CC BY
52
М.А. Медведев, Г.С. Коваль, Н.В. Рязанцева, М.А. Чурбанова, В.Д. Юрьева
ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ НА УРОВНЕ ДУГИ АОРТЫ ПО ДАННЫМ ЦИТОМЕТРИЧЕСКОГО И СПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЙ
Экспериментально установлено распределение эритроцитов на уровне дуги аорты по внешнему и внутреннему диаметру и структурным свойствам; показано существование механизма сепарации более молодых и функционально-полноценных форм эритроцитов в головной мозг для лучшего снабжения кислородом нервных клеток в головном мозге.
Известно, что эритроциты при движении в кровеносном русле обладают способностью к обратимой деформации в широких пределах [1]. Диаметр капилляров в головном мозге может достигать значений, в два раза меньших, чем размеры красных кровяных клеток. Деформируемость эритроцитов во многом определяется морфологическими свойствами клеток, стабильностью ионного гомеостаза, сбалансированностью молекулярной организации белковых и липидных компонентов мембраны эритроцита [1-3]. В связи с этим существует гипотеза о наличии механизма сепарации эритроцитов по признаку зрелости на уровне дуги аорты [4]. Это явление рассматривается как процесс, способствующий адекватному кислородному и энергетическому снабжению клеток головного мозга. Обеспечить соответствие кровотока кислородному запросу позволяет преимущественное поступление в головной мозг молодых, более эластичных и функционально полноценных эритроцитов.
В механизмах формирования гипоксии головного мозга при различных патологических изменениях дуги аорты и аортального клапана сердца немаловажное значение может играть нарушение гемодинамики в дуге аорты и как следствие нарушение распределения эритроцитов по качественному признаку между общей сонной артерией и другими крупными сосудами, отходящими от дуги аорты. Результатом этого может являться нарушение адекватного участия красных кровяных клеток в газообмене, обусловленного их уникальной способностью к деформации в мелких сосудах головного мозга. Известно, что ключевую роль в определении структурной организации и функционирования эритроцита играет его мембрана. При старении красной кровяной клетки ее мембрана трансформируется, снижается активность мембранных ферментов, изменяется вязкость мембраны. Эти процессы приводят к уменьшению размера эритроцита, его способности переносить кислород. В этой связи при изучении механизмов сепарации эритроцитов очевидна необходимость детальной оценки состояния мембраны и ее компонентов, что позволит более полно и эффективно изучить адаптационные механизмы, направленные на предотвращение гипоксических состояний мозга.
С целью изучения закономерностей перераспределения красных кровяных клеток в дуге аорты в настоящем исследовании проводилась оценка диаметра и вязкости мембраны эритроцитов крови у кроликов, полученной из кровеносных сосудов разного уровня (аорты, общей сонной и бедренной артерий).
Материалы и методы исследования
Проводилась катетеризация общей сонной и бедренной артерий, восходящей части дуги аорты у
14 здоровых кроликов. Кровь стабилизировали гепарином (50 ЕД/мл крови). Все вмешательства осуществляли с соблюдением принципов Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1989 г).
Диаметр эритроцитов исследовали методом сканирующей электронной микроскопии. Образцы готовили по методике Г.И. Козинца с соавт. [2]. Для этого пробы крови фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида. После отмывания эритроцитарной взвеси фосфатным буфером (рН=7,4) осуществляли постфиксацию материала 1% раствором четырехокиси осмия. После повторного отмывания клеток фосфатным буфером проводили их обезвоживание в серии этанола возрастающей концентрации (от 30 до 100%) и в ацетоне. Приготовленную суспензию наносили на алюминиевые подложки, высушивали, напыляли ультратонким слоем серебра. Готовые образцы изучали в электронном микроскопе «0ЕМ-100» при ускоряющем напряжении 35 кВ, силе тока 0,63 А, под углом наклона 35°. Для получения значений диаметра эритроцитов в каждом препарате измеряли внешний и внутренний диаметр 100 клеток. Мембраны эритроцитов выделяли по методу [5] в модификации [6]. В качестве флюорофора использовали пирен. При изучении состояния мембран эритроцитов с использованием флуоресцентного зонда пирена определяли величины отношений интенсивностей флюоресценции 1370/1470 при Хв=285 и 340 нм и 1з70/1з90 Хв=340 нм. Показатель величины миграции энергии при индуктивно-резонансном ее переносе с триптофановых остатков белков на пирен в мембранах эритроцитов рассчитывали по формуле [7, 8]. Результаты анализировали статистически с проверкой показателей на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова - Смирнова. Достоверностью различий (р<0,05) определяли с использованием непараметрического критерия Вилкоксона.
Результаты исследования
Результаты цитометрического исследования красных клеток крови показали, что соотношение внутреннего и внешнего диаметров дискоцитов у эритроцитов из сонной артерии (54,86±1,49%) достоверно превышает соответствующую величину у красных кровяных клеток из аорты (52,71±0,71%) и бедренной артерии (52,31±2,12%) при п=10 и р<0,05.
При определении степени эксимеризации неполярного зонда пирен, диффундирующего в гидрофобном компартменте мембраны, было проведено исследование микровязкостных свойств липидной фазы мембран как в области белок-липидных контактов (при длине волны возбуждающего света (Хв), равной 285 нм), так и
всего липидного бислоя мембран красных кровяных клеток (при Хв=340 нм). Средние величины отношения интенсивностей флуоресценции димерной и мономерной формы липотропного зонда пирена (Г470/1340) при длине волны возбуждающего света 340 нм в мембране эритроцитов из разных отделов артериальной системы отличались (р<0,01): в восходящей аорте - 0,347±0,062 усл. ед., в сонной и бедренной артериях - 0,386±0,036 и 0,306± ±0,050 усл. ед. соответственно. Вместе с тем эксимериза-ция пирена в области анулярной липидной фракции осуществлялась с гораздо большими ограничениями, на что указывало несколько сниженное среднее значение 1470/1370 при Хв=285 нм, в мембранах эритроцитов в восходящей аорте составила 0,305±0,041 усл. ед., в сонной и бедренной артериях - 0,343±0,046 и 0,284±0,045 усл. ед. соответственно (отличия достоверны при р<0,01).
Соотношение интенсивностей флуоресценции мономеров пирена (1370/1390) при Хв=340 нм, отражающее полярность микроокружения зонда в интегральной липидной фазе эритроцитарных мембран в восходящей аорте, оказалось равным 1,010±0,014 усл. ед. и не отличалось от исследуемой величины в сонной артерии - 1,010±0,010, отличалось от соотношения 1370/1390 в бедренной артерии - 0,995±0,080 (р<0,01). Наряду с этим процент индуктивно-резонансного переноса энергии с триптофана на пирен, позволяющий судить о белково-липидных взаимодействиях в мембранах, составил в восходящей аорте 69,16± 1,37%, в сонной артерии - 71,83±1,84%, в бедренной - 69,16±4,65%, статистический анализ показал, что данный показатель в исследуемых выборках значимо не отличался (таблица).
Показатели флюоресценции зонда пирена в мембранах эритроцитов крови кролика из разных уровней артериальной системы
Место забора крови Параметры флюоресценции, усл. ед. Величина миграции энергии, %
^„=285 нм ^а=340 нм
I370/I470 I370/I470 I370/I390
Аорта (п=14) 0,305±0,041 0,347±0,062 1,010±0,014 69,16±1,37
Сонная артерия (п=14) 0,343±0,046 (pi<0,01) 0,386±0,036 (р,<0,01) 1,010±0,010 71,83±1,84
Бедренная артерия (п=14) 0,284±0,045 (рь p2<0,01) 0,306±0,050 (рь р2<0,01) 0,995±0,080 69,16±4,65
Примечание. р - достоверность различий выборки по сравнению с восходящей аортой; р2 - достоверность различий выборки по сравнению с общей сонной артерией.
Таким образом, нами установлен факт физиологической сепарации эритроцитов на уровне дуги аорты, характеризующийся поступлением в сонную артерию более молодых эритроцитов с лучшими структурными свойствами мембраны, способных переносить большее количе-
ство кислорода к клеткам головного мозга. В бедренную артерию поступают эритроциты с увеличенной вязкостью липидной фазы мембраны и большим диаметром. Биологическая значимость заключается в более выраженном снабжении кислородом нервных клеток головного мозга.
ЛИТЕРАТУРА
1. Dao M., Li J., Suresh S. Molecularly based analysis of deformation of spectrin network and human erythrocyte // Materials Science and Engineering.
2006. № 26. P. 1232-1244.
2. Козинец Г.И., Симоварт Ю.А. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови в норме и при заболеваниях системы крови.
Таллин: Валгус, 1984. 116 с.
3. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и патофизиология эритроцита. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2004. 202 с.
4. Медведев М.А., Голосов О.С., Нестерова Т.П. Распределение эритроцитов в кровеносном русле на уровне дуги аорты по данным морфологи-
ческих исследований // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. 1986. № 12. С. 648-649.
5. Dodge J.T., Mitchell С., Hanahan D.J. et al. // Arch. Biochem. Biophys. 1963. Vol. 100, № 1. P. 119-130.
6. Петрова М.П., Сербшова Т.А., Васильев П.С. // Лаб. дело. 1978. № 8. С. 503.
7. Владимиров Ю.А., Добрецов Т.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М., 1980.
8. Добрецов Т.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М., 1989.
Статья поступила в редакцию журнала 5 декабря 2006 г., принята к печати 25 декабря 2006 г.
