищают их от кэппирования, что приводит к появлению популяции длинных филаментов в ламеллоподиальной сети [4]. Можно предположить, что и в филоподиях Епа/УАЗР белки способствуют непрерывному удлинению филаментов пучка.
Рисунок 1. Особенности динамики филоподий.
Временные последовательности, полученные с помощью цифровой флюоресцентной микроскопии ведущего края клеток В16Р1, экспрессирующих вРР-актин. Время указано в секундах. А. — Переходы между различными типами периферических актиновых пучков. Микроспайк, расположенный внутри ламеллоподии (0—20 с), переходит в филоподию (20—60 с), которая превращается затем в фибриллу ретракции (60—140 с). При этом актиновый пучок постоянно растет, а переходы зависят от поведения прилегающей ламеллоподии, которая сначала движется вместе с пучком (0—20 с), затем останавливается (20—60 с) и втягивается (60—140 с). Б. — Слияние филоподий. Три зрелые филоподии (0 с, большие стрелки) постепенно сливаются друг с другом (0—60 с), а затем и с вновь образованными филоподиями (маленькие стрелки, 20—80 с) с образованием одного пучка (100 с). Масштаб 2 мкм.
Рисунок 2. Филаменты филоподиального пучка, происходящие из окружающей дендритной сети.
Электронная микроскопия платиновых реплик цитоскелета. А, Б. — Структурную основу филоподий составляют плотные ак-тиновые пучки, распадающиеся в основании на более мелкие пучки (Б) или отдельные филаменты. Такая структура предполагает, что пучок возник посредством конвергенции филаментов дендритной сети. По сравнению с короткими филаментами дендритной сети (А, вставка) филаменты в основаниях филоподий намного длиннее. В. — Большое увеличение отмеченного рамкой фрагмента Б, иллюстрирует многочисленные точки ветвления (кружки), дающие начало филоподиальным фила-ментам. Масштаб 0,2 мкм.
Главный пробел в понимании филоподиального движения — механизм возникновения новых филоподий. Гипотеза тредмиллинга описывает поведение уже сформированного пучка, но не объясняет его происхождение. Известно, что малая ГТФаза Сйс42 индуцирует филоподии в клетке [19; 30]. Один из ее эффекторов — 1М-\УА8Р, является широко распространенным активатором комплекса Агр2/3 [33; 34], который существенно усиливает вызванную Сс1с42 индукцию филоподий [28], что указывает на участие комплекса Агр2/3 в формировании филоподий. Поскольку Агр2/3 отсутствует в зрелых филоподиях [40], мы предположили, что он может играть роль при их инициации. Например, Агр2/3 может формировать нуклеирующий центр, который инициирует пучок и немедленно диссоциирует. Другая возможность заключается в том, что обычная ламеллоподиальная сеть, образованная с помощью Агр2/3, реорганизуется в параллельные пучки актиновых филаментов.
Мы провели кинетический и структурный анализ возникновения филоподий в клетках мышиной меланомы В16Р1 и
показали, что филоподиальные пучки актиновых филаментов образуются путем реорганизации дендритной сети ламелло-подий. Процесс реорганизации включал в себя формирование субпопуляции ламеллоподиальных филаментов, приобретающих способность к непрерывной элонгации и постепенно сливающихся в единый пучок.
ОСОБЕННОСТИ ДИНАМИКИ ФИЛОПОДИЙ Филоподии, микроспайки и фибриллы ретракции
Помимо филоподий параллельный пучок актиновых филаментов составляет структурную основу еще двух органелл на. ведущем крае: микроспайков и фибрилл ретракции [24;
37; 42]. Микроспайки — это параллельные актиновые пучки внутри ламеллоподий, а фибриллы ретракции — это нити, остающиеся на субстрате после поджатия клетки. Прежде ■ чем перейти к анализу возникновения новых филоподий, нам необходимо было выяснить взаимосвязь между этими тремя структурами. Наблюдая движение ведущего края клеток В16Р1, экспрессирующих ОРР-актин, мы обнаружили, что микроспайки, филоподии и фибриллы ретракции часто переходили друг в друга в процессе движения (рис. 1,А). Это наблюдение позволило нам заключить, что все три органел- 1 лы являются родственными структурами, поэтому в последующем изложении мы будем использовать термин «филопо- | дии» для обозначения любой из них.
Слияние филоподий
Известно, что в процессе роста филоподии часто сталкиваются, сливаются друг с другом и продолжают расти как единая структура [18; 38]. В нашей экспериментальной системе мы наблюдали аналогичное поведение филоподий (рис. 1,Б). Как будет видно из дальнейшего, это свойство филоподий оказалось очень важным для понимания механизма их возникновения.
ФИЛОПОДИИ ВОЗНИКАЮТ ПУТЕМ РЕОРГАНИЗАЦИИ ЛАМЕЛЛОПОДИАЛЬНОЙ СЕТИ
В первую очередь мы попытались определить, возникают ли филоподии из специального центра нуклеации или посредством реорганизации дендритной сети. Для этого мы использовали несколько разных подходов.
Структура филоподий
Тредмиллинг актиновых филаментов, составляющий основу динамики филоподий, имеет важное следствие: история возникновения филоподии оказывается «записанной» в ее структуре, т. е., изучая форму филоподии от основания до кончика, мы как бы путешествуем назад во времени. Мы воспользовались этой особенностью и исследовали ультраструк-туру филоподий с помощью электронной микроскопии платиновых реплик цитоскелета (рис. 2). Если бы филоподии возникали из центра нуклеации, то корешок филоподии резко отличался бы от окружающей сети. В действительности оказалось, что индивидуальные филаменты в основании филоподий расходились из пучка в разные стороны и уходили в прилегающую сеть, образуя плавный переход между сетью и пучком (рис. 2, А, Б). Если перевести подобную структурную организацию во временную последовательность, то можно
/,-ИГ/ Г-Д / 1—' * % . 4" ^ ж 8 , , ж 12
Ш Актин. 1 , 11 „ тл * и' 1 * ^ ■ * т УАЭР | Актин рв __ Фасцин
Рисунок 3. Кинетика и локализация структурных белков в ходе инициации филоподий.
Временные последовательности ведущего края клеток В16Р1, экспрессирующих ОРР-АгрЗ (А), СРР-актин (Б), ЭРР-УАЗР (В), СРР-фас-цин (Г). А. — Возникновение новой филоподии не сопровождается появлением фокуса повышенной концентрации комплекса Агр2/3. Фазово-контрастные снимки (0,160 с), сделанные в начале и в конце наблюдения, иллюстрируют образование новой филоподии (наконечник) в дополнение к предсуществовавшей (стрелка). Б. — Новые филоподии возникают из конусообразных уплотнений ламеллопо-диального актина (Л-предшествеников). Два Л-предшественика (0 с) сливаются друг с другом, рождая филоподию (20 с) с Л-образным основанием. Место слияния перемещается вглубь клетки с обратным током актина по мере удлинения рожденной филоподии. В.— В процессе образования новой филоподии СРР-УАЭР, исходно равномерно распределенный вдоль ведущего края, постепенно конденсируется в яркую точку. Скобки отмечают участки ведущего края с увеличивающейся интенсивностью флюоресценции. Г. — СРР-фас-цин появляется в зарождающейся филоподии в виде точки (0 с, стрелка), которая затем постепенно удлиняется (4—12 с, стрелка) по мере созревания филоподии. Вставка (0 с) демонстрирует, что усиление контраста снимка позволяет видеть локализацию начальной точки вРР-фасцина на вершине слабо различимого Л-предшественника. Д, Е. — Распределение актина по отношению к другим фило-подиальным белкам. Клетки В16Р1, экспрессирующие ОРР-МАЭР или ОРР-фасцин (Е), докрашены меченым фаллоидином, чтобы выявить актин, Л-предшественники указаны стрелками. Яркие УАвР-содержащие точки соответствуют вершинам зрелых филоподий и Л-предшественников (широкие стрелки). Более слабые \/А5Р-содержащие точки (узкие стрелки) не связаны с явно различимыми Л-предшественниками (Д). Зрелые филоподии обогащены фасцином. Некоторые Л-предшественники (широкие стрелки) содержат фасцин в области верхушки, в то же время в других фасцин отсутствует (узкие стрелки) (Е). Масштаб 2 мкм.
заключить, что филоподиальные пучки образовались путем слияния индивидуальных филаментов, приходящих из окружающей сети. Мы обнаружили множество примеров, когда какой-нибудь филамент начинался как боковая веточка на другом филаменте и впоследствии входил в состав филопо-диального пучка (рис. 2,В). Таким образом, структурные данные говорят в пользу утверждения, что филоподиальные пучки возникают путем реорганизации дендритной сети.
Динамика комплекса Агр2/3
Идея нуклеирующего центра предполагает, что в момент возникновения филоподии в ее основании должна существовать повышенная концентрация комплекса Агр2/3 и/или актина. Мы проверили это предположение, исследуя динамику возникновения филоподий в клетках, экспрессирующих ОРР-АгрЗ (рис. 3,А). Однако все наши попытки найти Агр2/3-содержащие фокусы, продуцирующие филоподии, приводили к негативному результату. Эти данные не коррелируют с идеей нуклеирующего центра для образования филоподий.
Динамика актина
Исследование динамики ОБР-актина в процессе возникновения филоподий также показало, что филоподии возникали не из четких фокусов, а постепенно конденсировались из ламеллоподиальной сети (рис. 3,Б). Первым признаком зарождающейся филоподии являлось образование внутри ламеллоподии конусовидного участка с повышенной плотностью актина (рис. 3,Б, Д, Е). Эти участки, которые мы назвали Л-предшественниками из-за их характерной формы, далее развивались в зрелые пучки (рис. 3,Б).
Таким образом, представленные результаты не поддерживают гипотезу о нуклеации филоподий в специальном центре, но согласуются с идеей о реорганизации ламеллоподиальной сети в филоподиальный пучок.
МЕХАНИЗМ РЕОРГАНИЗАЦИИ СЕТИ В ПУЧКИ Структура Л-предшественников
Установив, что филоподии возникают посредством реорганизации ламеллоподиальной сети, мы поставили себе цель —
Рисунок 4. Структура Л-предшественников.
Коррелятивная электронная микроскопия. По сравнению с прилегающей ламеллоподией Л-предшественники обогащены длинными филаментами. Верхний ряд: распределение актина, выявленное с помощью окраски меченым фаллоидином (актин), флюоресценция ОРР-фасцина (фасцин) и электронная микроскопия одного и того же участка клетки В16Р1. Участки, выделенные рамками на электронной микрофотографии, увеличены на нижней части монтажа и обозначены соответствующими буквами. Точками на панели «актин» отмечены Л-предше-ственники, звездочкой — зрелая филоподия. Маркированные треугольниками линии отмечают места на электронных микрофотографиях, соответствующие участкам повышенной плотности актина на флюоресцентных изображениях — филоподиям и предполагаемым Л-предшественникам. Маркированная звездочками линия отмечает участок зрелой филоподии, соответствующий району повышенной флюоресценции фасцина. Для этого участка характерны плотно сшитые актиновые филамен-ты. Масштаб 0,2 мкм.
определить механизм подобной реорганизации. Для этого прежде всего было необходимо исследовать ультраструктуру Л-предшественников на уровне индивидуальных филаментов с помощью электронной микроскопии. Однако однозначно идентифицировать Л-предшественники на электронно-мик-роскопических препаратах не представлялось возможным, поэтому мы осуществили коррелятивную электронную микроскопию [39]. Для этого клетки выращивались на специальных стеклах с маркировкой, чтобы после светомикроскопического анализа и последующей подготовки препарата для электронной микроскопии можно было найти ту же клетку и провести ее ультраструктурный анализ. Световая микроскопия актиновой флюоресценции позволяла нам найти Л-пред-шественник, а электронная микроскопия давала возможность изучить его структуру. Оказалось, что Л-предшественники содержали значительное количество сравнительно длинных филаментов, сходящихся к вершине Л-предшественника, тогда как окружающая ламеллоподиальная сеть состояла из сравнительно коротких ветвящихся филаментов (рис. 4,А,В).
Поскольку длинные филаменты характерны именно для филоподий, мы можем предположить, что в процессе зарождения филоподий происходит образование длинных филаментов, которые постепенно накапливаются в Л-пред-шественниках, а потом сливаются в пучок. Мы проверили это предположение, проведя коррелятивную электронную
микроскопию на клетках, история которых была записана непосредственно перед фиксацией. Анализ этой информации показал, что веерообразные основания новорожденных филоподий являются бывшими Л-предшественниками, а длинные филаменты в их составе постепенно сходятся к вершине, где они сливаются в пучок
Учитывая характерную черту зрелых филоподий — способность к слиянию (рис. 1,Б), можно представить себе, что Л-предшественники образуются в результате подобного же слияния, происходящего на уровне отдельных филаментов и мелких пучков. Это означает, что роль комплекса Агр2/3 в инициации филоподий, по-видимому, заключается в том, что, нуклеируя актиновые филаменты, он обеспечивает наличие строительного материала для последующей реорганизации дендритной сети в пучок. Однако должны существовать дополнительные механизмы, ответственные за образование длинных филаментов, их накапливание и сшивание в пучки.
Механизм возникновения длинных филаментов
Филаменты в составе филоподиального пучка растут непрерывно, достигая значительной длины в несколько микрон, в то время как ламеллоподиальные филаменты кэпиру-ются после короткого периода роста и, как следствие, являются довольно короткими (около 100 нм). Высокая концентрация кэпирующих белков в цитоплазме неблагоприятна для образования длинных филаментов [16]. Следовательно, для возникновения и поддержания длинных филаментов необходим механизм защиты плюс-концов от кэппирова-ния. Идея, что эту защитную роль играют белки семейства Ena/VASP, показалась нам крайне привлекательной, поскольку эти белки локализованы на кончиках филоподий [23; 35] и ингибируют кэппирование in vitro, а их удаление с клеточной мембраны или накопление на мембране ведет к образованию коротких или длинных филаментов соответственно [4].
Используя GFP-VASP в качестве маркера защищенных от кэппирования плюс-концов, мы выяснили динамику постоянно растущих филаментов в ходе возникновения филоподий. Результаты этих исследований показали, что однородно интенсивная вначале линия флюоресценции GFP-VASP на ведущем крае ламеллоподии постепенно конденсируется (рис. 3,В) с образованием зон яркой флюоресценции, впоследствии сокращающихся до отдельных точек повышенной яркости. Если экспрессирующие GFP-VASP клетки докрасить меченым фаллоидином, то оказывается, что яркие точки соответствуют вершинам Л-предшественников и/или зрелых филоподий (рис. 3,Д). Исходя из предположения, что кинетика GFP-VASP отражает поведение популяции постоянно растущих плюс-концов филаментов, конденсация GFP-VASP в вершинах Л-предшественников и филоподий означает постепенное накопление длинных филаментов в этих структурах, что полностью коррелирует с нашими электронно-микроскопическими данными.
Таким образом, белки семейства Ena/VASP могут участвовать в индукции филоподий путем создания популяции защищенных филаментов, сохраняющих способность к непрерывному росту. В пользу участия Ena/VASP
Рисунок 5. Концевой комплекс филоподии.
А. — Дистальные концы филоподий ассоциированы со скоплением гранулярного материала — концевым комплексом. Электронная микроскопия платиновых реплик цитоскелета. Слева — малое увеличение, справа — большое увеличение тех же комплексов. Б, В. — Концевой комплекс филоподий связывает плюс-концы филоподиальных филаментов. Длительная инкубация экстрагированных клеток в цитоскелетном буфере приводит к полной диссоциации фасцина (вверху), но не \/АБР (внизу). Фазово-контрастные и флюоресцентные снимки клеток, временно экспрессирующих указанные белки, получали сразу после экстракции (до инкубации, фазово-контрастные снимки не приведены) и после инкубации в течение 12 ч в фаллоидин-содержащем буфере (после инкубации). Условия съемки идентичны для каждой пары флюоресцентных снимков. Электронная микроскопия фило-подиального пучка после инкубации в буфере (В). Индивидуальные филаменты пучка отходят друг от друга, что коррелирует с потерей фасцина, тогда как концевой комплекс филоподии остается связанным с пучком и удерживает плюс-концы филаметнов вместе. Г. — Взаимодействия между плюс-концами филаментов (стрелки) видны также на самом краю ламеллолодии как сразу после экстракции (до инкубации), так и после инкубации в буфере (после инкубации). Масштаб 0,1 мкм (А, В, Г) и 2 мкм (Б).
в процессе формирования филоподий свидетельствуют также данные, полученные в других лабораториях. Например, гомолог УА8Р в Ою1уоз1е1шт (Ос1УА8Р) необходим для формирования филоподий [13], а индукция филоподий белком 1КБр53 в клетках млекопитающих происходит при участии Мепа — одного из членов семейства Епа/УА8Р [21].
Взаимодействие плюс-концов филоподиальных филаментов
Одной способности будущих филоподиальных филаментов к непрерывному росту недостаточно для формирования филоподий. Чтобы накапливаться в Л-предшественниках, они должны обладать способностью к взаимодействию друг к другом, предпочтительно на уровне плюс-концов.
Мы провели детальное электронно-микроскопическое исследование филоподий и показали, что дистальный конец фило-подиального пучка обычно ассоциирован с особой структурой, представляющей собой скопление гранулярного материала (рис. 5,А). Мы назвали эту структуру «концевой комплекс филоподий». Состав этого комплекса окончательно не ясен; однако несколько известных белков, специфически локализованных на кончиках филоподий, включая Епа/УАЗР, с большой вероятностью являются его компонентами [5; 9; 15; 20; 23; 32; 35].
Чтобы понять функциональную роль концевого комплекса, мы инкубировали экстрагированные детергентом клетки в буфере, стабилизирующем цитоскелет, а затем анализировали белковый состав и структуру филоподий. Длительная инкубация удаляла из филоподий фасцин, тогда как УАЗР полностью сохранялся (рис. 5,Б). Электронно-микроскопический анализ филоподий после такой обработки показал, что индивидуальные филаменты в филоподиальных пучках отходили друг от друга и пучки сильно разрыхлялись, что вызвано, вероятно, диссоциацией фасцина. Между тем плюс-концы филаментов, напротив, удерживались вместе, по-видимому, благодаря сохранившемуся концевому комплексу (рис. 5,В). Мы заключили, что концевой комплекс филоподий осуществляет структурное взаимодействие между плюс-концами филаментов и что это взаимодействие является фасцин-независимым.
Пытаясь проследить, каким образом и когда возникает концевой комплекс, мы исследовали самый край ламеллоподий и обнаружили случаи взаимодействия между плюс-концами ламеллоподиальных филаментов (рис. 5,Г), когда во взаимодействие было вовлечено от двух до нескольких филаментов. Точки взаимодействия были стабильны, сохранялись после длительной инкубации (12 ч) и были нередко ассоциированы с дополнительным материалом (рис. 5,Г), вероятно, аналогичным концевому комплексу филоподий. По-видимому, именно взаимодействие между плюс-концами филаментов обуславливает характерную А-образную конфигурацию актинового цитоскелета на разных этапах возникновения филоподий: от взаимодействия отдельных филаментов до А-предшественников до сливающихся зрелых филоподий.
Какие именно молекулы в составе концевого комплекса филоподий осуществляют взаимодействие между плюс-концами филаментов, пока не установлено. Возможно, белки семейства Епа/УАБР, защищая плюс-концы от кэппирования,
f Актиновый филамент , ч Концевой
комплекс
V Агр2/3-комплекс > Фасцин
(р* Кэппирующий белок Мембрана
Дендритная сеть
Новорожденная
филоподия
Рисунок 6. Модель конвергирующей элонгации для формирования филоподий.
А. — Комплекс Агр2/3 нуклеирует актиновые филаметны с образованием дендритной сети в ламеллоподиях. Рост многих филаментов сети быстро блокируется кэппирующими белками, но часть филаментов приобретает исключительный статус, связывая комплекс белков на плюс-концах, позволяющий им расти непрерывно. Белки семейства Епа/Л/АБР, защищающие плюс-концы от кэппирования, с большой вероятностью входят в состав этого комплекса. Б. — Защищенные плюс-концы удлиняются и случайным образом сталкиваются друг с другом. Ассоциированные с плюс-концами белковые комплексы обеспечивают взаимодействие защищенных филаментов после столкновения. В. — Филаменты с соединенными плюс-концами продолжают расти вместе. Другие плюс-концы наталкиваются и присоединяются позднее к этой структуре, что ведет к постепенной агрегации плюс-концов и соответствующих белковых комплексов. Эта стадия приблизительно соответствует образованию Л-предшественников. Г. — Концевой комплекс будущей филоподии запускает сшивку филаментов в пучок, рекрутируя или активируя фасцин, позволяя пучкованию не отставать от полимеризации актина и обеспечивая тем самым эффективное продвижение мембраны. Д. — В родившейся филоподии концевой комплекс продолжает обеспечивать согласованные удлинение и сшивку филаментов, а также слияние с другими филоподиями.
одновременно «склеивают» филаменты, т. к. они обладают способностью к олигомеризации [1]. Ранее было показано, что домен, ответственный за олигомеризацию Mena, необходим для нормальной миграции клетки [25]. Также возможно, что другие, еще не идентифицированные белки, осуществляют взаимодействие между плюс-концами филаментов в фи-лоподиях.
Таким образом, можно заключить, что плюс-концы фило-подиальных и/или будущих филоподиальных филаментов, по-видимому, сочетают в себе два свойства: непрерывный рост и способность к взаимодействию, что позволяет им постепенно накапливаться в Л-предшественниках. Этот процесс можно представить себе следующим образом. В среднем, ламеллоподиальные филаменты ориентированы под углом 35° по отношению к ведущему краю [27]. В процессе роста плюс-концы диагонально ориентированных филаментов мигрируют вдоль ведущего края, сталкиваются, склеиваются и продолжают расти вместе. Повторяющиеся столкновения плюс-концов приводят к накоплению постоянно растущих, а следовательно, относительно длинных филаментов в отдельных участках (Л-предшественниках). При этом белковые комплексы на концах индивидуальных филаментов сливаются, образуя концевой комплекс будущей филоподии
Формирование филоподиального актинового пучка
Отдельные длинные филаменты, даже собранные в одном месте, не обладают достаточной жесткостью для эффективного толчка: они будут скорее гнуться, чем толкать вперед мембрану клетки. Иммобилизация филаментов посредством поперечных сшивок представляется эффективным решением
проблемы [29]. По последним данным, фасцин является основным белком, сшивающим филаменты в филоподиях [3; 22].
Мы исследовали динамику ОБР-фасцина в ходе возникновения филоподий, чтобы определить роль этого белка в формировании и функционировании пучка. В зрелых филоподиях фасциновая флюоресценция выглядела как яркая палочка на фоне довольно темной ламеллоподии. Новые филоподии в большинстве случаев возникали как яркая точка на ведущем крае клетки, которая затем начинала удлиняться (рис. 3,Г). Докраска клеток меченым фаллоидином для выявления актина показала, что начальные точки ОРР-фасцина соответствовали вершинам Л-предшественников, а основания Л-предшественников не содержали фасцина (рис. 3,Е и 4). Более того, в составе ламеллоподий можно было наблюдать Л-предшест-венники, совсем не содержащие фасцина (рис. 3,Е и 4,А,В).
Таким образом, фасцин участвует в возникновении филоподий на сравнительно поздних стадиях, присоединяясь к верхушкам уже готовых Л-предшественников. Впоследствии фасцин включается в растущий пучок параллельно со сборкой актина. Такая динамика фасцина представляется весьма осмысленной. Действительно, филоподии могут эффективно толкать мембрану, только если сшивка растущих филаментов будет происходить параллельно с полимеризацией актина и свободный участок филамента останется коротким. На электронно-микроскопическом уровне насыщенность филоподий или Л-предшественников фасцином коррелировала с плотной упаковкой филаментов в пучках (рис. 4,Б). Мы предполагаем, что на определенном этапе формирования Л-предшественника концевой филоподи-альный комплекс на его вершине приобретает способность
рекрутировать или активировать фасдин, после чего фасцин начинает сшивать длинные филаменты, накопленные в Л-предшественниках, придавая им достаточную жесткость для эффективного толчка и завершая таким образом процесс формирования филоподиального пучка.
МОДЕЛЬ КОНВЕРГИРУЮЩЕЙ ЭЛОНГАЦИИ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ ФИЛОПОДИЙ
Итак, на основе наших экспериментальных данных мы предлагаем модель конвергирующей элонгации для формирования филоподий, предполагающую постоянное удлинение и постепенное слияние актиновых филаментов (рис. 6). По нашей модели филоподии образуются за счет реорганизации ламеллоподиальной дендритной сети, нуклеированной комплексом Агр2/3. Главный постулат модели состоит в том, что некая субпопуляция филаментов ламеллоподиальной сети приобретает особый статус посредством связывания комплекса.белков на плюс-концах. Этот комплекс защищает плюс-концы от кэппирования и позволяет им взаимодействовать после столкновения. Весьма вероятно, что белки семейства Епа/УАБР в составе концевого комплекса защищают плюс-концы от кэппирования, хотя участие других белков тоже возможно. Белок, обеспечивающий взаимодействие плюс-концов друг с другом, еще не установлен. Ассоциированные с филоподиальным комплексом филаменты растут, многократно сталкиваются и ассоциируют друг с другом, что ведет к постепенной агрегации плюс-концов и соответствующих белковых комплексов и образованию концевого комплекса будущей филоподии. Поскольку филаменты, соединяющиеся своими плюс-концами в одной точке, происходят из разных частей ламеллоподиальной сети, то этот процесс приводит к формированию промежуточных структур — Л-предшественников с характерной конусообразной формой. Концевой комплекс филоподии запускает сшивание филаментов в пучок, рекрутируя и/или активируя фасцин, что позволяет пучкованию не отставать от процесса полимеризации актина и обеспечивать эффективное продвижение мембраны вперед. Сформированная филоподия переходит в равновесное состояние тредмиллинга, при котором она собирается спереди на плюс-конце и разбирается сзади на минус-конце. Концевой комплекс филоподии остается связанным с растущим пучком, позволяя филаментам филоподии расти и сливаться с другими пучками.
Поскольку филоподиальные пучки возникают из ламеллоподиальной сети, они естественно появляются на свет в виде микроспайков. Исчезновение пучков происходит в ходе образования раффлов или путем превращения в фибриллы ретракции при изменении направления движения клетки. В промежуточном состоянии, если микроспайк начинает расти быстрее прилегающей ламеллоподии, он может превратиться в филоподию. Дополнительное подтверждение взаимосвязи этих структур получено И.. Когша и соавт., показавшими, что Сс1с42 вызывает поджатие клетки и образование фибрилл ретракции наравне с индукцией собственно филоподий [19]. Следовательно, три типа периферических актиновых пучков: микроспайки, собственно филоподии и фибриллы ретракции — могут рассматриваться как промежуточные состояния одной и той же структуры, различающиеся
по их взаимодействию с мембраной и фазе жизненного цикла, хотя некоторые различия в белковом составе и динамике тоже не исключаются.
Описанный нами механизм образования филоподий в клетках удивительным образом схож с механизмом формирования филоподиальных пучков in vitro [43], когда пластиковые шарики, покрытые активаторами Агр2/3-комплекса, в цитоплазматических экстрактах с пониженной концентрацией кэппирующего белка вместо нормальных кометных хвостов индуцировали формирование радиальных пучков актиновых филаментов. Пучки, образованные in vitro, аналогичны филоподиальным, а именно, обладают одинаковой полярностью, удлиняются на плюс-конце, содержат фасцин, не содержат Агр2/3-комплекс, кэппирующий белок, и а-актинин. Актиновые филаменты этих пучков происходили из ветвящейся сети, образованной вокруг шарика. Понижение активности кэппирующего белка в экстракте позволяло филаментам расти, а фасцин затем связывал их в пучки.
Плотный пучок параллельных актиновых филаментов, характерный для филоподий, образует структурную основу ряда других органелл в различных тканях и организмах [3; 10]. Наши выводы о том, что филоподии в клетках мышиной меланомы B16F1 в ходе миграции формируются за счет реорганизации ламеллоподиальной сети, позволяют предположить, что другие параллельные пучки могут возникать тем же путем, хотя альтернативные механизмы тоже возможны.
ЛИТЕРА ТУРА
1. Bachmann С., Fischer L., Walter U., Reinhard M. The EVH2 domain of the vasodilator-stimulated phosphoprotein mediates tetramerization, F-actin binding, and actin bundle formation // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. - P. 23 549-23 557.
2. Bamburg J. R. Proteins of the ADF/cofilin family: essential regulators of actin dynamics//Annu. Rev. Cell Dev. Biol. — 1999. — Vol. 15. —
P. 185-230.
3. Bartles J. R. Parallel actin bundles and their multiple actin-bundling proteins // Curr. Opin. Cell Biol. — 2000. — Vol. 12. — P. 72—78.
4. BearJ. E., Svitkina Т. M., Krause М., Schafer D. A., Loureiro J. J., Strasser G. A., Maly I. V, Chaga O. Y, Cooper J. A., Borisy G. (?. , GertlerF. B. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility// Cell. — 2002. — \bl. 109. —
P. 509-521.
5. BergJ. S., Cheney R. E. Myosin-X is an unconventional myosin that undergoes intrafilopodial motility I j Nat. Cell Biol. — 2002. — Vol. 4. — P. 246-250.
6. Borisy G. G., Svitkina Т. M. Actin machinery: pushing the envelope // Curr. Opin. Cell Biol. - 2000. - Vol. 12. - P. 104-112.
7. Carlier M. F., Pantaloni D. Control of actin dynamics in cell motility // J. Mol. Biol. - Vol. 269. - P. 459-467.
8. Cooper J-. A., Schafer D. A. Control of actin assembly and disassembly at filament ends // Curr. Opin. Cell Biol. - 2000. - Vol. 2. - P. 97-103.
9. DePasquale J. A., Jzzard C. S. Accumulation of talin in nodes at the edge of the lamellipodium and separate incorporation into adhesion plaques at focal contacts in fibroblasts // J. Cell Biol. — 1991. —
Vol. 113.-P. 1351-1359.
10. DeRosier D. J., Tilney L. G. F-actin bundles are derivatives of microvilli: What does this tell us about how bundles might form //
J. Cell Biol. - 2000. - Vol. 148. - P. 1-6.
11. Flanagan L. A., Chou J., Falet H., Neujahr R., Hartwig J. H., Stossel T. P. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells // J. Cell Biol. — 2001.-Vol. 155.-P. 511-517.
12. Hall A. Rho GTPases and the actin cytoskeleton // Science. —
1998. - Vol. 279. - P. 509-514.
13. Han Y H., ChungC. Y, Wessels D., Stephens S., Titus M. A., Soli D. R., Firtel R. A. Requirement of a vasodilator-stimulated phosphoprotein family member for cell adhesion, the formation of fllopodia, and chemotaxis in Dictyostelium //J. Biol. Chem. — 2002. — Vol. 277. —
P. 49 877-49 887.
14. Higgs H. N., Pollard T. D. Regulation of actinfilament network formation through ARP2/3 complex: activation by a diverse array of proteins 11 Annu. Rev. Biochem. — 2001. — \bl. 70. — P. 649—676.
15 .HoH. Y., Rohatgi R., Ma L., Kirschner M. W. CR16 forms a complex with N-WASP in brain and is a novel member of a conserved proline-rich actin-binding protein family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —
2001. - Vol. 98. - P. 11 306—11 311.
16. Huang M., YangC., Schafer D. A., Cooper J. A., Higgs H. N., ZigmondS.H. Cdc42-induced actin filaments are protected from capping protein // Curr. Biol. - 1999. - Vol. 9. - P. 979-982.
17. Katoh K., HammarK., Smith P. J., OldenbourgR. Arrangement of radi-
al actin bundles in the growth cone of Aplysia bag cell neurons shows the immediate past history of filopodial behavior // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999 - Vol. 96. - P. 7928-7931. ^
18. Katoh K., HammarK., Smith P. J., Oldenbourg R. Birefringence imaging directly reveals architectural dynamics of filamentous actin in living growth cones // Mol. Biol. Cell. - 1999 - Vol. 10. - P. 197-210.
19. Kozma R., Ahmed S., Best A., Lim L. The Ras-related protein Cdc42Hs and bradykinin promote formation of peripheral actin microspikes and fllopodia in Swiss 3T3 fibroblasts // Mol. Cell. Biol. — 1995. — Vol. 15. — P. 1942-1952.
20. Kranewitter W. J., Danninger C., Gimona M. GEF at work: Vav in protruding fllopodia // Cell Motil. Cytoskeleton. — 2001. — Vol. 49. — P. 154-160.
21. Krugmann S., Jordens I., GevaertK., DriessensM., Vandekerckhove J., Hall A. Cdc42 induces fllopodia by promoting the formation of an IRSp53:Mena complex//Curr. Biol. — 2001. — Vol. 11. —P. 1645— 1655.
22. Kureishy N., Sapountzi V., Prag S., Anilkumar N., Adams J. C. Fascins, and their roles in cell structure and function // Bioessays. — 2002. — Vol.24.-P. 350-361.
23. Lanier L. M., Gates M. A., WitkeW., MenziesA. S., WehmanA. M., Macklis J. D., Kwiatkowski D., Soriano P., GertlerF. B. Mena is required for neurulation and commissure formation // Neuron. — 1999. —
Vol. 22. - P. 313-325.
24. Lewis A. K., Bridgman P. C. Nerve growth cone lamellipodia contain two populations of actin filaments that differ in organization and polarity//!. Cell Biol. - 1992. - Vol. 119. - P. 1219-1243.
25. LoureiroJ. J., Rubinson D. A., BearJ. E., BaltusG.A., Kwiatkowski A. V, GertlerF. B. Critical roles of phosphorylation and actin binding motifs, but not the central proline-rich region, for Ena/vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) function during cell migration // Mol. Biol. Cell. - 2002. - Vol. 13. - P. 2533-2546.
26. Mallavarapu A., Mitchison T. Regulated actin cytoskeleton assembly at filopodium tips controls their extension and retraction // J. Cell Biol. —
1999. - Vol. 146. - P. 1097-1106.
27. Maly I. V., Borisy G. G. Self-organization of a propulsive actin network as an evolutionary process // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2001. — Vol. 98.-P. 11 324-11 329.
28. Miki H., Sasaki T., Takai Y., Takenawa T. Induction of filopodium formation by a WASP-related actin-depolymerizing protein N-WASP // Nature. - 1998. - Vol. 391. - P. 93-96.
29. MogilnerA., Oster G. Cell motility driven by actin polymerization // Biophys. J. - 1996. - Vol. 71. - P. 3030-3045.
30. Nobes C. D., Hall A. Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and fllopodia // Cell. — 1995. — Vol. 81. — P. 53—62.
31. Pollard T. D., Blanchoin L., Mullins R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells //Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. — 2000. — Vol. 29. — P. 545—576.
32. Qualmann B., Kelly R. B. Syndapin isoforms participate in receptor-mediated endocytosis and actin organization // J. Cell Biol. — 2000. — Vol. 148. — P. 1047-1062.
33. Rohatgi R., Ma L., Miki H., Lopez M., Kirchhausen T., Takenawa T., Kirschner M. W. The interaction between N-WASP and the Arp2/3 complex links Cdc42-dependent signals to actin assembly // Cell. —
1999. - Vol. 97. - P. 221-231.
34. Rohatgi R., Ho H. Y., Kirschner M. W. Mechanism of N-WASP activation by CDC42 and phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate //
J. Cell Biol. - 2000. - Vol. 150. - P. 1299-1310.
35. Rottner K., Behrendt B., Small J. V., Wehland J. VASP dynamics during lamellipodia protrusion // Nat. Cell Biol. — 1999. — Vol. 1. — P. 321—322.
36. Small J. V. Lamellipodia architecture: actin filament turnover and the lateral flow of actin filaments during motility // Semin. Cell Biol. — 1994.-Vol. 5.-P. 157-163.
37. Small J. V. The actin cytoskeleton // Electron Microsc. Rev. — 1988. — Vol. l.-P. 155-174.
38. Small J. V., Stradal T., Vignal E., Rottner K. The lameilipodium: where motility begins // Trends Cell Biol. — 2002. — Vol. 12. — P. 112—120.
39. Svitkina T. M., Borisy G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells // Methods Enzymol. — 1998. — Vol. 298. - P. 570-592.
40. Svitkina T. M., Borisy G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia // J. Cell Biol. — 1999 — Vol. 145. —
P. 1009-1026.
41. Svitkina T. M., Borisy G. G. Progress in protrusion: the tell-tale scar // Trends Biochem. Sci. - 1999 - Vol. 24. - P. 432-436.
42. Svitkina T. M., Verkhovsky A. B., McQuade K. M., Borisy G. G. Analysis of the actin-myosin II system in fish epidermal keratocytes: mechanism of cell body translocation // J. Cell Biol. — 1997. — Vol. 139. —
P. 397-415.
43. Vignjevic D., YararD., Welch M. D., Peloquin J., Svitkina T., Borisy G. G. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network // J. Cell Biol. - 2003. - Vol. 160. - P. 951-962.
44. Weaver A. M., KarginovA. V., KinleyA. W., WeedS. A., Li Y.,
Parsons J. T., Cooper J. A. Cortactin promotes and stabilizes Arp2/3-induced actin filament network formation // Curr. Biol. — 2001. — Vol. 11.-P. 370-374.
