CC BY
112
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 1999 УДК 616-006.04-02:574:502
А. Я. Хесина
, Л. В. Кривошеева, И. А. Хитрово,
С. С. Левинский
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КАНЦЕРОГЕНОВ В ЗАГРЯЗНЕНИЯХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
НИИ канцерогенеза
Статья содержит краткий обзор работ, выполненных в последние годы в лаборатории методов скрининга канцерогенов НИИ канцерогенеза ОНЦ в группе физико-химиче-ских методов анализа канцерогенов и посвящена 95-летию со дня рождения основателя лаборатории академика Леона Манусовича Шабада.
Пятьдесят лет назад Л. М. Шабад пригласил на работу в лабораторию физика Александру Аристарховну Ильину для проведения исследований по определению канцерогенных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в объектах окружающей среды. Эти соединения имели характерные спектры люминесценции, и в мире уже использовали физические (спектрально-люминесцентные) методы для их идентификации и количественного определения.
Л. М. Шабад считал, что один из возможных, при этом экспрессных, методов определения канцерогенной опасности загрязнений окружающей и производственной среды, объектов промышленного и природного происхождения, продуктов курения и пищевых — это количественное определение в них заведомо канцерогенных веществ. Одним из путей профилактики рака он считал необходимость снижения контакта человека как в повседневной жизни, так и в производственной деятельности с химическими канцерогенными веществами для «выведения латентного периода возникновения опухолей за пределы человеческой жизни». Так в лаборатории было положено начало деятельности группы физико-химических методов анализа канцерогенов.
Несмотря на 15 лет, прошедшие с момента, когда Лев Манусович навсегда ушел от нас, направление работы группы, заданное профессором Л. М. Шабадом, остается актуальным; это подтверждено решениями Международной конференции в Стокгольме (1994) [18].
EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS
A.Ya.Khesina , L. V.Krivosheyeva, I.A.Khitrovo, S.S.Levinsky
PHYSICO-CHEMICAL STUDY
OF CARCINOGENS IN ENVIRONMENTAL
POLLUTIONS
Institute of Carcinogenesis
This paper is a review of recent studies of the Laboratory for Carcinogen Screening Methods, Research Institute of Carcinogenesis, CRC, and is devoted to the 95th birthday of Leon Manusovich Shabad, the laboratory founder.
Fifty years ago L.M.Shabad invited Alexandra Aristarkhovna Ilyina, a physicist, to join a study involving detection of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in environmental objects. These compounds have characteristic luminescence spectra, and physical (luminescence spectral) methods of their identification and quantification are widely applied worldwide.
L.M.Shabad considered detection and quantification of products with well established carcinogenic potential a good and rapid method to evaluate carcinogenic risk due to pollution of residence and production areas, industrial and natural objects, alimentary products. Reduction of exposure to chemical carcinogens «to extend tumor latency beyond human life span» was in his opinion a way of cancer prevention. This was the beginning of many-year activities of a group for physico-chemical analysis of carcinogens.
Although Leon Manusovich deceased 15 years ago the group scientific activities remain up-to-date which was confirmed once again by the International Conference in Stockholm (Amer.Hlth Perspect., 1994) [18].
Consider a flowchart of air pollution study performed by the group for physico-chemical analysis of carcinogens.
Over the last decade nitrated PAH (nitro-PAH) were in the focus of attention. The nitro-PAH are chemical compounds with biologic activity. The first reports of 2-nitrofluorene carcinogenic effect were published in 1950, but nitro-PAH failed to arise investigators’ interest till 1975 when mutagenic activity of several nitro-PAH was demonstrated [19].
Схема 1 Diagram 1
Блок-схема исследований химических канцерогенов в загрязнениях окружающей среды, проведенных группой физикохимических методов анализа канцерогенов
Study of chemical carcinogens in environmental pollutions as conducted by the Group for Physico-Chemical Carcinogen Analysis
ПАУ
Нитро-ПАУ
PAH
Nitro-PAH
Разработка методических рекомендаций для контроля загрязнений объектов окружающей среды Development of recom mendations to control environmental pollutions
Разработка метода Metod development
Изучение выбросов различных источников Study of various discharges
Промышленные выбросы Industrial discharges
Изучение профиля ПАУ БП-индикатор РАН profile study BP indicator
Выбросы двигателей транспортных средств Industrial discharges
Промышленные выбросы Industrial discharges
N-нитрозамины
N-Nitrosoamines
Параллельное изучение канцерогенной и мутагенной активности экстрактов Parallel study of carcinogenic and mutagenic activities of extracts
Выбросы двигателей транспортных средств Industrial discharges
На схеме 1 приведена блок-схема исследований загрязнений воздушной среды, проведенных группой исследователей физико-химических методов анализов канцерогенов.
В последнее десятилетие большой интерес исследователей вызывает еще один класс канцерогенов — нитропроизводные ПАУ (нитро-ПАУ). Нитро-ПАУ представляют класс химических соединений, обладающих биологической активностью. В 1950 г. впервые опубликованы данные о канцерогенном эффекте, вызванном 2-нитрофлуореном, но подобные исследования не вызывали интерес до 1975 г., когда была выявлена высокая мутагенная активность ряда нитро-ПАУ [19].
Нитро-ПАУ обнаружены в атмосферном воздухе, в выбросах автомобильных и авиационных двигателей, коксовых и дровяных печей, конденсате сигаретного дыма, в пище, в чае [10]. Концентрации в выбросах сравнимы с концентрациями ПАУ, а в атмосферных загрязнениях — на 1—2 порядка ниже.
Нитро-ПАУ были включены в схему исследований лишь в последние годы, однако когда мы обратились к этой проблеме, выяснилось, что Лев Манусович уже в конце 70-х годов во время одной из своих поездок в Европу [15] привез и положил к нам в сейф для будущих исследований нитропирен, динитропирен, 2-нитрофлуорен.
1Ч-нитрозамины были включены в схему исследований также лишь во второй половине 70-х годов, но уже тогда Лев Манусович (после Международной конференции в Таллине по нитрозаминам — НА) сказал, что эта группа канцерогенов не вытеснит канцерогенные ПАУ из сферы науч-
The nitro-PAH are found in atmospheric air, car and aircraft engine exhausts, coke and wood furnace smoke, cigarette smoke condesate, foods, tea [10]. The concentrations in exhausts are compatible with those of PAH while the air concentrations are 1 or 2 orders of magnitude lower.
We started the nitro-PAH study quite recently. However, when we addressed this problem we were surprised to find samples of nitropyrene, dinitropyrene and 2-nitrofluorene which were brought by Leon Manusovich for future study from a travel to Europe [15] already in the late seventies.
The study of N-nitrosoamines began also in the late seventies though already at that time Leon Manusovich predicted that these carcinogens would not replace carcinogenic PAH in scientific research and would be studied together with rather than instead of the PAH.
Flowchart 1 applies to air pollution only. While Leon Manusovich studied for several decades the problem of carcinogen circulation in human environment [14], and we developed and implemented assays also applicable to pollutants of soil, water, industrial and natural products, foods and tobacco smoking products.
Leon Manusovich considered necessary to establish and to approve by health authorities maximum allowable concentrations (MAC) for ubiquitous carcinogens. The established MAC, in particular those for PAH and N-nitrosoamines (table 1), are a stimulus to control carcinogenic pollution of environment by sanitary surveillance bodies and to develop systems of maximum allowable discharge (MAD) providing for reduction in environmental
Таблица 1 ТаЫе1
Утвержденные ПДК для ряда химических канцерогенных веществ в объектах окружающей среды (ПАУ и N-нитрозамины) Standard environmental MAC for some chemical carcinogens (PAH and N-nitrosoamines)
Канцерогенные вещества Объекты нормирования Величина регламентирования
Бенз(а)пирен, индикатор загрязнения Bo3flyx:/Air:
канцерогенными ПАУ населенных мест/residential areas 1 нг/м3[пд/т3]
Benze(a)pyrene, an indicator рабочей зоны/work areas 150 «
of carcinogenic РАН pollution Вода питьевая/Drinking water 5 нг/л [ng/l]
Почва/Soil 20 нг/кг [ng/kg]
Кормовые дрожжи «Поприн»/Рорпп feed yeast 5 «
1, 2, 5, 6-Дибензантрацен 1,2,5,6-Dibenzeanthracene Летучие N-нитрозамины: Воздух населенных мест/Residential area air 5 мкг/кг [mcg/kg]
Volatile N-nitrosoamines: Воздух населенных мест/Residential area air 50 нг/м3[пд/т3]
HflMA/NDMA Пищевые npoflyKTbi:/Foods:
НДМА и НДЭА/NDMA and NDEA мясные продукты/meat products копченые мясные/smoked meat products 2 мкг/кг [mcg/kg]
продукты/praducts 4 «
пивоваренный солод/beer malt 15 «
пиво/beer 3 «
зерно/grains 2 «
рыбные продукты/fish products 3 «
Детские соски и пустышки/Baby’s dummies 10 «
Carcinogenic substances Standardization objects Value
ных и научно-практических интересов, а будет неизменно изучаться «не вместо, а вместе».
Приведенная схема 1 касается только загрязнений воздуха. Но Льва Манусовича в течение десятилетий интересовала проблема циркуляции канцерогенов в окружающей человека среде [14], и мы разрабатывали и внедряли методики исследования загрязнений не только воздуха, но и почвы, воды, промышленных и природных веществ, пищевых продуктов и продуктов курения.
Лев Манусович считал не только полезным, но и необходимым для канцерогенов убиквитарного (повсеместно, даже на фоновом уровне) распространения разработать и утвердить органами здравоохранения предельно допустимые концентрации (ПДК). Утвержденные ПДК, в частности те из них, которые связаны с ПАУ и 1М-нитрозаминами (табл. 1), являются стимулом для органов санитарного надзора контролировать уровень загрязнения канцерогенными веществами объектов окружающей среды, а для промышленности и других источников загрязнений — разработать системы предельно допустимых выбросов (ПДВ), обеспечивающих минимальное загрязнение окружающей среды, не превышающее ПДК.
В табл. 1 представлены все действующие в России ПДК канцерогенных ПАУ и НА. Методики, обеспечивающие контроль этих соединений в объектах окружающей среды, разработаны в нашей лаборатории или с нашим участием [1,2, 5—9]; некоторые из них были разработаны и внедрены еще при Л. М. Шабаде. Следует отметить, что разработка ПДК бенз(а)пирена (БП) в почве подчеркнула тесную связь онко-
pollution below the MAC due to industrial installations and other pollution sources.
Table 1 summarizes all MAC for carcinogenic PAH and NA accepted in Russia. Methods to ensure control of these compounds in environment were developed at our laboratory or jointly by our and other laboratories [1,2,5-9]. Of note that the development of MAC for benze(a)pyrene (BP) demonstrated close relationship of hygiene and ecology fields of cancer research. Investigators from the Sysin Hygiene Institute showed that soil BP concentrations above 20-25 mcg/kg, and therefore soil pollution with the entire PAH spectrum cause death of a considerable portion of soil own microflora and predomination of colon bacillus. Thus the BP MAC was established basing on the risk of ecological shift rather than the risk of carcinogenic PAH (in particular BP) penetration from soil into vegetable foods. A new, ecological field of cancer research was then formally established at the First Conference on Cancer Ecology convinced in Kiev in 1986 on Professor B.L.Rubinchik’s initiative.
High-sensitivity and high-specificity assays were needed to identify and quantify carcinogenic substances. A so called Shpolsky’s effect was used to analyze PAH, i.e. the appearance of absolutely individual luminescence (fluorescence and phosphorescence) spectra in PAH solutions in normal paraffin frozen at (196 °C with a 100-1000-fold increase in luminescence (and therefore in assay sensitivity) as compared to room temperature and other solvents. We developed methods to analyze BP and several other important ubiquitous PAH
гигиенического и онкоэкологического направления исследований. Работы, проведенные в Институте гигиены им. Сыси-на, показали, что при концентрациях БП в почве выше 20 — 25 мкг/кг, а соответственно загрязнении почвы всей совокупностью канцерогенных ПАУ в ней погибает значительная часть собственной микрофлоры и получает преимущественное развитие кишечная палочка. Таким образом, уровень ПДК для БП был продиктован не возможностью перехода канцерогенных ПАУ, в частности БП, из почвы в продукты питания растительного происхождения, а опасностью экологического сдвига. Позднее на I Конференции по онкоэкологии, организованной в Киеве в 1986 г. проф. Б. Л. Рубенчиком, было официально зарегистрировано новое онкоэкологичес-кое направление научных исследований.
Для идентификации и количественного определения канцерогенных веществ требовались высокочувствительные и высокоспецифичные методы анализа. Для анализа ПАУ был использован так называемый «эффект Шпольского» — появление в условиях замороженных при -196 °С растворов ПАУ в нормальных парафинах абсолютно индивидуальных спектров люминесценции (флюоресценции и фосфоресценции) при увеличении выхода люминесценции, а следовательно, чувствительности метода в 100 — 1000 раз выше, чем при комнатной температуре в других растворителях. Были разработаны методики анализа БП и ряда [12, 17, 20] других приоритетных ПАУ, наиболее широко распространенных в загрязнениях окружающей среды и в выбросах от различных источников — промышленных предприятий и транспортных средств.
Высокая селективность спектров замороженных н-пара-финовых растворов ПАУ и высокий квантовый выход в спектрах люминесценции позволили разработать на их основе высокочувствительные (по БП Стт = 0,5 • 10 10 г/мл) точные (ошибка метода ± 10%) методики определения ряда приоритетных ПАУ. Специфичность и чувствительность методов анализа индивидуальных соединений могла быть повышена за счет использования селективного возбуждения люминесценции (возбуждения свечения монохроматическим светом в одной из полос интенсивного поглощения).
Для 16 ПАУ, наиболее распространенных в загрязнениях окружающей человека среды, были выбраны параметры их определения по спектрам флюоресценции (длины волн аналитических линий в спектрах флюоресценции и возбуждения люминесценции).
Разработанные методы широко внедрялись в практику различных лабораторий, занимающихся промышленным и санитарным контролем. Нами они были использованы для проведения ряда комплексных работ, связанных с анализом загрязнений воздуха городов, выбросов предприятий промышленности и транспортных средств, промышленных продуктов, некоторых пищевых и кормовых продуктов, продуктов курения. Результаты одного из таких исследований, в ходе которого изучалась степень загрязнения атмосферного воздуха Москвы в районах с различными преобладающими источниками загрязнения, представлены в табл. 2.
Для экспрессной оценки загрязнения окружающей среды канцерогенными углеводородами (ПАУ) Лев Манусович счи-
[12,17-20] found among environmental pollutants and discharges from various sources including industrial plants and engine vehicles.
High-sensitivity (BP Cmin = 0,5 ■ 1 O '" g/ml) and high accuracy (error +10%) methods for detection of most important PAH were developed basing on the high selectivity and the high quantum yield in luminescence spectra of the frozen PAH paraffin solutions. The analysis of individual compounds could be made more specific and sensitive by selective luminescence excitation (luminescence excitation by monochromatic light in an intense absorption band).
Parameters for detection of 16 most ubiquitous PAH by their fluorescence spectra were developed including analytical band wavelength in fluorescence and luminescence excitation spectra.
These methods were applied by many research laboratories engaged in industrial and sanitary surveillance. We used these methods to analyze urban air pollution, industrial discharge and engine exhausts, some foods and feeds, cigarette smoking products. Table 2 presents findings of a study of Moscow air pollution in districts with different pollution sources.
Leon Manusovich considered it reasonable to use a most carcinogenic and ubiquitous PAH, BP (or 3,4-benzepyrene according to previous classification), as an indicator for rapid evaluation of environmental pollution by carcinogenic PAH which was later done in the USSR. In 1959 the first monograph on air pollution by carcinogenic 3,4-benzepyrene written by L.M.Shabad and P.P.Dikun was published in Leningrad. While the BP as an indicator of the presence of all carcinogenic and genotoxic PAH in environment was formally accepted by the International Conference in Stockholm
[15] in 1978 only, this decision to be confirmed by another international conference in Stockholm in 1992 [18].
Investigators from our and some other laboratories (e.g.
[16]) showed later that every source had a characteristic ratio of different PAH concentrations to indicator (e.g. BP) concentration taken for unit.
Fig. 1 demonstrates PAH profiles of various discharge sources at a large coke chemistry plant [11] and air of adjacent residential area in Kemerovo [3].
The PAH profiles were similar and, like fingerprints, characteristic of a certain discharge source. The relative (in respect of BP) concentrations make up a system of coefficients to calculate concentrations of predominant PAH basing of BP as an indicator and to make approximate quantification of carcinogenic PAH, to detect the principal pollution source and to assess effect of measures aimed to reduce PAH discharge from industrial plants, transport, heating systems and consequently environmental pollution.
N-nitrosoamines are another class of chemical compounds demonstrating carcinogenic activity on all laboratory animal species and recognized as a potential human carcinogen.
Gas chromatography using thermal power analyzers is a world recognized method to analyze these compounds. There are techniques for analysis of volatile carcinogenic N-nitrosoamines in various objects. Our laboratory developed a methodology for gas chromatography sample preparation
Таблица 2 Table 2
Загрязнение атмосферного воздуха Москвы ПАУ (экологически неблагополучные районы)
Moscow air pollution by PAH (areas with poor ecology)
Характеристика места отбора проб Средние значения концентрации БП, нг/мэ Максимально допустимая концентрация БП, нг/мэ
Регулярное движение автотранспорта Regular traffic 5,5 ±1,1 1,0
Перекрестки с активным движением автотранспорта Crossroads with intense traffic 20,0 ± 1,4
Район выбросов нефтеперерабатывающего производства Petroleum processing discharge 13,4 ±0,6
Sampling site characteristics Mean BP concentrations, ng/m3 BP maximum allowable concentration, ng/m3
тал целесообразным использовать один из наиболее канцерогенных и распространенных ПАУ — БП (в старой номенклатуре 3,4-бензпирен) — в качестве индикаторного соединения, что и было использовано в исследованиях, проводимых в СССР. В 1959 г. в Ленинграде вышла первая в этом научном направлении монография Л. М. Шабада и П. П. Дикуна «Загрязнение атмосферного воздуха канцерогенным веществом — 3,4-бензпиреном». Лишь в 1978 г. на Международной конференции в Стокгольме [15] было официально зафиксировано, а в 1992 г. тоже на Международной конференции в Стокгольме подтверждено [18], что БП может быть использован в качестве индикатора присутствия в загрязнениях окружающей среды всей группы канцерогенных и генотоксичных ПАУ.
Впоследствии в работах ряда исследователей [6], а также в наших исследованиях состава ПАУ в выбросах некоторых промышленных предприятий и транспортных средств было показано, что каждый источник имеет характерное соотношение выбросов различных ПАУ (так называемый «профиль» ПАУ) — отношение концентраций различных соединений к концентрации одного «индикаторного», например БП, принятого за 1.
На рис. 1 представлены профили ПАУ для различных источников выброса на одном из крупных коксохимических производств — на коксохимическом заводе (КХЗ) в Кемерово [11] и в загрязнениях воздуха промышленного города в прилегающем жилом массиве [13].
Аналогичность профиля ПАУ показывает, что он, как отпечатки пальцев, характерен для определенного источника выбросов, относительные концентрации (по БП) составляют систему коэффициентов, по которым могут быть рассчитаны концентрации приоритетных ПАУ, исходя из измеренных значений концентрации БП как индикаторного соединения не только в плане присутствия всего комплекса канцерогенов этого класса в загрязнениях окружающей среды, но и для приближенной количественной оценки степени загрязнения канцерогенными ПАУ, для выявления основного источника выбросов и оценки эффективности мероприятий по снижению выбросов ПАУ от источников (промышленность, транспортные средства, системы отопления) и соответственно — снижению степени загрязнения окружающей среды.
Известно, что еще одним классом химических канцерогенов, проявивших канцерогенную активность на всех
which assured a 80-90% yield of test substances. These methods are included in the standard for N-nitrosodimethylamine MAC in air pollutions (50 ng/m3) (see table 1). Rubber and tire industrial plants are an important source of air carcinogenic N-nitrosoamine pollution as well as rubber products because accelerators containing NA and its precursors are used in the manufacture. Rationale was developed for estimation of total N-nitrosoamine MAC in work air of rubber and tire production facilities with intense carcinogenic N-nitrosoamine discharge. Table 3 summarizes mean values of urban air pollution by volatile carcinogenic N-nitrosoamines including those for Moscow [12]. We studied chromatograms of N-nitrosoamine reference solutions (N-nitrosodimethylamine, N-nitrosodi-ethylamine, N-nitrosodibutylamine, N-nitrosodipropylamine, N-nitrosopiperidine, N-nitrosopyrrolidine, N-nitrosomorpho-line) and a chromatogram of air pollution extract clearly demonstrating the presence of N-nitrosodimethylamine and N-nitrosodiethylamine. Since the carcinogenic N-nitrosocom-pounds were also found in extracts from latex baby’s dummies and medical rubber catheters we together with the Rubber and Latex Institute performed a study to select the safest raw materials and to develop optimal technology for production and purification of such articles.
PAH nitrosoderivatives are the last but not the least carcinogens.
A hepatic malignancy inducer 2-N-fluorene was also demonstrated to cause breast and small intestine cancer in rats. Comparison of carcinogenic effects on rat skin showed the skin not to be a target tissue for nitro-PAH though dini-tropyrenes induced squamous cell carcinoma of lung in rats, lung adenocarcinoma after intratracheal administration (in Syrian hamsters), sarcomas after subcutaneous administration, tumors of the liver, lung, lymphomas in experiments on newborn mice [17]. 1-Nitropyrene and dinitropyrenes produce carcinogenic effect after subcutaneous, oral, intraperi-toneal and intratracheal administration.
Nitro-PAH mutagenicity was intensely studied in Ames test (Salmonella reversion study). The nitro-PAH was shown to produce the highest mutagenic effect on TA-98 strains even in the absence of the activation system (S9). The direct mutagenic activity of most nitro-PAH is in contrast to PAH mutagenic effect requiring activation. Some nitro-PAH (dinitropyrenes) are strongest mutagens among the compounds
6
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 1. Профили ПАУ в выбросах коксохимического производства.
1—6 — от различных источников Руставского КХЗ; 7 — от верхних площадок коксовых батарей; 8 — воздух импактной зоны (Кемеровский КХЗ). Обозначения: а — пирен, Р; Ь — флуорантен, FI; с — бенз(а)антрацен, В(а)А; d — хризен, Chr; е — бенз(Ь)флуорантен, B(b)FI; f — бенз(/<)флуорантен, B(/c)FI; д — перилен, PI; h — бенз(а)пирен, В(а)Р.
Fig. 1. РАН profiles in discharge from coke chemistry plants
1-6, various source at Rustavi coke chemical plant; 7, coke battery upper sections; 8, impact area air (Kemerovo coke chemical plant).
видах лабораторных животных и признанных как возможные канцерогены для человека, являются канцерогенные >1-нитрозамины.
Для анализа этих соединений используется принятый во всем мире метод газовой хроматографии с использованием термоэнергетического анализатора. Разработаны методики анализа канцерогенных летучих Тч[-нитрозаминов в различных объектах. Разработанный нами метод предварительной подготовки пробы к газохроматографическому анализу обеспечивает выход исследуемых веществ на 80 — 90%. Методики включены в документ, устанавливающий ПДК для 1М-нитрозодиметиламина в загрязнениях атмосферного воздуха (50 нг/м3) на правах ГОСТа (см. табл. 1). Одними из важных источников загрязнения канцерогенными Ы-нитро-заминами являются предприятия резиновой и шинной промышленности, а также продукция этих предприятий, поскольку при производстве резины используются ускорители, содержащие как НА, так и вещества, предшествующие их образованию. Предложено обоснование ПДК суммарного содержания Ы-нитрозаминов в воздухе рабочих помещений на предприятиях резиновой и шинной промышленности, характеризующихся выделением канцерогенных М-нитрозосоединений в производственную и окружающую среду. В табл. 3 представлены средние значения загрязнения воздуха городов канцерогенными летучими Ы-нитроза-минами, в том числе полученные нами значения для Москвы [12]. Были исследованы хроматограммы эталонных растворов летучих Ы-нитрозаминов (Ы-нитрозодиметила-мин, Ы-нитрозодиэтиламин, Ы-нитрозодибутиламин, М-ни-трозодипропиламин, Ы-нитрозопиперидин, Ы-нитрозопир-ролидин, Ы-нитрозоморфолин) и хроматограмма экстракта из загрязнения воздуха, на которой отчетливо видно присутствие в пробе Ы-нитрозодиметиламина и 1Ч-нитрозодиэ-тиламина. Поскольку было обнаружено присутствие канцерогенных М-нитрозосоединений в экстрактах из детских латексных сосок и медицинских резиновых катетеров, нами
tested on Salmonella. Since the mid eighties intense study of nitro-PAH biological (carcinogenic and mutagenic) activity was in progress abroad as well as study of nitro-PAH generation in the presence of PAH and nitrogen oxides, propagation, detection and quantification methods. The nitro-PAH were shown to induce animal tumors, bacterial mutations, neoplastic transformation in mammalian call cultures, DNA filament break and reparation, chromosomal aberrations [10].
Nitroreductase-deficient mutagenic strains were isolated to study nitro-PAH-associated mutagenicity. Experiments on these strains demonstrated that 1-nitropyrene and dinitropy-rene account for 30-40% of total mutagenic activity of extracts from PAH-containing engine exhausts [20].
Sophisticated, many-step analyses involving the use of selective solvents, specific sorbents, multi-stage chromatography, gas and high-performance liquid chromatography and chromatographic mass spectrometry are applied in the USA and Japan to extract, to divide, to identify and to quantify nitro-PAH [21,22]. There was no study of nitro-PAH in this country so far.
Our laboratory carries out parallel study to detect and measure carcinogenic substances (in particular PAH) in environmental pollutants and industrial and transport exhausts and biological activity of extracts by express biological tests. Such a study of gas and soot extracts from engine exhausts involving determination of PAH content by fluorescent spectra and low temperature selective luminescence excitation in parallel with study of their mutagenicity by Ames test discovered direct-action mutagens in diesel engine exhausts [4].
BP, 1-nitropyrene and soot extract mutagenic effects were studied in TA-100 and TA-98 strains by Ames test (fig.2). As direct (without S9) mutagenic effect was discovered we started to develop a method for detection of PAH nitroderivatives. We obtained fluorescence spectra for some important carcinogenic and mutagenic PAH. As compared to fluorescence spectrum of BP n-octane solution frozen at -196 °C, the fluorescence spectra of nitro-PAH n-paraffm
ТаблицаЗ Table 3
Загрязнение атмосферного воздуха Москвы канцерогенными летучими N-нитрозаминами Moscow air pollution by carcinogenic volatile N-nitrosoamines
Характеристика места отбора проб Средние значения концентрации, нг/мЗ
N-нитрозодиметиламин N-нитрозодиэтиламин
Район автомагистралей/НідІїшау area 89,0 ±3,0 180,0 ±29,0
Промышленная зона/industrial area 521,0± 15,0 88,0 ± 11,0
Жилая зона/Residential area 60,0 ±5,0 50,0 ±6,0
N-nitrosodimethylamine N-nitrosodiethylamine
Sampling site characteristics Mean BP concentrations, ng/m3
совместно с НИИ резинолатексных изделий предприняты исследования по выбору наиболее безопасного сырья и оптимизации технологии производства и очистки.
Последним по времени включения в перечень определяемых классов химических канцерогенов, но не последним по важности, является еще один класс канцерогенов — нитропроизводные ПАУ.
Обнаружено, что 2-]Ч-флуорен, индуцирующий злокачественные опухоли печени, вызывает также опухоли молочной железы и тонкой кишки у крыс. Сравнительное изучение канцерогенного действия на кожу мышей показывает, что эта ткань не является тканью-мишенью для нитро-ПАУ, однако динитропи-рены вызывают плоскоклеточные карциномы в легких крыс, аденокарциномы легких при интратрахеальном введении (у сирийских золотистых хомячков), саркомы — при подкожном введении, опухоли печени, легких, лимфомы — в испытаниях на новорожденных мышатах [17]. 1-Нитропиренидинитропирены проявляют канцерогенное действие при подкожном, перораль-ном, внутрибрюшинном и интратрахеальном введении [10].
Мутагенность нитро-ПАУ наиболее интенсивно изучалась в тесте Эймса (изучение реверсий на сальмонелле). Показано, что наибольший мутагенный эффект нитро-ПАУ проявляется на штаммах ТА-98 и в отсутствие активирующей системы (89). Прямая мутагенная активность большинства нитро-ПАУ контрастирует с мутагенным эффектом ПАУ, для которого требуется активация. Некоторые нитро-ПАУ (динитропирены) — одни из самых сильных мутагенов среди соединений, тестированных на сальмонеллах. С середины 80-х годов за рубежом проводятся активные исследования биологической (канцерогенной и мутагенной) активности нитро-ПАУ, их образования в присутствии ПАУ и окислов азота, распространения, методов обнаружения и количественного определения. Показано, что нитро-ПАУ вызывают опухоли у животных, мутации в бактериальных тест-системах, опухолевую трансформацию в культуре клеток млекопитающих, разрыв нитей и репарации ДНК, хромосомные аберрации [10].
Для исследований мутагенной активности, связанной с нитро-ПАУ, выделены мутагенные штаммы, дефицитные по нитроредуктазе. С их помощью обнаружено, что 30— 40% общей мутагенной активности экстрактов отработавших газов двигателей транспортных средств, содержащих ПАУ, окислы азота и нитро-ПАУ, приходится на 1-нитропи-рен и динитропирен [20].
frozen solutions are free from marked fine structure though demonstrate high selectivity and specificity. We developed «A Method for Nitro-PAH Qualitative and Quantitative Detection in Composite Mixtures and Extracts» which was adopted for patent granting in 1997 and involved high-performance liquid chromatography and spectral fluorescence analysis. Diagram 2 is a flow-chart of the analysis which is superior by simplicity and rapid performance to the existing sophisticated multistage analytical techniques based on chromatographic mass spectrometry.
This method was first applied to analyze nitro-PAH in diesel engine exhaust soot extract which was previously studied for PAH and direct and indirect mutagenic activity (see figs.2,3). We measured contents of 15 PAH, determined PAH profile of soot from diesel (BP 0.8 mcg/g; pyrene 5.4 mcg/g) and gas turbine (BP 0.3 mcg/g; pyrene 4.5 mcg/g) engine exhausts and BP in the exhausts (1400-2250 ng/m3 and 180-1000 ng/m3, respectively). The soot and exhaust extracts had similar PAH profiles (see fig.3). The concentration measurements for 1-nitropyrene (3.6 mcg/g) and dini-tropyrene (0.03 mcg/g) are of the same order of magnitude as those reported in the literature for nitropyrene (3.9-24.5 mcg/g). The soot PAH and nitro-PAH profiles confirmed the expected mutagenic activity of the soot extract (see fig.3),
i.e. indirect effect as associated with PAH and direct effect as associated with nitro-PAH.
These methods were not only published as guidelines and recommendations, but also were widely applied to control Moscow air pollution by carcinogenic PAH and NA [12] as well as to study pollution and discharge from coke chemistry plants in large industrial centers of the Urals and Siberia [3,11] (Kemerovo, Novokuznetsk) and from gas industry plants [13]. The nitro-PAH analysis method accepted for patent granting is currently used in our joint activities with engineers aimed to reduce amount of carcinogenic PAH and nitro-PAH in diesel engine exhausts.
Thus, the L.M.Shabad’s idea to apply express physicochemical tests for carcinogen detection in the field of cancer hygiene for cancer prevention and in the field of cancer ecology is being successfully implemented by workers of our laboratory now headed by professor G.A.Belitsky, L.M.Shabad’s follower, as well as in several other CRC laboratories also headed by L.M.Shabad’s disciples such as professors
A.P.Ilnitsky, V.S.Turusov and L.N.Pylev. The development
Для выделения, разделения, идентификации и количественного определения нитро-ПАУ в США и Японии [21, 22] разработаны сложные, многоступенчатые схемы, включающие использование селективных растворителей, специфических сорбентов, многоступенчатой хроматографии, газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и хромато-масс-спектрометрии. В нашей стране исследования нитро-ПАУ до настоящего времени не проводились.
В нашей лаборатории проводятся параллельные исследования присутствия и количества канцерогенных соединений (в частности, ПАУ) в загрязнениях окружающей среды и в выбросах от промышленных источников и транспортных средств и биологического действия экстрактов при экспрессном биотестировании. Такое исследование, проведенное с экстрактами из отработавших газов и сажи различных типов двигателей с изучением состава ПАУ по структурным спектрам флюоресценции и селективном возбуждении люминесценции при низких температурах параллельно с изучением мутагенности экстрактов в тесте Эймса, позволило выявить мутагены прямого действия в выбросах двигателей, работающих на дизельном топливе [4].
При изучении мутагенности в тесте Эймса на штаммах ТА-100 и ТА-98 параллельно исследовали мутагенный эффект от БП, 1-нитропирена и экстракта из сажи (рис. 2). Обнаружение прямого (без добавления фракции S9) мутагенного эффекта заставило нас обратиться к разработке метода определения нитропроизводных ПАУ Нами были получены спектрограммы спектров фосфоресценции ряда приоритетных канцерогенных и мутагенных нитро-ПАУ. В сравнении с исследованным нами ранее спектром фосфоресценции замороженного при -196 °С н-октанового раствора БП спектры фосфоресценции нитро-ПАУ в условиях замороженных н-парафиновых растворов имеют при низких температурах спектры фосфоресценции, лишенные выраженной тонкой структуры, но обладающие высокой селективностью и специфичностью. Нами разработан и предложен «Способ качественного и количественного определения в сложных смесях и экстрактах нитро-ПАУ, имеющих фосфоресценцию в замороженных растворах», принятый к патентованию в 1998 г., основанный на использовании ВЭЖХ и спектрально-фосфоресцентном анализе фракций. На схеме 2 представлена блок-схема метода анализа, по простоте и экспрессности превосходящего применяемые в мире сложные, многоступенчатые методы анализа, основанные на хромато-масс-спектрометрии.
Эта методика впервые была применена нами при анализе нитро-ПАУ в экстракте из сажи двигателя, работающего на дизельном топливе, ранее изученного на содержание ПАУ и на наличие прямого и непрямого мутагенного эффекта (см. рис. 2, 3). Количественно были определены 15 ПАУ, определен профиль ПАУ — в саже дизельного (БП 0,8 мкг/г, пирена 5,4 мкг/г) и газотурбинного (БП 0,3 мкг/г, пирена 4,5 мкг/г) двигателей и соответственно в выбросах но БП (1400—2250 и 180—1000 нг/м3). Профиль ПАУ совпадал для экстрактов из сажи и отработавших газов (см. рис. 3). Полученные значения концентраций для 1-нитропирена 3,6 мкг/г и динитропирена
0,03 мкг/г согласуются с порядком величин концентраций по данным литературы (для нитропирена в диапазоне 3,9—24,5 мкг/г). Состав ПАУ и нитро-ПАУ в саже подтвердил ожидае-
5
4
3
2
1
0
Контроль БП 1-Нитро- 5-,10-,50-кратное пирен разведение экстракта
Рис. 2. Мутагенный эффект экстракта из выброса двигателя, работающего на дизельном топливе (Salmonella ТА-98).
Темные столбики - S9, со штриховкой +S9.
Fig. 2. Mutagenic effect of extracts from a diesel-fueled gas turbine engine exhausts (Salmonella TA-98).
Numbers on the x axis show extract dilutions; numbers on the у axis show thousand mutants per plate.
Filled bars indicate - S9; hatched bars indicate +S9.
Схема 2 Diagram 2
Схема комплексного метода анализа нитро-ПАУ (1-Np, 1,3-DNp)
Complex Nitro-PAH (l-Np, 1,3-Dnp) Analysis
and implementation of highly specific, selective, accurate and sensitive methods for detection of different chemical carcinogenic substances, their application to study pollutions and exhausts as well as to evaluate efficiency of nature preservation activities make a significant contribution to improvement of cancer ecology situation and cancer prevention.
мый мутагенный эффект экстракта из сажи (см. рис. 3) — непрямой, связанный с ПАУ, и прямой, связанный с нитро-ПАУ.
Разработанные методики не только внедрены в виде методических указаний и рекомендаций и включены в ПДК ПАУ и НА как рекомендуемые методы контроля (см. табл. 1), но широко использованы для контроля загрязнения атмосферного воздуха Москвы канцерогенными ПАУ и НА [12], для изучения загрязнений и выбросов коксохимической промышленности в крупнейших промышленных центрах Урала и Сибири [3, 11] (Кемерово, Новокузнецк), в работах с газовой промышленностью [13]. Принятый к патентованию метод анализа нитро-ПАУ в настоящее время используется в совместных с инженерами и технологами разработках путей снижения выбросов канцерогенных ПАУ и нитро-ПАУ с отработавшими газами двигателей транспортных средств, работающих на дизельном топливе.
Таким образом, идея JI. М. Шабада о применении экспрессных физико-химических методов анализа канцерогенов как в онкогигиене для профилактики рака, так и в онкоэкологии продолжает жить и реализовываться в меру наших возможностей в работах лаборатории, возглавляемой учеником Льва Манусовича профессором Г. А. Белицким. Наша лаборатория, а также другие в составе ОНЦ, руководят которыми ученики Льва Л40нусовича профессора А. П. Ильницкий,
В. С. Турусов и Л. Н. Пылев, стали преемницами традиций научной школы Л. М. Шабады.
Разработка и внедрение специфичных, селективных, точных и высокочувствительных методов определения химических канцерогенов различных классов в объектах окружающей человека среды и их использование для изучения реальной картины загрязнения, выбросов от источника загрязнения и оценки эффективности природоохранных мероприятий вносят существенный вклад в решение проблемы улучшения он-коэкологической ситуации и первичной профилактики рака.
Исследования 1998 г. выполнялись при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 98-04-49280)
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. 3,4-Бензпирен (метод квазилинейчатых спектров люминесценции с использованием добавок) //Госкомитет по гидрометеорологии М3 СССР. — М., 1991. — РД 5204.186—89 (на правах ГОСТа). — С. 311—319.
2. ГОСТ на метод определения бенз(а)пирена в кормовых дрожжах «Поприн» //Госстандарт, 1996.
3. Косой Г. X., Хесина А. Я. //Вестн. ОНЦ РАМН. — Приложение. — 1994. — С. 23—26.
4. Маховер М. С., Хитрово И. А., Хесина А. Я., Белицкий Г. А. //Экспер. онкол. — 1990. — Т. 12, № 4. — С. 25—28.
5. Методические указания по качественному и количественному определению полициклических ароматических углеводородов в продуктах сложного состава (утв. М3 в 1976 г.).
6. Методические указания по определению летучих N-нитроза-минов в продовольственном сырье и пищевых продуктах //Мук. 4. 4. 1.011—93.
7. Методические указания по определению летучих N-нитрозами-нов в детских сосках и пустышках, а также в других изделиях, изготовленных на основе латекса //Утверждено 01.01. М3 РФ, свидетельство об аттестации № 31.07 выдано Научно-исследовательским институтом резиновых и латексных изделий.
Концентрация В(а)Р в выбросах = 1,4 — 2,25 мкг/м3 С В(а)Р in discharge = 1.4-2.25 mcg/m3
Концентрация В(а)Р в саже = 0,8 мкг/г С B(a)Pinsoot = 0.8mcg/g
Рис. 3. Профили ПАУ в двигателя ГДТ-5, работающего на дизельном топливе.
Столбики со штриховкой — ПАУ в выбросах, с точками — в саже, а — пирен, Р; b — флуорантен, FI; с — бенз(а)антрацен, В(а)А; d — хризен, Chr; е — бенз(й)флуорантен, B(b)FI; f— бенз(/с)флу-орантен, B(k)FI; g — перилен, PI; h — бенз(а)пирен, В(а)Р; /' — бенз(е)пирен, В(е)Р;у — дибенз(а,Ь)антрацен, DB(a,h)A;k—ди-бенз(а,с)антрацен, DB(a,c)A; /— дибенз(д,h,/(перилен, DB(g,ft,/)PI; т — дибенз(а,/)пирен, DB(a,/')P; п— дибенз(а,Л)пирен, DB(a,ft)P; о — коронен, Сог.
Fig. 3. РАН profiles in GDT-5 diesel engine exhausts
Hatched bars show extract PAH; dotted bars show soot PAH.
8. Методические указания по определению канцерогенного углеводорода бенз(а)пирена в некоторых продуктах питания и упаковочных материалах (№ 1426—76 М3 СССР). — Санитарные правила и нормы. СанПин 2. 3. 2. 560—96. — М., 1997. — С. 196.
9. Обоснование ПДК и методы анализа N-нитрозодиметила-мина в атмосферном воздухе населенных мест //М3
№ 6055—91.
10. Хесина А. Я., Маховер М. С., Хитрово И. А. //Экспер. онкол. — 1989. — Т. 11, № 2. — С. 3—8.
11. Хесина А. Я., Косой Г. X., Оржех М. Ю. //Медицина труда и пром. экология. — 1994. — № 4. — С. 9—12.
12. Хесина А. Я., Колядич М. Н., Кривоилеева Л. В. и др. //Экспер. онкол. — 1996. — Т. 18, № 1. — С. 14—19.
13. Хесина А. Я., Кривошеева Л. В., Хитрово И. А. и др. //Вестн. ОНЦ РАМН. — 1997. — № 2. — С. 3—11.
14. Шабад Л. М. О циркуляции канцерогенов в окружающей среде. — М.,1973.
15. Шабад Л. М. //Гиг. и сан. — 1978. — № 2. — С. 121—122.
16. Grimmer G. Environmental Carcinogens: Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. — Ahmsburg, 1983. — P. 261.
17. IARC, Diesel and gasoline engine exhausts and some nitroarenes, JARC monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. — 1989. — Vol. 46. — P. 31—373.
18. Khesina A. Ja. Urban air pollution by carcinogenic and genotoxic polyaromatic Hydrocarbons in the former USSR //Inv. Health Perspectives. — October 1994. — Vol. 102, Suppl. 4. — P. 49—53.
19. McCann J., Choi E., Yamasaki E. et al. //Proc. natl. Acad. Sci. USA. — 1975, —Vol. 72, N 12.— P. 5135—5140.
20. Rosenkranz H. S. IIMutat. Res. — 1982. — Vol. 101. — P. 1—10.
21. Tanabe K., Matsushita H., Kuo Ch.-Т., Yamamiya Sh. Detemination of carcinogenic nitroarenes in airbom partic-uletes by high performance liquid chromatography /Л. Jpn. Soc. Air Polut. — 1986. — Vol. 21, N 6. — P. 535—544.
22. Tomkins B. A. Chromatographic detectors used for the determination of nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons, Nitrated Polycyclic Aromatic Hydrocarbons /Ed
С. M. White. — Heidelberg, 1985. — P. 87—120.
Поступила 27. 10. 97/Submitted 27. 10. 97
