CC BY
190
Физиолого-биохимические особенности дрожжей Saccharomyces cerevisiae
в зависимости от состава среды культивирования
Э.А. Исламмагомедова, С.Ц. Котенко
Прикаспийский институт биологических ресурсов
Известно, что дрожжи обладают гибким метаболизмом и способны к значительным перестройкам обмена веществ в ответ на изменение состава среды культивирования. Ранее установлено, что геотермальные воды нефенольного класса, обладающие большим химическим потенциалом, могут быть использованы в качестве нового источника питания дрожжевых организмов [1, 2]. Настоящая работа посвящена изучению влияния геотермальной воды в составе питательной среды на биохимические процессы и активность ферментов углеводного и азотистого обмена штамма Saccharomyces cerevisiaе Y-503.
Дрожжи выращивали на лабораторной установке в периодическом режиме глубинным методом по 12-часовой технологической схеме. Содержание сухих веществ в питательных средах 14 %; рН 5,0. Дрожжи выращивали при 30 °С и аэрации 0,25 л/ мин, в качестве пеногасителя использовали структол дозой 0,1 мл на 1,5 л среды. Посевной материал вносили из расчета 1,5 % объема среды. Для культивирования дрожжей использовали питательные среды: для опыта (174,07 г/л мелассы; 2,58 г/л гидроортофосфата аммония; 4,0 г/л геотермальной воды из скважины № 26 Махачкалинского месторождения, разбавленной водопроводной водой до минерализации) и контроля (174,07 г/л мелассы; 1,53 г/л гидроортофосфата аммония; 1,62 г/л хлорида калия; 1,13 г/л гидрооксида аммония; 4,6 г/л сульфата аммония; 0,00005 г/л дестиобиотина; водопроводная вода). Общее содержание фосфора в биомассе дрожжей определяли методом Фиске-Суббероу [3], нуклеиновые кислоты — спектро-фотометрическим методом по Спирину, общее содержание липидов — с применением кислотного гидролиза, фосфо-липиды — экстрагированием липидов и дальнейшим определением фосфора. Определение активности ферментов а-глюкозидазы и р-фруктофуранозидазы проводили поляриметрическим методом, алкогольдегидрогеназы — спектро-
фотометрически, глюкоамилазы — модифицированным глюкозооксидазным методом, активность протеолитических ферментов (суммарное количество) — модифицированным методом Ансона.
Сравнительное изучение содержания суммы нуклеиновых кислот в биомассе исследуемого штамма показало, что в контроле S. cerevisiae Y-503 количество нуклеиновых кислот в 1,06 раза выше по сравнению с опытными данными (табл. 1). Известно, что содержание ДНК изменяется весьма незначительно на протяжении всех фаз роста дрожжевых клеток. Содержание же РНК подвержено сильным количественным изменениям, находящимся в зависимости от биохимического состояния клетки. В лаг-фазе дрожжевые клетки обогащаются РНК, и только при достижении определенного уровня их содержания клетки начинают размножаться. Логарифмическая фаза характеризуется интенсивным размножением и соответ-
Таблица 1
Показатель,0/» на абс. СВ Опыт Контроль
Нуклеиновые кислоты 7,86±0,23 8,32±0,21
Фосфор, Р2О5 1,58±0,0 8 1,30±0,04
Липиды 1,20 ±0,05 1,10±0,04
Фосфолипиды 0,94±0,04 0,86±0,03
Ln N 19:
0'
0 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 t, ч - Опыт — Контроль
Кинетика роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-503
ственно максимальным содержанием РНК. В стационарной фазе с постепенным прекращением процесса размножения дрожжевых клеток количественное содержание в них РНК уменьшается. Кривые роста дрожжей подтверждают раннее наступление стационарной фазы в опытном варианте (см. рисунок).
Общее содержание фосфора в опытном варианте S. cerevisiae Y-503 в 1,22 раза выше по сравнению с контрольным. Повышению содержания фосфора способствует, вероятно, присутствие в геотермальной воде, входящей в состав опытной питательной среды, таких минеральных элементов, как калий и цинк. Так, цинк, входящий в состав многих металлоферментов, играет важную роль в фосфорном обмене дрожжей. Присутствие ионов калия обусловливает перенос фосфатных остатков. Гидролиз АТФ и освобождение фосфатов также требуют присутствия калия. Кроме того, известно, что гумусовые вещества, содержащиеся в геотермальной воде, способствуют более интенсивному поступлению фосфора из питательной среды в клетку [4]. Это происходит, по-видимому, посредством образования фосфатно-гуминовых соединений. Также известно, что благодаря действию гумусовых веществ возрастает количество органического кислоторастворимого фосфора, входящего в состав соединений с макроэргическими связями; увеличивается количество фосфолипидов, которые, являясь компонентами мембран, играют важную роль в регулировании их свойств [5].
Повышенное содержание фосфора в дрожжах S. cerevisiae Y-503, полученных на опытной питательной среде, влияет на интенсификацию различных химических превращений в клетке и, вероятно, используется для регулирования ферментативной активности, а следовательно, процессов брожения и дыхания. В свою очередь, это сказывается на улучшении биотехнологических показателей дрожжей (биомасса, генеративная активность [6]). От условий культивирования дрожжей и свойств различных штаммов во многом зависит количество синтезируемых липидов дрожжевой клетки. В связи с этим изменения в содержании липидов представляют большой интерес для установления закономерностей адаптации дрожжевых организмов к воздействию минеральных и органических компонентов геотермальной воды нефенольного класса в составе среды культивирования. Установлено, что общее содержание липидов в биомассе исследуемого штамма, выращенного на питательной среде с использованием геотермальной воды, в 1,1 раза превышает данный показатель в контроле. Накопление фос-фолипидов, являющихся, как известно,
4•2007
18
17
1б
14
Таблица 2
а-Глюкозидаза, Е/мг ß-Фруктофуранозидаза, Е/мг Алкогольдегидрогеназа, Е/мг Глюкоамилаза, Е/мг Суммарная протеиназа, Е/мг
Фермент Объект исследования
Суспензия Бесклеточный Суспензия Бесклеточный Суспензия Бесклеточный Суспензия Суспензия Бесклеточный
клеток экстракт клеток экстракт клеток экстракт клеток клеток экстракт
S. cerevisiae (опыт) 32,1±1,19 27,5±0,96 36,2±1,18 32,6±1,12 0,68±0,03 0,51±0,03 1,75±0,07 0,18±0,01 0,66±0,03
S. cerevisiae (контроль) 28,2±1,04 20,0±0,85 30,8±1,14 26,3±1,01 0,44±0,02 0,42±0,02 1,20±0,06 0,07±0,01 044±0,02
активным биологическим компонентом, коррелирует с суммарным содержанием липидов, достигая приблизительно 80 % их общего количества. Известно, что аминокислоты в клетках микроорганизмов влияют на биосинтез веществ небелковой природы, в частности липидов. Изученный ранее аминокислотный состав штамма Saccharomyces cerevisiae Y-503 подтверждает разницу в количественном соотношении аминокислот в исследуемых вариантах. Взаимосвязь между липидным обменом и такими макроэлементами, как калий и натрий, играющими важную роль в метаболизме дрожжевой клетки и участвующими в транспорте веществ через клеточную мембрану, также хорошо известна. В биомассе опытного варианта их количество, изученное ранее [7], значительно отличается от аналогичных показателей в контроле. Изменение содержания в клетке общих липидов и фос-фолипидов могло повлиять на клеточную проницаемость и работу калий-натриевого насоса, что, в свою очередь, говорит о степени активности взаимосвязи клетки с опытной питательной средой. Изменение фосфолипидного состава мембран и, как следствие, их физико-химических свойств, может выступать в качестве фактора, регулирующего активность ферментов [8], что объясняется изменением взаимодействия ферментов с фосфоли-пидным окружением. В связи с этим большой интерес представляет исследование активности ферментов, участвующих в углеводном и азотистом обмене: алко-гольдегидрогеназы (1.1.1.1), а-глюкози-дазы (3.2.1.20), р-фруктофуранозидазы (3.2.1.26), глюкоамилазы (3.2.1.3), суммарного количества протеиназ (3.4).
Так как р-фруктофуранозидаза катализирует реакцию гидролиза сахарозы, входящей в состав мелассной питательной среды, активность фермента проявляется с самого начала процесса брожения. Показано, что уровень его активности в опытном варианте дрожжей превосходит контроль в 1,17 раза в суспензиях клеток и в 1,24 раза в бесклеточных экстрактах (табл. 2). Образование мальтозы в анаэробной среде, основным компонентом которой является мука, способствует синтезу а-глюкозидазы. В наших экспериментах дрожжи, выращенные на питательной среде с геотермальной водой, имеют более высокий уровень активности а-глюкозидазы: в 1,14 раза в суспензиях
клеток и в 1,4 раза — в бесклеточных экстрактах по сравнению с дрожжами, выращенными на контрольной питательной среде. Реакция восстановления ацетальдегида до этанола катализируется ферментом алкогольдегидрогеназой, что имеет важное значение для процесса созревания теста. Установлено, что активность алкогольдегидрогеназы опытного варианта превосходит контроль в 1,54 раза в суспензиях клеток и в 1,21 раза в бесклеточных экстрактах. Условия культивирования и состав питательной среды повлияли и на способность клеток синтезировать глюкоамилазу (амило-глюкозидаза), которая также принимает участие в углеводном обмене дрожжей. Глюкоамилаза — единственная из всех амилаз, способная быстро расщеплять крахмал муки до легкосбраживаемого субстрата — глюкозы. Установлено, что уровень активности глюкоамилазы в суспензиях клеток опытного варианта выше в 1,45 раза по сравнению со штаммом, выращенным на контрольной среде. По-видимому, данный индуцибельный фермент синтезируется в результате воздействия биологически активных веществ геотермальной воды, повлиявших на изученный ранее аминокислотный состав опытного штамма, а большее содержание аргинина, глутаминовой кислоты и про-лина в клетке, как известно, стимулирует накопление глюкоамилазы в дрожжах.
Особое место среди гидролаз дрожжей по своей роли во внутриклеточных процессах занимают протеолитические ферменты, как известно, не только выполняющие в организме деструктивную функцию, но и играющие важную регуляторную роль. Как показали исследования, штамм S. cerevisiae Y-503, выращенный на питательной среде с геотермальной водой, по уровню суммарной протеолитической активности превышает такие же показатели штамма, культивируемого на контрольной среде: в 2,7 раза в суспензиях клеток и в 1,5 раза в бесклеточных экстрактах. Возможно, это связано с большей интенсивностью азотистого обмена. Известно, что определенные металлы оказывают влияние на специфичность действия и величину удельной активности протеолитических ферментов. В нашем эксперименте повышению активности протеолитических ферментов способствовали изученные ранее, находящиеся в геотермальной
воде и востребованные дрожжевыми клетками макро- и микроэлементы магний, марганец, кобальт, цинк.
Таким образом, процесс адаптации культуры к минеральным и органическим компонентам геотермальной воды в составе среды культивирования затрагивает различные стороны метаболизма дрожжей 5. cerevisiae Y-503. При этом отмечаются значительные изменения в процессах фосфорного, азотистого, углеводного, липидного обмена дрожжей.
ЛИТЕРАТУРА
1. АбрамовШ.А., КотенкоС.Ц., ЭфендиеваД.А., Ха-лилова Э. А., Исламмагомедова Э. А., Даунова С. М. Новая питательная среда для выращивания дрожжей//Прикладная биохимия и микробиология. 1995. Т. 31. № 2. С. 232-233.
2. Котенко С. Ц., Исламмагомедова Э. А. Влияние питательной среды на ферментативную активность штамма Saccharomyces oviformis Y-2635//Хранение и переработка сельхозсы-рья. 2005. № 4. С. 37-38.
3. Новаковская С. С., Шишацкий Ю. И. Роль химических элементов в биосинтезе. Производство хлебопекарных дрожжей. Справочник. — М.: Агропромиздат, 1990.
4. Стрелков В. М., Гайлитис Ю. П., Шмит У. Я., Романов Н. А., Юркевич Д. В., Ведерников Н. А. Стимулирующее влияние продуктов механо-химической деструкции гуминовых веществ торфа на рост кормовых дрожжей/Биологические науки. 1991. № 10. С. 83.
5. Овчинникова Т. Ф., Кудряшов А. П., Ма-жуль В. М., Наумова Г. В., Райцина Г. И. О мембранной активности гидрогумата — гуминово-го препарата из торфа//Биологические науки. 1991. № 10. С. 106.
6. Исламмагомедова Э. А., Исламова Ф. И. О некоторых физиолого-биохимических свойствах дрожжей рода Saccharomyces в зависимости от состава питательной среды//Вестник ДНЦ РАН. 2001. № 9. С. 66-68.
7. Исламова Ф. И. Морфофизиологические и биотехнологические особенности дрожжей рода Saccharomyces в зависимости от состава питательной среды//Автореф. дис... — Махачкала. 2002.
8. Wu Wen. I, Carman G. M. Regylation of phosphati-date phosphatase activity from the yeast Saccharomyces cerevisiae by phospholipids//Biochemistry. 1996. V35. N. 12. P. 3790-3796.
9. Колтукова Н. В., Менджул М. И., Лысенко Т. Г., Перепелица С. И. Выделение, очистка и характеристика протеиназ Plectonema boryanu-mZ/Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. № 4. С. 519. &
