CC BY
48
ВЕТЕРИНАРНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 619:579:579.841.93
Л.Н. Гордиенко
ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БРУЦЕЛЛ В ПРОЦЕССЕ L-ТРАНСФОРМАЦИИ IN VITRO
Ключевые слова: бруцеллы, морфология, трансформация, свойства, питательные среды, L-варианты, условия культивирования, идентификация.
Введение
Бруцеллы, как многие другие виды микроорганизмов, способны трансформироваться в L-формы, изменяя морфологические и биологические признаки исходного штамма [1-3].
В таком состоянии они длительное время персистируют в организме животных, вызывая инфекционный процесс с необычной патологией, и не выявляются стандартными методами диагностики [46].
С явлением изменчивости возбудителя бруцеллёза связана тенденция хронизации инфекционного процесса и наличие латентных форм у животных, которые представляют потенциальную опасность для восприимчивого поголовья. При определённых условиях изменённые формы бруцелл могут реверсировать и играть роль в появлении рецидивов в оздоровленных стадах и поддержании очагов инфекции [7, 8].
В связи с этим при диагностике бруцеллёза необходимо учитывать не только типичные формы бруцелл, но также L-формы и различные их варианты, что позволит выявить хронически больных животных, бруцеллоносителей, прогнозировать проявление эпизоотического процесса, правильно и своевременно проводить противобруцеллёзные мероприятия.
Для этого необходимо расширить возможность диагностического диапазона при бруцеллёзе за счёт бактериологической и серологической идентификации L-форм возбудителя.
В связи с этим мы посчитали целесообразным в экспериментальных условиях трансформировать бруцеллы в L-форму, изучить их свойства на разных стадиях трансформации и использовать полученные данные при усовершенствовании лабораторной диагностики бруцеллёза.
Материалы и методы
Работу проводили в лабораториях научно-исследовательских учреждений Рос-сельхозакадемии в соответствии с требованиями санитарных правил [9].
L-трансформацию осуществляли при высеве культур бруцелл вакцинного штамма B. abortus 19 (S-форма) и референтного B. abortus 544 (S-форма) на элективные плотные питательные среды, содержащие соль бензилпенициллина в различных концентрациях. Посевы инкубировали в термостате при температуре +37...+380С.
Посевы просматривали через 48 ч, оценивая наличие появления колоний, их энергию и характер роста. При каждом пересеве увеличивали концентрацию антибиотика. Через пять пересевов из на-тивных культур готовили мазки, окрашивали стандартными методами и изучали их тинкториальные и морфологические признаки при помощи световых микроскопов (МБИ-6 и Axioskop 40).__
Результаты исследований
При воздействии на клетки бруцелл соли пенициллина в концентрации 5-10 ЕД/мл среды культуральные свойства штаммов существенно не изменялись. При высеве 1 млрд взвеси L-культур на скошенный агар рост отмечали через 3672 ч. На поверхности плотной среды колонии были правильно контурированные, круглые, гомогенные, бесцветные с масляным оттенком, размером от 1 до 3-4 мм.
В полужидком агаре наблюдали наличие роста в виде голубовато-белого столбика шириной 0,5-1,0 см в верхней части среды. Взвесь культуры была соединена с плотными частицами среды и не отделялась от них бактериологической петлёй.
В бульоне отмечали помутнение и выпадение белого осадка. При длительном культивировании в жидкой среде по периферии наблюдали кольцевидный рост серовато-голубого цвета, слегка поднимающийся над уровнем бульона.
С постепенным повышением концентрации антибиотика в питательной среде до 300-1000 ЕД/мл культуральные свойства изучаемых субкультур заметно изменялись. Их видимый рост замедлялся до 7-14 суток. Колонии становились более мелкими (до 1-2 мм), уплощёнными и приобретали матовый оттенок. На поверхности полужидкой питательной среды появлялся слабый рост в виде серо-голубого столбика.
В бульоне образовывался осадок, который при встряхивании поднимался плотной косичкой или хлопьями. Пристеночного кольца, характерного для типичных S-форм бруцелл, не возникало.
При воздействии более высоких концентраций пенициллина до 5-20 тыс. ЕД/мл в процессе L-трансформации на 14-18 генерации были получены L-ва-рианты бруцелл с относительно стабильными признаками сферопластного типа, которые были условно обозначены «Сп». Полученные варианты заметно отличались от исходной культуры скоростью и энергией роста. Наличие слабого роста отмечали на поверхности плотных питательных сред лишь на 14-20-е сутки. Колонии становились плоскими, мелкими (размером менее 1 мм), со значительным матовым оттенком. На полужидкой среде образовывались серые матовые плоские налёты роста культуры разной конфигурации и размера.
При пересеве на мясо-пептонном бульоне L-варианты бруцелл также не
образовывали характерного для типичных форм пристеночного кольца.
В последующем при длительном культивировании L-вариантов сферопластного типа в присутствии индуцирующего фактора отмечали стабилизацию культураль-ных свойств. При выборе оптимальных условий адаптации в условиях обычных питательных сред удалось на протяжении длительного времени сохранять полученные L-варианты и использовать их в качестве модели при изучении процессов трансформации и реверсии возбудителя бруцеллёза.
В результате изучения фенотипических признаков L-вариантов бруцелл на разных стадиях трансформации отмечали постепенное изменение размеров микробных клеток, состава популяции, специфичности окраски.
В начальной стадии трансформации при действии минимальных концентраций пенициллина 5-10 ЕД/мл среды клетки бру-целл сохраняли специфичность окраски анилиновыми красителями (по Граму и по Козловскому). Как и типичные бруцеллы, они окрашивались в розовый и красный цвета. Морфологически популяция L-ва-риантов на этом этапе состояла из микрококков диаметром 0,3-0,4 мкм и овоидов 0,5-0,8 мкм. В таком состоянии бруцеллы полностью сохраняли агглютинабельные свойства и только единичные культуры проявляли слабую положительную реакцию в растворе трипафлавина.
При увеличении концентрации антибиотика до 300-1000 ЕД/мл клетки L-ва-риантов бруцелл о^авались грамотрица-тельными, но утрачивали специфичность окраски по Козловскому: окрашивались в темно-коричневый и серо-сиреневьй цвет. Популяция культур при данной концентрации пенициллина оставалась полиморфной: половина клеток (до 50%) были еще мелкими, а остальные увеличивали свои размеры до 0,8-1,0 мкм и становились похожими на кокки, расположенные беспорядочно. Культура становилась слизистой или крошковатой и не эмульгировалась в сыворотках и физиологическом растворе. При посеве на элективные питательные среды в отсутствии индуцирующего фактора при последующих двух пересевах культуры реверсировали в исходную бактериальную форму бруцелл.
Воздействие высоких концентраций антибиотика до 20 тыс. ЕД/мл вызывало изменение их фенотипических признаков. На 14-18 генерации культуры оставались
72
Вестник Алтайского государственного аграрного университета № 8 (82), 2011
полиморфными, в их популяциях преобладали шаровидные клетки до 1,5-2,0 мкм и более. Крупные сферопласты были деформированы и неравномерно окрашивались по Козловскому в бурый, коричневый и серый цвет, по Граму — в сиреневый и фиолетовый. До 10% от общего количества составляли мелкие округлившиеся клетки, по размерам близкие к типичным бруцеллам, но имеющие темно-красную или коричневую окраску.
На более поздних стадиях трансформации L-варианты бруцелл полностью утрачивали ригидную клеточную стенку.
Размеры L-клеток увеличивались в несколько раз и достигали от 2,0 до 4,0 мкм. Популяция состояла из клеток разного размера, расположенных в мазках беспорядочно, окрашивающихся по Козловскому в темно-коричневый, по Граму — в бордовый и фиолетовый цвета. Часть клеток в популяции имела эллипсоидную форму и гигантские размеры 3,0-8,0 мкм. При микроскопии были видны элементарные тела, интенсивно окрашенные в темно-коричневый или фиолетовый цвет.
Полученные культуры бруцелл в L-форме, адаптированные к условиям искусственных питательных сред с добавлением белковых компонентов (нормальная сыворотка крови лошади или околоплодная жидкость), были способны в нативном состоянии сохранять при температуре +4...+12°С стабильные свойства в течение нескольких лет. В дальнейшем L-куль-туры, полученные in vitro, использовали для изготовления диагностических препаратов: L-бруцеллёзных сывороток и L-ан-тигенов.
Экспериментально полученные L-куль-туры бруцелл со стабильно закреплёнными свойствами использовали в качестве эталонных при идентификации L-вариан-тов, изолированных от лабораторных и сельскохозяйственных животных.
Новые научные данные о свойствах бруцелл в L-форме необходимы при изучении закономерностей и особенностей персистенции L-форм бруцелл в организме животных, инфекционного процесса у животных, инфицированных изменёнными формами, усовершенствования диагностики бруцеллёза, оценки эпизоотического состояния стад, прогнозировании проявления эпизоотий, своевременного и правильного проведения профилактических мероприятий.
Выводы
В процессе L-трансформации in vitro бруцеллы изменяют культуральные, тинк-ториальные и морфологические признаки. Трансформации подвержены как вакцинные, так и референтные штаммы бруцелл, находящиеся в S-форме.
Степень изменчивости бруцелл зависит от концентрации воздействия индуцирующего фактора.
Библиографический список
1. Бакулов И.А. Проблема L-форм бактерий в ветеринарии / И.А. Бакулов, Т.Я. Зеленцова // Ветеринария. — 1980. - № 10. — С. 23.
2. Гордиенко Л.Н. L-трансформация бруцелл и её значение при бруцеллёзе северных оленей / Л.Н. Гордиенко, В.Г. Ощепков / / Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: матер. Междунар. науч.-практ. конф. (16-17 мая 2005 г.). — М., 2006. — С. 327-333.
3. Зыкин Л.Ф. L-формы возбудителей зооантропонозов / Л.Ф. Зыкин, Д.А. Васильев. — Ульяновск, 2000. — 68 с.
4. Кошкин Е.Н. Изменчивость бруцелл в организме свинок / Е.Н Кошкин // Инфекционные и незаразные болезни сельскохозяйственных животных в Казахстане. — Алма-Аты, 1993. — С. 63-67.
5. Ременцова М.М. Значение L-форм бруцелл в эпизоотическом процессе / М.М. Ременцова, В.М. Семенцова,
B.М. Нифантьев и др. // Актуальные вопросы профилактики бруцеллёза и организация мед. помощи больным: тез. докл. Всесоюз. конф. (г. Новосибирск, 24-25 окт. 1989 г.). — М., 1989. —
C. 93-94.
6. Триленко П.А. МВБ и L-формы бруцелл / П.А. Триленко // ЛВИ. — 1971. — Вып. 32. — С. 35.
7. Толмачёва Т.А. Реверсия L-форм бруцелл in vitro и in vivo и свойства полученных ревертантов / Т.А. Толмачёва // ЖМЭИ. — 1975. — № 1. — С. 145.
8. Гордиенко Л.Н. L-формы бруцелл и их роль в инфекционном процессе и иммунодиагностике бруцеллёза у людей и животных / Л.Н. Гордиенко, В.Г. Ощеп-ков, Л.М. Михайлов, А.И. Калиновский // Матер. Межрегион. науч.-практ. конф. — Омск, 2007. — № 3 (61).
9. Санитарные правила СП 1.2.011-94. Безопасность работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенности. — М., 1994. — 152 с.
