CC BY
103
%
604020". о--20-40-60-80-100-
о о
сь^те^Б
ооо о 0 о
о о
100
200
300
400
+1,96 SD
14,1% ° Среднее
-28,3 -1,96 SD
-70,6%
500
600
Рис. 5. Диаграмма Бленда-Альтмана. Относительные различия в процентах между результатами определения концентрации ЦсА методами ВЭЖХ-МС/МС и ФПИА Abbott TDX по отношению к средним результатам.
По горизонтали - среднее значение от ВЭЖХ-МС/МС и ФПИА (в нг/мл); по вертикали - ВЭЖХ-МС/МС-ФПИА (в нг/мл) / среднее (в %).
метода ФПИА Abbott TDX к метаболитам. Вклад метаболитов в значения, полученные методом ФПИА Abbott TDX, может быть оценен по средней разности значений на диаграмме Бленда-Альтмана. Умеренное значение коэффициента корреляции двух методов вызвано, по всей видимости, различным накоплением метаболитов ЦсА у пациентов, что влияет на результаты измерения концентрации нативного ЦсА методом ФПИА Abbott TDX.
Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о более высокой селективности метода ВЭЖХ-МС/МС к ЦсА в присутствии его метаболитов по отношению к методу ФПиА Abbott TDX.
Заключение. Разработан метод определения содержания ^A в крови человека с помощью ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором типа "ионная ловушка". Предлагаемый метод обеспечивает простоту и универсальность анализа при достижении достаточной чувствительности и селективности за счет исключения необходимости во внутреннем стандарте и онлайн-экстракции, а также благодаря снижению требований к техническим характеристикам используемого масс-спектрометра.
эффициент детерминации r2 = 0,765. Диаграмма рассеяния представлена на рис. 4.
Степень согласованности измерений концентрации ^A методами ВЭЖХ-МС/МС и ФПИА Abbott TDX оценивали методом Бленда-Альтмана (рис. 5).
Средняя разность величины измерений между методами ВЭЖХ-МС/МС и ФПИА Abbott TDX составила 28,3% в пользу последнего. Значения разности концентраций, определенные двумя методами, с единичными исключениями укладываются в пределы X ± 2о, подтверждая хорошую согласованность результатов измерения.
Результаты сопоставления средних значений концентраций ^A в крови пациентов, полученных двумя методами, и наклон прямой на диаграмме рассеяния указывают на тенденцию к превышению значений, полученных методом ФПИА Abbott TDX, над значениями, полученными предлагаемым методом ВЭЖХ-МС/МС, что соответствует ожидаемому эффекту от кросс-селективности
ЛИТЕРАТУРА
1. Готье С.В., Столяревич Е.С., Томилина Н.А., Мойсюк Я.Г. Механизмы иммуносупрессии и основные группы иммуносупрес-сантов. В кн.: Готье С.В., ред. Иммуносупрессия при трансплантации солидных органов. М.; Тверь: Триада-Х; 2011: 11-44.
2. 0zbayA., Karamperis N, J0rgensen K. A review of the immunosuppressive activity of cyclosporine metabolites: new insights into an old issue. Curr. Clin. Pharmacol. 2007; 2(3): 244-8.
3. Roberts N.B., Dutton J., Higgins G., Allars L. Evaluation of a novel semi-automated HPLC procedure for whole blood cyclosporin A confirms equivalence to adjusted monoclonal values form Abbott TDx. Clin. Chem. Lab. Med. 2005; 43(2): 228-36.
4. Seger C., Tentschert K., Stoggl W., Griesmacher A., Ramsay S.L. A rapid HPLC-MS/MS method for simultaneous quantification of cy-closporine A, tacrolimus, sirolimus and everolimus in human blood samples. Nat. Protocols. 2009; 4(4): 526-33.
5. Yatscoff R.W., CopelandK.R., Faraci C.J. Abbott TDx monoclonal antibody assay evaluated for measuring cyclosporine in whole blood. Clin. Chem. 1990; 36(11): 1969-73.
Поступила 09.12.11
© В.Г. БУЛыГИН, 2013
УДК 616.36-002.2-022-053.2-07:616.153.1+616-008.931
В.Г. Булыгин
ферменты плазмы крови и ткани печени у детей в зависимости от стадии хронизации вирусного гепатита C
ФГБУ "НИИ медицинских проблем Севера" СО РАмН, Красноярск
Определение активности ферментов в ткани печени и в цельной крови у детей 12-16 лет, больных хроническим вирусным гепатитом С, показало, что уровень метаболических параметров при 3-й стадии хронизации процесса свидетельствует о более глубоком, чем при 2-й стадии, функциональном поражении клеток печени и более выраженных нарушениях метаболизма. Характер соотношения уровней активности ферментов в печени и крови детей при 2-й и 3-й стадиях хронизации позволяют утверждать, что энзиматические показатели крови отражают специфику и направленность изменений метаболических процессов в клетках печени при хроническом гепатите С, что может являться основой для разработки новых диагностических подходов при этой патологии.
Ключевые слова: ферменты, ткани печени, плазма крови, вирусный гепатит С, дети
V.G. Bulygin
THE ENZYMES OF BLOOD PLASMA AND HEPATIC TISSUE IN CHILDREN DEPENDING OF STAGE OF TRANSITION TO CHRONIC STATE OF VIRAL HEPATITIS
The detection of activity of enzymes in hepatic tissue and whole blood in children aged 12-16 years with chronic viral hepatitis was carried out. The results of study demonstrated that the level of metabolic parameters during the third stage of transition of disease to the chronic .state as compared with the second sstage testifies the presence of deeper functional affection of hepatic cells and more expressed metabolism disorders. The character of ratio of levels of activity of enzymes in liver and blood of children under the second and third stages of transition of disease to chronic state was analyzed. It is affirmed that the blood enzymatic indicators reflect specificity and direction of alterations of metabolic processes in hepatic cells under chronic hepatitis C. This process can be used as a basis for development of new diagnostic approaches to this form ofpathology.
Key words: enzyme, hepatic tissue, blood plasma, viral hepatitis C, children
Хронический вирусный гепатит С является одной из актуальных проблем мировой медицины в связи с его широким распространением и возможностью развития неблагоприятных исходов [1, 3, 9]. В последние годы эта проблема приобретает все возрастающее значение в педиатрии [8], так как многие вопросы, связанные, в частности, с особенностями патогенеза хронической НСУ-инфекции у детей и подростков остаются нерешенными.
Известно, что проявление в полном объеме функциональных возможностей клеток живого организма в значительной мере определено их метаболизмом, его изменениями в зависимости от специфики патологического процесса. В то же время при любых инфекционно-воспалительных заболеваниях изменяются гомеоста-тические параметры организма, в значительной мере определяемые направленностью протекающих в нем метаболических процессов [2, 7].
Предполагается, что показатели активности метаболических ферментов, определяемые в цельной периферической крови, отражают направленность и интенсивность обменных процессов, протекающих во всем организме. В связи с этим значительный интерес представляет выявление особенностей метаболизма в ткани печени при хроническом вирусном гепатите С, устанавливаемых по показателям активности ферментов в цельной крови больных.
Цель наших исследований - определение показателей активности ферментов в клетках печени и цельной крови у детей, больных хроническим вирусным гепатитом С, и выявление зависимости этих параметров от стадии хронизации заболевания.
Материалы и методы. Обследованы 22 ребенка в возрасте от 12 до 16 лет с диагнозом хронический вирусный гепатит С который устанавливали в условиях специализированного стационара с помощью набора стандартных клинико-биохимических и иммуноферментных методов исследования и подтверждали морфологически после проведения (под контролем УЗИ) пункционной биопсии печени с учетом гистологического индекса степени активности (ГИСА) и гистологического индекса стадии хронизации (ГИСХ) [6]. У 12 детей определили 2-ю стадию хронизации процесса (слабая или умеренная степень активности с умеренно выраженными фиброзными изменениями в печени) и еще у 10 - 3-ю стадию хронизации (слабая или умеренная степень активности с тяжелым фиброзом в печени).
Материал, полученный при биопсиях, использовали и для определения в ткани печени активности внутриклеточных ферментов биолюминесцентным методом [5]. Определяли следующие показатели: активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), НАД- и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ), НАД- и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназ (НАДГДГ и НАДФГДГ), НАДи НАДФ-зависимой малатдегидрогеназ (НАДМДГ и НАДФМДГ), а также глутатионредуктазы (ГР). Аналогичные исследования были проведены и в цельной периферической крови, взятой из пальца в количестве 0,02 мл у этих же детей. Активность ферментов в ткани печени выражалась в мкЕ на 1 мкг ткани (мкЕ/мкг), в крови - в мкЕ на 1 мкл крови (мкЕ/мкл).
Полученные данные обработаны статистически с применением пакета прикладных программ Statistica 6,0 и рекомендаций по их использованию в биологии и медицине [4]. В_таблицах представлены среднегрупповые показатели (X ) и ошибка средней (т). Оценка достоверности различий проводилась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (и).
Результаты и обсуждение. В результате проведенных исследований выявлены достоверные различия между ферментными показателями ткани печени в группах, различающихся между собой по стадиям хрониза-ции инфекционного процесса (табл. 1).
Например, активность Г6ФДГ при 3-й стадии хрони-зации выше, чем при 2-й: 22,16 ± 5,02 и 9,86 ± 3,09, р < 0,05. Также более высоким при 3-й стадии, по отно-
Таблица 1
Активность ферментов (мкЕ/мкг) в клетках печени_у детей при разных стадиях хронизации вирусного гепатита С (X ± ж)
Показатель 2-я стадия хронизации, n = 9 3-я стадия хронизации, n = 10
Г6ФДГ 9,86 ± 3,09 22,16 ± 5,02
р < 0,05
Г3ФДГ 117,46 ± 20,11 254,87 ± 73,00
ЛДГ 2,41 ± 0,75 7,68 ± 4,09
НАДМДГ 164,63 ± 32,26 174,96 ± 36,77
НАДФМДГ 9,92 ± 2,43 23,09 ± 5,56
р < 0,05
НАДФГДГ 7,00 ± 1,48 11,83 ± 3,00
НАДГДГ 329,04 ± 87,55 289,91 ± 52,83
НАДИЦДГ 1,47 ± 0,66 2,18 ± 0,67
НАДФИЦДГ 11,56 ± 3,87 10,50 ± 3,84
ГР 9,56 ± 3,52 2,96 ± 0,63
р < 0,01
Для корреспонденции:
Булыгин Вадим Геннадьевич, канд. мед. наук, вед. науч. сотр. Адрес: 660022, Красноярск, ул. Аэровокзальная, 2/36 Телефон: 276-58-72 E-mail: [email protected]
Таблица 2
Активность ферментов (мкЕ/мкл) в цельной крови у детей при разных стадиях хронизации вирусного гепатита с (X ± ж)
Показатель 2-я стадия хронизации, n = 12 3-я стадия хронизации, n = 10
Г6ФДГ 1,49 ± 0,20 2,10 ± 0,18
р < 0,05
Г3ФДГ 15,84 ± 4,98 26,70 ± 6,19
ЛДГ 0,25 ± 0,11 0,33 ± 0,24
НАДМДГ 11,11 ± 3,23 19,16 ± 6,21
НАДФМДГ 11,56 ± 1,86 12,22 ± 2,72
НАДФГДГ 2,57 ± 0,35 1,50 ± 0,17
р < 0,05
НАДГДГ 9,70 ± 4,15 9,00 ± 3,43
НАДИЦДГ 0,09 ± 0,02 0,06 ± 0,02
НАДФИЦДГ 0,75 ± 0,19 0,15 ± 0,07
р < 0,01
ГР 0,06 ± 0,001 0,03 ± 0,001
р < 0,05
шению ко 2-й, определен уровень НАДФМДГ - 23,09 ± 5,56 и 9,92 ± 2,43, р < 0,05. В то же время активность ГР при 3-й стадии достоверно ниже, чем при 2-й (2,96 ± 0,63 и 9,56 ± 3,52, р < 0,01).
Установленные особенности активности ферментов позволили предположить, что синтетические процессы в клетках печени у детей при 3-й стадии хронизации вирусного гепатита С более выражены, чем при 2-й, о чем свидетельствует больший уровень Г6ФДГ при 3-й стадии. При усилении тяжести процесса повышается интенсификация конечных этапов цикла трикарбоновых кислот, позволяющая переводить часть малата, образующегося в цикле Креб-са, в пируват, что подтверждается более высоким уровнем активности НАДФМДГ при 3-й стадии, по сравнению со 2-й. Также при 3-й стадии снижается уровень защиты клеток печени от процессов перекис-ного окисления липидов: уменьшается активность ГР
- фермента антиоксидантной глутатионовой системы. Кроме того, учитывая роль этого энзима в транспорте аминокислот в клетки, можно предположить, что их поступление в клетки печени у детей при 3-й стадии существенно меньше, чем при 2-й.
В цельной периферической крови этих же детей также выявлены достоверные различия между уровнями активности ферментов в группах с разными стадиями хронизации заболевания (табл. 2). При этом показатели активности НАДФИЦДГ, НАДФГДГ и ГР у детей с 3-й стадией хронизации были достоверно ниже, чем у детей со 2-й стадией (НАДФИЦДГ - 0,15 ± 0,07 и 0,75 ± 0,19, р < 0,01; НАДФГДГ - 1,50 ± 0,17 и 2,57 ± 0,35,р < 0,05; ГР
- 0,03 ± 0,001 и 0,06 ± 0,001, р < 0,05), а уровень Г6ФДГ, в свою очередь, определялся достоверно выше при 3-й стадии (Г6ФДГ - 2,10 ± 0,18 и 1,49 ± 0,20, р < 0,05).
Выявленные особенности показателей активности метаболических ферментов указывают на то, что при 3-й стадии хронизации вирусного гепатита С сильнее, чем при 2-й, выражено ингибирование реакций начальных этапов цикла трикарбоновых кислот, что сочетается со снижением поступления в цикл Кребса субстратов с аминокислотного обмена, кроме того, и уровень реакций системы глутатионовой антиоксидантной защиты при 3-й стадии достоверно ниже. В то же время, интен-
сивность реакций пентозофосфатного пути метаболизма в крови детей с 3-й стадией хронизации гепатита С достоверно выше, чем у больных со 2-й стадией.
При сравнении этих показателей с параметрами, полученными в ткани печени, выявляются достоверные изменения уровней активности двух ферментов при увеличении тяжести процесса, как в цельной крови, так и в ткани печени: снижение активности Г6ФДГ и повышение активности ГР.
Таким образом, нами выявлены некоторые особенности метаболических реакций, протекающих в печени и периферической крови детей, больных хроническим вирусным гепатитом С. Установлено, что у этих детей выраженность нарушений метаболических процессов зависит от стадии хронизации данного заболевания.
Выводы. 1. Активность внутриклеточных ферментов в клетках печени при хроническом вирусном гепатите С у детей 12-16 лет зависит от стадии хронизации заболевания, а показатели активности энзимов указывают на интенсификацию процессов пентозофосфатного пути, конечных этапов цикла Кребса и снижение уровня антиоксидантной защиты клеток в группе детей с 3-й стадией хронизации, по сравнению с аналогичными параметрами, определяемыми при 2-й стадии хронизации процесса.
2. Нарушения метаболизма, выявляемые по активности ферментов в цельной периферической крови, при 3-й стадии хронизации заболевания выражены сильнее, чем при 2-й: наблюдается снижение поступления в цикл трикарбоновых кислот субстратов с аминокислотного обмена, ингибирование реакций начальных этапов цикла Кребса, уменьшение выраженности реакций системы глутатионовой антиоксидантной защиты и активация реакций пентозофосфатного пути.
3. Как в клетках печени, так и в цельной крови у детей при хроническом вирусном гепатите С наблюдается параллельное изменение активности двух ферментов, обусловленное стадией хронизации этого заболевания: снижаются показатели активности Г6ФДГ и повышаются уровни активности ГР у детей с 3-й стадией хронизации, по сравнению с группой детей со 2-й стадией.
4. Характер соотношения показателей активности ферментов в печени детей 12-16 лет при разных стадиях хронизации гепатита С с уровнями энзиматической активности в цельной крови этих же больных позволяет предположить, что ферментные показатели крови в определенной степени отражают специфику и направленность изменений метаболических процессов, происходящих в ткани печени детей, больных хроническим вирусным гепатитом С, что, по-нашему мнению, может являться основой для разработки новых диагностических подходов при этом заболевании.
ЛИТЕРАТУРА
1. Арямкина О.Л. Хроническая HBV- и HCV-инфекция и рак печени: клинико-эпидемиологические и дифференциально-диагностические параллели. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006; 2: 36-9.
2. Булыгин Г.В., Камзалакова Н.И., Андрейчиков А.В. Метаболические основы регуляции иммунного ответа. Новосибирск, СО РАМН. 1999. 346 с.
3. Лучшее В.И., Санин Б.И., Жаров С.Н. Вирусный гепатит С - глобальная проблема нашего времени. Российский медицинский журнал. 2004; 3: 40-5.
4. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica. Москва, Медиасфера. 2002. 312 с.
5. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом. Лабораторное дело. 1989; 11: 23-5.
6. Серов В.В., Севергина Л.О. Морфологические критерии оценки этиологии, степени активности и стадии процесса при вирусных хронических гепатитах В и С. Архив патологии. 1996; 4: 61-4.
7. Тихонова Е.П., Булыгин Г.В. Метаболические основы иммуноре-активности при парентеральных гепатитах В и С. Новосибирск. Наука. 2003. 148 с.
8. Учайкин В.Ф., Чуелов С.Б. Вирусные гепатиты у детей: от прошлого к настоящему. Детские инфекции. 2006; 4: 4-8.
9. Шахгильдян И.В., Ясинский А.А., Михайлов М.И. и др. Хронические вирусные гепатиты в Российской Федерации. Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения (материалы 8-й Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием и Красноярской краевой гастроэнтерологической конференции 17-18.04.08 г.). Красноярск; 2008: 246-53.
Поступила 21.11.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.71-018.46-002.2-089.84-07:616.153.1
З.С. Науменко, И.В. Шипицына, Л.В. Розова
динамика изменения лизоцимной активности и содержания лактоферрина у Больных хроническим остеомиелитом
ФГБУ Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия им. акад. Г. А. Илизарова" минздравсоцразвития России, Курган
При обследовании больных хроническим остеомиелитом, леченых методом чрескостного остеосинтеза, показан не однозначный характер изменения концентрации лактоферрина и лизоцима в сыворотке крови по сравнению с дооперацион-ными значениями. Показано, что к концу 2-3 месяца после операции происходит нормализация исследуемых показателей. Комплексное определение лактоферрина, лизоцима дополнительно к базальному обследованию клеточного иммунитета можно использовать для мониторинга хронического остеомиелита; это имеет диагностическое и прогностическое значение в оценке тяжести инфекционного процесса.
Ключевые слова: неспецифическая защита организма, хронический остеомиелит, лизоцим, лактоферрин Z.S. Naumenko, I.V. Schipitsyna, L.V. Rosova
THE DYNAMICS OF CHANGES IN LYSOZYME ACTIVITY AND CONTENT OF LACTOFERRIN CONTENT OF PATIENTS WITH CHRONIC OSTEOMYELITIS
The G.I. Ilizarov Russian research center of rehabilitative traumatology and orthopedics of Minzdrav of Russia, Kurgan, Russia
The article demonstrates that the examination of patients with chronic osteomyelitis treated using the transosseous osteosynthesis technique established the ambiguous character of changes in concentration of lactoferrin and lysozyme in blood serum as compared with pre-surgery values. It is demonstrated that closer to the end of 2-3 months after surgery the normalization of analyzed indicators occurs. The complex detection of lactoferrin, lysozyme applied additionally to basal examination of cell immunity can be used to monitor the chronic osteomyelitis. This approach can play a significant diagnostic and prognostic role in evaluation of severity on infection process.
Key words: non-specific defense of organism, chronic osteomyelitis, lactoferrin
Введение. Проблема лечения ортопедо-травмато-логической патологии, осложненной хронической гнойной инфекцией, остается актуальной до настоящего времени. Исследования, проведенные в последнем десятилетии, показали, что у больных хроническим остеомиелитом наблюдаются значительные сдвиги показателей как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета, которые свидетельствуют о нарушении иммунорегуляторных механизмов [5]. Хронизация остеомиелита связана с формированием вторичного постинфекционного иммунодефицита, вызванного как им-мунодепрессивным влиянием микробных возбудителей, так и особенностями иммунологической реактивности организма-хозяина [1]. Специфические иммунологиче-
Для корреспонденции: Науменко З.С., науч. сотр. Адрес: 640014, Курган, ул. М.Ульяновой, 6 Телефон: (3552) 45-47-47 E-mail: [email protected]
ские реакции протекают на фоне обязательных, быстро развивающихся неспецифических адаптационных механизмов. Имеются данные о связи воспалительного процесса при остеомиелите с динамикой показателей естественной резистентности в тканях [4].
Неспецифическая защита организма от возбудителей инфекций включает весьма разнообразные механизмы и факторы [3]. Они выступают в качестве первого барьера на пути внедрения возбудителей. К гуморальным бактерицидным и бактериостатическим механизмам защиты организма можно отнести лизоцим, лактоферрин, транс-феррин и др. Лизоцим эффективно разрушает мурамино-вую кислоту пептидогликанов с внешней стороны клеточной стенки грамположительных бактерий. Это приводит к их осмотическому лизису. Лактоферрин и трансферрин изменяют метаболизм железа в микробах. Это нарушает их жизненный цикл и обусловливает гибель [7].
Оценка факторов неспецифической защиты в сыворотке крови больных хроническим остеомиелитом важно в оценке общего состояния иммунной системы организма до и после иммунотерапии. Повышение неспецифи-
