CC BY
27
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
13
РАЗРАБОТКА ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ЦИФЕЛИНА ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
М.А. Барышникова, О.Л. Орлова, А.П. Полозкова, Н.А. Оборотова, Л.И. Смирнова ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Среди различных групп синтетических химических соединений наиболее широко применяются алки-лирующие агенты. В соответствии с теорией о целесообразности применения производных аминокислот как потенциальных антиметаболитов аминокислотного обмена злокачественных опухолей в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина синтезирован сарколизин и менее токсичное его производное цифелин.
Цифелин - этиловый эфир 14- {№-ацетил-4-[ди-(2-хлорэтил)амшю]-ВЬ-фенилаланил}-ВЬ-валина. Препарат в 1967 г. был разрешен для клинического применения. Однако из-за использования в синтезе высокотоксичного реактива - дициклогексилкарбодиимида и отсутствия рациональной лекарственной формы цифелин был снят с производства и исключен из Номенклатуры Государственного Реестра лекарственных средств СССР. Учитывая интерес клиницистов к этому препарату, были возобновлены исследования по разработке таб-летированной лекарственной формы д ля приема внутрь.
Особенностью цифелина, как и остальных пептидов сарколизина, является его практическая нерастворимость ни в воде, ни в маслах. Наиболее рациональной для цифелина является форма для перорального применения в виде таблеток. При разработке лекар-
ственной формы цифелина в виде таблеток были изучены технологические характеристики субстанции цифелина, которые предопределили вид прессования, необходимость введения дополнительных ингредиентов, обеспечивающих возможность процесса таблети-рования, и высокое (соответствующее требованиям ГФ) качество полученных таблеток (распадаемость, прочность и т.д.). Для коррекции технологических характеристик субстанции массу для таблетирования цифелина получали методом влажной грануляции. В присутствии влаги хлорэтиламины гидролизуются. Для этого наряду со вспомогательными веществами, необходимыми для улучшения текучести, коррекции насыпной массы, исключения залипаемости, в табле-тируемую массу введен стабилизатор - натрия хлорид. Наибольшую сложность представляла коррекция распадаемости таблеток. Все исследуемые модели таблеток набухали, но не распадались. Введение разрыхлителя аэросила позволило получить таблетки, соответствующие требованию ГФ.
Таким образом, в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН разработана лекарственная форма труднорастворимого хлорэтиламина в виде таблеток для перорального применения.
ФЕНОТИП МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ КЛЕТОК ЛИНИИ А4
Д.Ю. Блохин, А.А. Соколовская, Н.К. Власенкова
Клеточная линия А4, полученная методом хронической стимуляции клеток линии Т-лимфобластного лейкоза Jurkat агонистическими МКА анти-СБ95, проявляет резистентность к индукции апоптоза рентгеновским и УФ-облучением, рядом противоопухолевых цитостатиков, индукторами оксидативного стресса, стауроспорином, цикпогексимидом, дефицитом ростовых факторов, TRAIL и TNF-a. Задачей данного исследования была сравнительная количественная оценка спектра лекарственной чувствительности и иденти-
ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва
фикация механизма гибели клеток 2 линий под действием сравнимых по цитотоксическому эффекту концентраций этопозида, цис-ДДП и адриамицина. Материалом явились культивируемые in vitro в присутствии одного из цитостатиков клетки обеих линий. Методами оценки цитотоксического эффекта служили МТТ-тест, анализ субпопуляции гиподиплоидных клеток проточной цитометрией и морфологический контроль цитопрепаратов. Результат расчета 1C50 по данным МТТ-теста (48 ч) при эскалации концентраций каждого пре-
Линия клеток Препарат
Этопозид цис-ДДП Адриамицин
Jurkat 3x10’6 М 5-бхЮ-6 М 2-ЗхЮ-6 М
А4 1-2ХІ0-4 М 1-2x10-4 М 1-Зх1(НМ
№2/томЗ/2004
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
14
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
парата представлен в таблице. Видно, что 1С50 всех трех препаратов д ля линии А4 на 2 порядка превышает таковую для родительской линии .Гигка!;.
Далее клетки обеих линий культивировали в течение 48 ч в присутствии 1С50 каждого из препаратов, после чего их фиксировали этанолом, окрашивали Р1 и анализировали методом проточной цитометрии с регистрацией показателей прямого и бокового светорас-сеивания, а также флюоресценции по каналу БЬ2. Результат анализа клеточных популяций показал, что при равном цитотоксическом эффекте клетки линии 1игка1 погибают с типичными признаками апоптоза (40-60 % популяции), в то время как фракция апоптотически гибнущих клеток А4 не превышает 10-20 % популя-
ции. Преимущественно некротический морфотип гибнущих клеток А4 подтвержден прямым морфологическим контролем цитопрепаратов.
Выжившая через 14 и 22 сут культивирования без препаратов фракция линии 1игка1 морфологически сходна с интактными клетками, в то время как репопуляция А4 сопровождается ее значительным клональным расщеплением.
Выводы. Дефекты в реализации программы клеточной гибели приводят к фенотипу множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток и сопровождаются возникновением значительного клеточного полиморфизма при сублетальном генотоксическом стрессе.
ВНЕКЛЕТОЧНАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ ЯВЛЯЕТСЯ РЕГУЛЯТОРОМ ИХ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И СВЯЗЫВАНИЯ С ДНК В КЛЕТКАХ С ФЕНОТИПОМ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ
ТА. Богуш, А.Б. Равчеева, А.В. Конухова, Е.Р. Полосухина, Ю.В. Шишкин, А.А. Штиль, А.Ю. Барышников ГУ РОНЦим. Н.Н.Блохина РАМН, Москва
Задачи исследования. Изучая эффекты специфических ингибиторов АВС-транспортеров - маркеров множественной лекарственной резистентности (МОК) в солидных опухолях человека, мы подтвердили описанный в культуре клеток факт, что от функциональной активности АВС-транспортеров зависит внутриклеточное распределение МОЯ-препаратов между цитоплазмой и ядром. Мы сформулировали гипотезу о том, что внеклеточная концентрация цитостатиков также может являться регулятором внутриклеточной компартментизации МБІІ-препаратов. Мы предположили, что блокировать функцию АВС-транспортеров можно не только с помощью их ингибиторов, но и при увеличении концентрации МОІІ-препарата в среде инкубации до уровня, когда транспортеры будут не способны справиться с лавинообразным поступлением субстрата в клетку. В результате нарастающая концентрация препарата в цитоплазме может достичь столь высокого уровня, с которым будут не в силах справиться защитные ядерные транспортеры и МБЯ-препарат перейдет из цитоплазмы в ядро.
Цель исследования. Проверка правильности предположения о возможности регулирования внутриклеточного распределения и накопления в ядре МБЯ-препара-тов при повышении их внеклеточной концентрации.
Материалы и методы. В качестве объекта исследований была выбрана клеточная линия К562 с Pgp фенотипом МОЯ. Клетки инкубировали в течение 5 мин с доксорубицином в диапазоне концентраций от 7,7x10-
7 до 7,7x10-5 М. Внутриклеточную флюоресценцию оценивали методом проточной цитофлюориметрии.
Результаты, а) Выявлена прямая зависимость средней флюоресценции всей популяции клеток от концентрации доксорубицина в среде инкубации в диапазоне от 7,7x10-7 до 7,7x10-6 М. При концентрациях антибиотика, превышающих 7,7x10-6 М, зависимость становится обратной: чем больше концентрация доксорубицина в среде, тем меньше средняя флюоресценция клеток, б) Для субпопуляций клеток с высокой и низкой флюоресценцией характерна прямая зависимость средней флюоресценции от концентрации доксорубицина во всем исследованном диапазоне. в) С увеличением концентрации доксорубицина все большую часть популяции составляют клетки в области низкой флюоресценции, что отражается на снижении средней флюоресценции всей популяции клеток, г) Переход клеток из области высокой в область низкой флюоресценции означает перераспределение доксорубицина из цитоплазмы в ядро и связывание с ДНК, так как связывание антрациклина с ДНК приводит к значительному (более 40 раз) снижению флюоресценции антрациклина.
Выводы. 1. В клетках с фенотипом МОК цитоплазматическая концентрация цитостатиков определяет их доступность для ядра.
2. Внутриклеточное распределение МБЯ-препа-ратов между цитоплазмой и ядром, контролируемое АВС-транспортерами, регулируется внеклеточной
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
№2/томЗ/2004
