Фитаза микромицета Aspergillusniger - потенциальный пищевой микроингредиент Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICAL-CHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY Оригинальная статья / Original article УДК 577.152.54:661.746.5

DOI: http://dx.doi.org/10.21285/2227-2925-2018-8-1 -82-91

ФИТАЗА МИКРОМИЦЕТА ASPERGILLUS NIGER -ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ПИЩЕВОЙ МИКРОИНГРЕДИЕНТ

© Н.М. Муста Оглы*, Н.Ю. Шарова***, А.Р. Юшкаускайте**

*Санкт-Петербургский университет информационных технологий, механики и оптики, 191002, Российская Федерация, г. Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, д. 91. "Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых добавок, 191014, Российская Федерация, г. Санкт-Петербург, Литейный пр., д. 551.

Цель - исследование активности фермента фитазы, синтезируемого штаммом Aspergillus niger Л-4 на сахарозоминеральной среде, определение наиболее оптимальных условий культивирования штамма, при которых синтезируется наибольшее количество фермента фитазы, с возможностью дальнейшего получения фермента фитазы в качестве дополнительного целевого продукта микробиологического синтеза. Активность фитазы, синтезируемой микромицетом Aspergillus niger Л-4, исследовалась колориметрическим методом, который основан на определении содержания неорганических фосфатов (РО4), образующихся в результате действия фермента фитазы на субстрат - фитат натрия (натриевую соль фитиновой кислоты) - при определенных стандартных условиях путем их связывания ванадиево-молибденовым реактивом с образованием фосфорнована-диево-молибденового комплекса желтого цвета. В результате ферментации штамма Aspergillus niger Л-4 в лимонную кислоту на сахарозоминеральной среде максимальная активность фитазы в нативном растворе для посевного мицелия возрастом 24 и 48 ч при разных объемах посевного мицелия (15 и 20% соответственно) и температуре процесса 29 0С составила 68,75 ед/см3; в мицели-альной массе фитазная активность в возрасте посевного мицелия 36 и 48 ч, объеме мицелиальной массы 15 и 20%, соответственно, и температуре процесса 29 0С составила 60,50 ед/г. Полученные данные могут быть применены для разработки способа получения двух пищевых микроингредиентов - лимонной кислоты и фитазы - в одном биотехнологическом процессе. Ключевые слова: Aspergillus niger, штамм Л-4, фитаза, лимонная кислота.

Формат цитирования. Муста Оглы Н.М., Шарова Н.Ю., Юшкаускайте А.Р. Фитаза микромицета Aspergillus niger - потенциальный пищевой микроингредиент // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2018. Т. 8, N 1. С. 82-91. DOI: 10.21285/2227-2925-2018-8-1-82-91

PHYTASE PRODUCED BY ASPERGILLUS NIGER AS A POTENTIAL FOOD MICRO-INGREDIENT

© N.M. Musta Ogly*, N.Yu. Sharova***, A.R. Yushkauskaite**

*Saint-Petersburg University of information technologies, mechanics and optics, 91, Lomonosov St., St.-Petersburg, 191002, Russian Federation **All-Russia Research Institute for Food Additives, 551, Liteynyi Ave., St.-Petersburg, 191014, Russian Federation

This research sets out to study the activity of the phytase enzyme synthesized by the Aspergillus niger L-4 fungus strain in sucrose-mineral medium and to determine optimal conditions for culturing this strain, under which the greatest amount of the phytase enzyme can be synthesized. The possibility of obtaining the phytase enzyme as an additional target product of microbiological synthesis is investigated. The activity of the phytase synthesized by the Aspergillus niger L-4 micromycete is studied by the colorimetric method. This method is based on the determination of inorganic phosphates (PO4) that form as a result of the phytase enzyme action on the sodium phytate substrate (sodium salt of phytic acid): under standard conditions the phosphates react with the vanadium-molybdenum reagent to yield a phosphor vanadium molybdenum complex of yellow colour. As a result of the fermentation of the Aspergillus niger L-4 strain into citric acid in a sucrose-mineral medium, the maximum activity of phytase in native solution constituted 68.75 units/cm3 for the inoculated mycelium aged 24 and 48 hours, at different volumes of inoculated mycelium (15 and 20%, respectively) and a temperature of 29 °C. The maximum activity of phytase in the mycelial mass reached 60.50 units/g for the inoculated

mycelium aged 36 and 48 h, at different volumes of inoculated mycelium (15 and 20%, respectively) and a temperature of 29 °C. The results can be used for the development of a method for obtaining two food micro-ingredients - citric acid and phytase - in a single biotechnological process. Keywords: Aspergillus niger, strain L-4, phytase, citric acid

For citation. Musta Ogly N.M., Sharova N.Yu., Yushkauskaite A.R. Phytase produced by Aspergillus niger as a potential food micro-ingredient. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied chemistry and biotechnology]. 2018, vol. 8, no. 1, pp. 82-91 (in Russian). DOI: 10.21285/2227-2925-2018-8-1-82-91

ВВЕДЕНИЕ

Организм человека требует много различных минеральных веществ, которые важны как для развития, так и профилактики болезней. Эти питательные вещества не вырабатываются естественно организмом и их нужно получать из своего рациона питания. Недостаток питательных веществ возникает, когда организм не усваивает необходимое количество питательных веществ, либо ему в усвоении этих питательных веществ мешают какие-то факторы. Их недостаток может привести к различным проблемам со здоровьем и может негативно отражаться на пищеварении, коже, привести к замедлению или неполноценному росту костей и т.д. [1].

Одним из наиболее необходимых нашему организму минеральных веществ является фосфор. Фосфор - один из основных минеральных элементов в питании прокариот и эукариот, составляет основу нуклеиновых кислот, фосфо-липидов, молекул-энергоносителей. Однако большая часть почвенного фосфора представлена фитатом - недоступной для питания высших эукариот формой фосфорорганических соединений. Полноценному усвоению минералов может препятствовать увеличенное содержание фитиновой кислоты в организме человека. Анализ научно-технической информации показал, что биодоступность необходимых минеральных веществ в пищевых продуктах из зерновых культур, в т. ч. в хлебобулочных изделиях, зависит от содержания фитиновой кислоты, которая снижает их пищевую ценность. В организме человека и животных усвоение минеральных веществ затрудняют нерастворимые соли - хелаты, образуемые фитиновой кислотой в комплексе с минеральными веществами. В семенах злаковых, бобовых и масличных культур содержится большая часть общего фосфора (60-80%) [2].

В сбалансированном питании у здоровых людей фитиновая кислота редко приводит к дефициту минеральных веществ. Поэтому будет не совсем правильным сказать, что некоторые продукты, содержащие фитиновую кислоту, вредны для здоровья, поскольку потенциальная польза от этих продуктов превышает возможные негативные последствия бесчисленное количество раз. Одним из путей решения про-

блемы дефицита фосфора является использование специфических ферментов фитаз микробного происхождения, способных расщеплять фитаты до легко усваиваемых остатков фосфорной кислоты и мио-инозитола. Щелочные ß-пропеллерные фитазы обладают высокой субстратной специфичностью и термостабильностью, что делает их наиболее перспективными для использования в различных направлениях биотехнологии. Высвобождение минеральных веществ может происходить в результате гидролитического расщепления эфирных связей фитиновой кислоты фитазами растительного, животного или микробного происхождения. Специфичность действия фитаз и их физико-химические свойства определяют направления их использования в различных отраслях промышленности [3].

В последние годы появилось немалое количество обзорных статей по фитиновой кислоте и ее значению в продуктах питания. Наиболее подробная информация собрана в книге фон Косгроув [4] об инозитол фосфате и ее химии, биохимии и физиологии; более поздние обзоры принадлежат Черян [5], Редди [6] и др.

В данном исследовании [9] авторы изучали технологические свойства ферментного препарата (ФП) в хлебопечении различными способами приготовления теста. ФП использовался в исследовании авторов в количестве от 0,001% до 0,300% от массы муки. Авторы исследования установили, что при безопарном методе приготовления теста ФП дозировкой от 0,001-0,010% не оказывает никакого влияния на качество хлеба. Увеличение расхода добавки увеличивало и удельный объем хлеба на 4-33% в зависимости от дозировки, снижало формоустойчи-вость на 8-27% по сравнению с контролем. 0,15% ФП при опарном способе сократило время расстойки на 16-29%, в особенности, как отмечают авторы, при дозировании добавки в опару (29%).

Для пищевой отрасли наиболее востребованы ферменты, действующие при низких значениях рН. К ним относятся фитазы, синтезируемые представителями рода Aspergillus, которые являются промышленными продуцентами многочисленного ряда пищевых микроингредиентов [10].

Штаммы микромицета Aspergillus niger продуцируют различные ферменты. Например, селекционированные во Всероссийском научно-исследовательском институте пищевых добавок (ФГБНУ ВНИИПД) штаммы наряду с лимонной кислотой, являющейся основным целевым продуктом, продуцируют амилолитические ферменты, глюкоамилазу, фитазу. Это позволяет рассматривать их в качестве перспективных продуцентов для создания технологий, предусматривающих получение в одном технологическом процессе не одного целевого продукта, а двух и более, то есть разрабатывать «совмещенные» технологии [11].

В связи с указанным выше представляет интерес исследование биосинтеза фитазы мик-ромицетом Aspergillus niger штаммом Л-4, селекционированным в ФГБНУ ВНИИПД для ферментации мелассы в лимонную кислоту, на различных углеводсодержащих средах [12].

Целью данной работы являлось исследование активности фермента фитазы, синтезируемого штаммом Aspergillus niger Л-4 на саха-розоминеральной среде, определение наиболее оптимальных условий культивирования штамма при которых синтезируется наибольшее количество фермента фитазы, с возможностью дальнейшего получения фермента фитазы в качестве дополнительного целевого продукта микробиологического синтеза.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект исследования - штамм микромицета Aspergillus niger Л-4, селекционированный в ФГБНУ ВНИИПД для ферментации мелассы [13].

Ферментацию проводили периодическим способом по технологии концентрированных сред в условиях шейкера-инкубатора Multitron (INFORS, Швейцария) в колбах вместимостью 750 см3.

Для исследований в качестве углеводного субстрата использовали сахарозоминеральную среду (ГОСТ 32159-2013). Источником азота являлся нитрат аммония (ГОСТ 22867-77), источником фосфора - калий фосворнокислый одно-замещенный (ГОСТ 4198-75).

Состав приготовленной среды для ферментации, г/дм3: углеводный субстрат - 150; нитрат аммония (NH4NO3) - 2,5; сульфат магния семиводный (MgSO4-7H2O) - 0,25;фосфат калия однозамещенный (KH2PO4) - 0,16; рН 6,5.

Процесс проводили при температуре (36 ± 1) оС - на стадии получения посевного мицелия, при температуре от (29 ± 1) оС до (34 ± 1) оС - на стадии ферментации. Возраст посевного материал был равен 24, 36 и 48 ч. Количество мицелия к объему исходной питательной среды составляло 15% и 20%.

Фитазную активность оценивали колориметрическим методом при длине волны от 400

до 415 нм в модификации. Модификация обусловлена тем, что значение рН исследуемых нативных растворов находится в диапазоне от 1,7 до 2,4, который ниже уровня рН-оптимума проявления фитазной активности микромицета. Ранее проведенные исследования показали, что при таких значениях рН активность фитазы составляет 0,5-0,8 ед/см3 [14]. Для определения фитазной активности в условиях, оптимальных для проявления действия фермента, растворы подщелачивали раствором гидроокиси натрия (0,1 М) до рН = (5,5 ± 0,1). В нативных растворах, полученных в результате культивирования штамма-кислотообразователя микромицета Aspergillus niger Л-4 на мелассной и сахарозо-минеральной среде, фитазная активность находилась на уровне от 1,1 до 2,5 ед /см3.

Содержание кислоты определяли методом титрования слабой кислоты сильным основанием.

Обработку экспериментальных данных проводили с помощью методов математической статистики и программ Excel XP.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ФГБНУ ВНИИПД ранее проводилась оценка уровня фитазной активности в нативных растворах, полученных в результате культивирования штаммов микромицета Aspergillus niger - продуцентов лимонной кислоты. Фитазная активность выявлена при ферментации мелассной среды, традиционно используемой в промышленном производстве.

Биосинтез целевых метаболитов в существенной мере зависит от возраста и количества посевного мицелия, температуры ферментации.

Исследование динамики интрацеллюляр-ной фитазной активности при культивировании продуцента лимонной кислоты - штамма Aspergillus niger Л-4 на сахарозоминеральной среде показало, что независимо от возраста посевного мицелия в процессе ферментации в течение 96 ч показатель сохранялся практически на одном уровне (рис. 1-3). К 120 ч процесса активность снижалась незначительно. Более предпочтительна температура 29 оС и 32 оС. При температуре 34 оС фитазная активность была в 1,2-2 раза ниже.

На рисунке 3 представлена зависимость интрацеллюлярной активности фермента, полученная в условиях, которые обеспечивают более высокую фитазную активность для 48-часового посевного мицелия, а именно его количество, вносимое на ферментацию, составляет 20% от объема исходной питательной среды.

На рис. 4 и 5 представлена динамика экстрацеллюлярной фитазной активности для 24 и 36-часового посевного мицелия. При исследовании экстрацеллюлярной фитазной активности обнаружено, что фитазная активность

для 36-часового посевного мицелия при температуре 34 °С сравнительно ниже по сравнению с 24-часовым мицелием в количестве 15% от исходной питательной среды и с 48-часовым мицелием в количестве 20% от исходной питательной среды. Для 24 и 36-часового посевного мицелия пик фитазной активности наблюдался на третьи сутки процесса ферментации при 29 °С и 32 оС.

В исследовании динамики экстрацеллю-лярной фитазной активности 48-часового посевного мицелия и объеме посевного мицелия 20% на третьи сутки ферментации высокая активность наблюдалась при 29 °С. Для температур 32 °С и 34 °С обнаружилось повышение активности до 3-х суток, а затем снижение активности фермента на одном уровне.

Рис. 1. Зависимость интрацеллюлярной фитазной активности при культивировании продуцента лимонной кислоты - штамма Aspergillus niger Л-4 на сахарозоминеральной среде. Возраст посевного мицелия - 24 ч, количество посевного мицелия 15% от объема исходной питательной среды (усредненные данные)

Fig. 1. Time course of intracellular phytase activity when cultivating the citric acid producer (Aspergillus niger strain L-4) on a sugar-mineral environment. The age of the inoculum is 24 h, the amount of inoculated mycelium is 15% of the volume of the initial nutrient medium (averaged data)

к

<я

X

со

<я

Is |_

-& ч

к щ

с; о 2 аз

sii

я

го

CP

80 70 60 50 40 30 20 10 0

24ч 48ч 72ч

Время, сут

96ч

120ч

Рис. 2. Зависимость интрацеллюлярной фитазной активности при культивировании продуцента лимонной кислоты - штамма Aspergillus niger Л-4 на сахарозоминеральной среде. Возраст посевного мицелия - 36 ч, количество посевного мицелия 15% от объема исходной питательной среды (усредненные данные)

Fig. 2. Time course of intracellular phytase activity when cultivating the citric acid producer (Aspergillus niger strain L-4) on a sucrose-mineral medium. The age of the seed mycelium is 36 h, the amount of seed mycelium is 15% of the volume of the initial nutrient medium (averaged data)

<я

X

со

<я

80

70

60

к щ ™ -о50

о; ц

2 ц

ц

CD

<я

CP

ГС30

20 10 0

29 °C

32 °C

34 °C

24ч

48ч

72ч Время,сут

96ч

120ч

Рис. 3. Зависимость интрацеллюлярной фитазной активности при культивировании продуцента лимонной кислоты - штамма Aspergillus niger Л-4 на сахарозоминеральной среде. Возраст посевного мицелия - 48 ч, количество посевного мицелия 20% от объема исходной питательной среды (усредненные данные)

Fig. 3. Time course of intracellular phytase activity when cultivating the citric acid producer (Aspergillus niger strain L-4) on a sugar-mineral environment. The age of the seed mycelium is 48 h, the amount of seed mycelium is 20% of the volume of the initial nutrient medium (averaged data)

60

я

TO X

CO

TO

-M

К CI

TO CD X

CP -0

£ Б

I §

^ CO

^ s

CD H

rn я р

с

О

50

40

30

20

10

29 °C

32 °C

34 °C

24ч 48ч 72ч 96ч 120ч

Время, сут

0

Рис. 4. Зависимость экстрацеллюлярной фитазной активности при культивировании продуцента лимонной кислоты - штамма Aspergillus niger Л-4 на сахарозоминеральной среде. Возраст посевного мицелия - 24 ч, количество посевного мицелия 15% от объема исходной питательной среды (усредненные данные)

Fig. 4. Time course of extracellular phytase activity when cultivating the citric acid producer (Aspergillus niger strain L-4) on a sugar-mineral environment. The age of the seed mycelium is 24 h, the amount of inoculated mycelium is 15% of the volume of the initial nutrient medium

(averaged data)

я

го

X

со

го

-&Р

О

е

50 45 40 35 30 25 20 15 10

24ч 48ч 72ч 96ч

Время, сут

120ч

29 °C 32 °C 34 °C

Рис. 5. Зависимость экстрацеллюлярной фитазной активности при культивировании продуцента лимонной кислоты - штамма Aspergillus niger Л-4 на сахарозоминеральной среде. Возраст посевного мицелия - 36 ч, количество посевного мицелия 15% от объема исходной питательной среды (усредненные данные)

Fig. 5. Time coutse of extracellular phytase activity when cultivating the citric acid producer (Aspergillus niger strain L-4) on a sucrose-mineral medium. The age of the seed mycelium is 36 h, the amount of seed mycelium is 15% of the volume of the initial nutrient medium (averaged data)

На рис. 6 представлена динамика экстрацеллюлярной фитазной активности 48-часового посевного мицелия, количество посевного мицелия

к объему питательной среды составило 20%.

В таблице приведены экспериментальные данные по определению интрацеллюлярной и

я

го

X

со

го

еб

К Ч

ГО tu X

CP -Q

£ Б

I -

^ СО ^ S

ет

го

CP

О

60

50

40

30

20

10

29 °C 32 °C 34 °C

24ч 48ч 72ч 96ч

Время, сут

120ч

5

0

0

Рис. 6. Зависимость экстрацеллюлярной фитазной активности при культивировании продуцента лимонной кислоты - штамма Aspergillus niger Л-4 на сахарозоминеральной среде. Возраст посевного мицелия - 48 ч, количество посевного мицелия 20% от объема исходной питательной среды (усредненные данные)

Fig. 6. Time course of extracellular phytase activity when cultivating the citric acid producer (Aspergillus niger strain L-4) on a sucrose-mineral medium. The age of the seed mycelium is 48 h, the amount of seed mycelium is 20% of the volume of the initial nutrient medium (averaged data)

00 00

Результаты ферментации сахарозоминеральной среды (основная ферментация, конец процесса 120 ч; усреднённые данные) Results of fermentation of the sucrose-mineral environment (basic fermentation, process end 120 h, averaged data)

e

с

3 0) u 0)

с «

0 §

с ■С <D

3 0)

ь

<D |

С (о

CQ'

(D **

1

a

0

3

<D

1 ■E

С §

tr i £ £<

a с

£

<D ©

О

c<

Условия культивирования Основные показатели

Объем посевного мицелия, % к объёму исходной Содержание белка Фита зная активность

Возраст посевного Температура, °с Нативный раствор, мг/см3 Мицелиальная масса, мг/г Количество общей кислоты, Нативный раствор Мицелиальная масса

мицелия, ч питательной среды г / колба ед'см3 ед/мгбелка ед'г ед/мг белка

29 15 20 4,79 6,36 3,26 4,96 6,65 5,30 68,75 15,63 14,35 2,46 55,60 12,30 17,05 2,48

24 32 15 20 4,01 3,85 3,13 2,85 7,60 7,95 40,62 31,25 10,13 8,12 31,90 28,70 10,19 10,07

34 15 2,91 1,95 7,09 15,62 5,37 10,20 5,23

20 2,28 1,16 7,40 25,10 11,01 15,10 13,02

29 15 20 3,06 3,18 2,86 2,66 4,83 4,95 62,50 46,88 20,42 14,74 60,50 43,40 21,15 16,31

36 32 15 20 5,26 2,06 4,96 1,85 5,76 7,30 40,63 50,0 7,74 24,27 36,60 44,0 7,38 23,78

34 15 20 2,20 3,46 2,05 3,07 7,08 7,71 35,70 30,50 16,23 8,82 30,70 28,0 14,98 9,12

29 15 20 2,28 2,29 2,16 1,96 5,96 5,96 31,25 68,75 13,71 30,02 27,0 60,50 12,5 30,87

48 32 15 3,73 3,52 6,85 25,0 6,70 20,20 5,74

20 4,95 4,15 7,80 43,75 8,84 40,10 9,66

34 15 20 2,36 3,76 2,02 2,83 7,35 7,39 15,60 18,90 6,61 5,02 12,90 17,0 6,39 6,01

e

s

OJ

s

О ><

.с m

о >

iQ

0

01

E

>

iQ

01

S

О ^

о

экстрацеллюлярной активностей фитазы, синтезируемой грибом Aspergillus niger Л-4, в конце процесса ферментации.

Результаты исследований показали, что наибольшая фитазная активность независимо от возраста посевного мицелия установлена при температуре культивирования продуцента 29 °С. Различия выявлены в количестве посевного мицелия, вносимого на стадии ферментации и способствующего достижению повышенной фитазной активности. Так, для достижения повышенной фитазной активности и 24-часовой, и для 36-часовой посевной мицелий необходимо вносить в ферментационную среду в количестве 15 % от объема исходной питательной среды, а 48-часовой посевной мицелий - в количестве 20 % от объема исходной питательной среды. По-видимому, это обусловлено физиологическими особенностями продуцента.

Наибольшее содержание белка присутствовало в нативном растворе и мицелиальной массе при ферментации саха-розоминераль-ной среды 24 - часовым посевным мицелием при температуре 29 °С. Количество мицелия при этом составляло 20% от объема исходной питательной среды. При культивировании продуцента в возрасте посевного мицелия, равному 36 ч, наибольшее содержание белка в на-тивном растворе и мицелиальной массе обнаружено при температуре 32°С. Количество мицелия при этом составило 15% от объема исходной питательной среды. При культивировании 48-часового посевного мицелия наибольшее количество белка выявлено также при температуре 32 °С, но с большим количеством посевного мицелия.

Количество синтезированной грибом кислоты изменялось в зависимости от возраста мицелия и температуры ферментации. Наилучшие результаты получены при температуре ферментации 32 °С и 34 °С.

1. Редкозубов О. Фитаза. Что изменилось за последние 15 лет // Комбикорма. 2014. N 12. С. 71-74.

2. Никифорова Т.А., Шарова Н.Ю., Губа-сова Т.Н. Биотехнология и производство пищевых добавок // Хранение и переработка сель-хозсырья. 2014. N 8. С. 24-26.

3. Балабан Н.П., Сулейманова А.Д., Вале-ева Л.Р., Шакиров Е.В., Шарипова М.Р. Структурные особенности и механизм катализа ß-пропеллерных фитаз бацилл (Обзор) // Биохимия. 2016. Т. 81, N 8. С. 1011-1015.

4. Cosgrove D.J., Irving. G.C.J. Inositol Phosphates: Their Chemistry, Biochemistry and Physiology (Studies in Organic Chemistry). Amsterdam: Elsevier, 1980. P. 204.

5. Cheryan M. Phytic acid interactions in food systems // Critical Reviews in Food Science and

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В подведении промежуточных итогов данной работы следует отметить, что наибольшая фитазная активность вне зависимости от возраста посевного мицелия определена при температуре культивирования продуцента 29 °С. Различия наблюдались в количестве посевного мицелия, способствовавшего повышению активности фермента, вносимого на стадии ферментации. Установлен необходимый объем 24-часового и 36-часового вносимого посевного мицелия в количестве 15 % от объема исходной питательной среды в ферментационную среду для достижения повышенной активности фитазы, а 48-часовой посевной мицелий - в количестве 20 % от объема исходной питательной среды. Это может быть обусловлено физиологическими особенностями продуцента.

В сравнительном аспекте наибольшее количество синтезированной грибом кислоты происходило при повышенных температурах (32 °С и 34 °С). Это по-видимому, обусловлено тем, что при повышении температуры ферментации активизируются биохимические процессы, направленные на биосинтез основного метаболита - лимонной кислоты.

Активность фитазы в нативных растворах составляла от 15,63 до 68,75 ед/см3. В мицелии же при таком рН интрацеллюлярная активность фермента составляла от 10,2 до 60,5 ед/г мицелиальной массы. По данным этой работы наилучшим условием для культивирования штамма Aspergillus niger Л-4 на сахарозоминеральной среде являются температура 29 0С и количество посевного мицелия 15% от объема исходной питательной среды.

Для увеличения активности фитазы при продуктивном биосинтезе лимонной кислоты необходимо подобрать состав питательной среды и режимы ферментации. Исследования следует продолжить в данном направлении.

КИЙ СПИСОК

Nutrition. 1980. N 13 (4). P. 297-305. https://doi.org/10.1080/10408398009527293

6. Salunkhe DK, Jadhav SJ, Kadam SS, Chavan JK Chemical, biochemical, and biological significance of polyphenols in cereals and legumes // Advances in Food Research. 1982. N 28. P. 192. https://doi.org/10.1080/10408398209527350

7. Невский А.А., Дремучева Г.Ф., Бессонова Н.Г. Технологические свойства ферментного препарата с фитазной активностью в производстве хлебобулочных изделий из пшеничной муки // Тр. 8 междунар. научно-практ. конф. «Приоритетные направления развития науки и образования». Чебоксары, 2016. С. 216-217.

8. Шарова Н.Ю., Сафронова В.И. Генетическая паспортизация штамма Aspergillus niger Л-4 - промышленного продуцента лимонной кислоты с помощью геномного AFLP-фингер-

принтинга // Сельскохозяйственная биология. 2016. Т. 51, N 2. С. 204-212.

9. Пат. N 2294371, Российская Федерация. Способ получения лимонной кислоты и комплекса кислотостабильных амилолитических ферментов / Н.Ю. Шарова. 2007.

10. Пат. N 2366712, Российская Федерация. Способ получения лимонной кислоты, альфа-амилазы и глюкоамилазы / Н.Ю. Шарова, Т.А. Позднякова, Т.В. Выборнова, Д.Х. Ку-лев. 2009.

11. Пат. N 2088658, Российская Федерация. Штамм гриба Aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты / Н.В. Красикова, Т.А. Никифорова, А.В. Галкин, В.М. Финько. 1997.

12. Пат. N 2428481, Российская Федерация. Способ получения лимонной кислоты / Т.В. Выборнова, Т.А. Никифорова, В.П. Комов, Л.Б. Пиотровский, М.А. Думпис, Е.В. Литасова. 2011.

13. Пат. N 975799, Российская Федерация. Штамм гриба Aspergillus niger Л-4 - продуцент лимонной кислоты / В.П. Ермакова, Е.Я. Щербакова, И.М. Василинец, В.М. Финько, Т.Н. Шушкевич. 1982.

14. Муста О.Н., Шарова Н.Ю. Фитаза Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты как потенциальный пищевой микроингредиент // Сб. докл. 7 межд. научно-техн. конф.«Казахстан - холод 2017». Алматы, 2017. С.174-176.

REFERENCES

1. Redkozubov O. Phytase. What has changed over the past 15 years. Kombikorma [Mixed feed]. 2014, no. 12, pp. 71-74. (in Russian)

2. Nikiforova T.A., Sharova N.Yu., Gubasova T.N. Biotechnology and production of food additives. Khranenie i pererabotka sel'khozsyr'ya [Storage and processing of agricultural raw materials]. 2014, no. 8, pp. 24-26. (in Russian)

3. Balaban N.P., Suleimanova A.D., Valeeva L.R., Shakirov E.V. Structural features and mechanism of catalysis of p-propellant phytases of bacilli (Review). Biokhimiya [Biochemistry]. 2016, vol. 81, no. 8, pp. 1011-1020. (in Russian)

4. Cosgrove D.J., Irving G.C.J. Inositol Phosphates: Their Chemistry, Biochemistry and Physiology (Studies in Organic Chemistry). Amsterdam: Elsevier, 1980, 204 p.

5. Cheryan M. Phytic acid interactions in food systems. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 1980, no. 13 (4), pp. 297-305. https://doi.org/10.1080/10408398009527293/

6. Salunkhe D.K., Jadhav S.J., Kadam S.S., Chavan J.K. Chemical, biochemical, and biological significance of polyphenols in cereals and legumes. Advances in Food Research. 1982, no. 28, pp. 1-92. https://doi.org/10.1080/ 10408398209527350/

7. Nevskii A.A., Dremucheva G.F., Bessonova N.G. Tekhnologicheskie svoistva fermentnogo preparata s fitaznoi aktivnost'yu v proizvodstve khlebobulochnykh izdelii iz pshenichnoi muki [Technological properties of the enzyme preparation with phytase activity in the production of bakery products from wheat flour]. Trudy 8 mezhdunarod-noi nauchno-prakticheskoi konferentsii «Prior-itetnye napravleniya razvitiya nauki i obra-zovaniya» [Proc. 8-th Int. Sci. Pract. Conf. «Priority directions of development of science and education»]. Cheboksary, 2016, pp. 216-217.

8. Sharova N.Yu., Safronova V.I. Genetic certification of the strain of Aspergillus niger L-4 - an

industrial producer of citric acid by genomic AFLP-fingerprinting. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology]. 2016, vol. 51, no. 2, pp. 204-212. (in Russian)

9. Sharova N.Yu. Sposob polucheniya limonnoi kisloty i kompleksa kislotostabil'nykh ami-loliticheskikh fermentov [Method for the production of citric acid and a complex of acid-stable amyloly-tic enzymes]. Patent RF, no. 2294371, 2007.

10. Sharova N.Yu., Pozdnyakova T.A., Vy-bornova T.V., Kulev D.Kh. Sposob polucheniya limonnoi kisloty al'fa-amilazy i glyukoamilazy [Method for the production of citric acid, alpha-am-ylase and glucoamylase]. Patent RF, no. 2366712, 2009.

11. Krasikova N.V., Nikiforova T.A., Galkin A.V., Fin'ko V.M. Shtamm griba Aspergillus niger -produtsent limonnoi kisloty [The strain of the fungus Aspergillus niger is a producer of citric acid]. Patent RF, no. 2088658,1997.

12. Vybornova T.V., Nikiforova T.A., Komov V.P., Piotrovskii L.B., Dumpis M.A., Litasova E.V. Sposob polucheniya limonnoi kisloty [Method for the production of citric acid]. Patent RF, no.2428481, 2011.

13. Ermakova V.P., Shcherbakova E.Ya., Vasilinets I.M., Fin'ko V.M., Shushkevich T.N. Shtamm griba Aspergillus niger L-4 - produtsent limonnoi kisloty [Strain of fungus Aspergillus niger L-4 - producer of citric acid]. Patent RF, no. 975799,1982.

14. Musta O.N., Sharova N.Yu. Fitaza Asper-gillus niger - produtsenta limonnoi kisloty kak po-tentsial'nyi pishchevoi mikroingredient [Phytase Aspergillus niger - a producer of citric acid as a potential food microinject]. Sbornik dokladov 7 mezhdunarodnoi nauchno-tekhnicheskoi konferentsii «Kazakhstan-kholod 2017» [Proc. 7-th Int. Sci. Techn. Conf. «Kazakhstan-Colfness 2017»]. Almaty, 2017, 174-176. (in Russian)

Критерии авторства

Муста Оглы Н.М., Шарова Н.Ю., Юшкаускайте А.Р. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Муста Оглы Н.М., Шарова Н.Ю., Юшкаускайте А.Р. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации

Наргуль Муста Оглы

Санкт-Петербургский университет информационных технологий, механики и оптики М.н.с.

nargul_m@mail.ru Наталья Ю. Шарова

Санкт-Петербургский университет информационных технологий, механики и оптики Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых добавок Д.т.н., доцент, ВРИО директора natalya_sharova1 @mail.ru

Антонина Р. Юшкаускайте

Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых добавок Инженер-исследователь vniipakk55@mail.ru

Поступила 05.09.2017

Contribution

Musta Ogly N.M., Sharova N.Yu., Yushkauskaite A.R. carried out the experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Musta Ogly N.M., Sharova N.Yu., Yushkauskaite A.R. have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.

Conflict of interests

The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.

AUTHORS' INDEX Affiliations

Musta Ogly N.M.

Saint-Petersburg University of information technologies, mechanics and optics Junior Researcher nargul_m@mail.ru

Natalia Yu. Sharova

Saint-Petersburg University of information technologies, mechanics and optics All-Russian Research Institute for Food Additives

Doctor of Engineering, Associate Professor, Acting Director natalya_sharova1@mail.ru

Antonina R. Yushkauskaite

All-Russian Research Institute for Food Additives Engineer-researcher vniipakk55@mail.ru

Received 05 September 2017