Фенотип и генотип семейного рассеянного склероза

Коробко Денис Сергеевич; Малкова Надежда Алексеевна; Соколова Екатерина Алексеевна; Филипенко Максим Леонидович

№ 6 - 2012 г.

14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 616.832-004.2:575.21/.22

ФЕНОТИП И ГЕНОТИП СЕМЕЙНОГО РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

Д. С. Коробко1, Н. А. Малкова12, Е. А. Соколова3, М. Л. Филипенко3

1ГБУЗ НСО «Государственная Новосибирская областная клиническая больница»

(г. Новосибирск);

2ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития (г. Новосибирск);

3ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН

(г. Новосибирск).

Проведено ретроспективно-проспективное исследование 326-ти больных рассеянным склерозом (РС) по критериям McDonald (2005). Выявлено 25 семейных случаев РС. Семейный риск повторяемости составил 7,0 %. С использованием технологии TaqMan генотипировано 8 полиморфизмов, являющихся однонуклеотидными заменами: CD40 (rs6074022, rs1883832, rs1535045 и rs11086998), rs1800629 (TNFa), rs4149584 (TTNFRSF1A), rs10492972 (KIF1B) и rs3135388. Выявлены особенности фенотипа семейного РС — более мягкое, доброкачественное течение с медленной скоростью прогрессирования. Генеалогический анализ подтверждает неменделевский тип наследования. Выявлена более высокая частота аллеля Т полиморфизма rs3135388 в группе семейного РС.

Ключевые слова: рассеянный склероз, семейные случаи, однонуклеотидные

полиморфизмы, rs3135388.

Коробко Денис Сергеевич — врач-невролог Областного центра рассеянного склероза и других аутоиммунных заболеваний нервной системы ГБУЗ НСО «Государственная Новосибирская областная клиническая больница», г. Новосибирск, рабочий телефон: 8 (383) 346-01-22, e-mail: [email protected]

Малкова Надежда Алексеевна — доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической неврологии и алгологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», руководитель Областного центра рассеянного склероза и других аутоиммунных заболеваний нервной системы ГБУЗ НСО «Государственная Новосибирская областная клиническая больница», г. Новосибирск, рабочий телефон: 8 (383) 346-01-22, e-mail: [email protected]

Соколова Екатерина Алексеевна — инженер ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СОРАН, рабочий телефон: 8 (383)-363-51-71, e-mail: [email protected]

Филипенко Максим Леонидович — заведующий группой фармакогеномики ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СОРАН, г. Новосибирск, рабочий телефон: 8 (383)-363-51-71, e-mail: [email protected]

С 2007 года быстро расширяющаяся серия полногеномных исследований при рассеянном склерозе (РС) помогла идентифицировать и подтвердить наличие многочисленных локусов генов цитокинов/рецепторов как аутоиммунных факторов риска [5, 6]. Важно отметить, что большинство ассоциированных вариантов ДНК вряд ли представляют собой конечные причинные факторы риска заболевания, но, вероятно, возникли вследствие неравновесия по сцеплению с реальным причинным полиморфизмом.

Существование семейных случаев РС подтверждает наследственную природу заболевания. Риск развития РС у родственников пациентов с РС в 15-50 раз выше, чем в популяции в целом, и коррелирует со степенью родства [11]. В некоторых работах подчеркивается отличие семейных случаев РС от спорадических [1]. В парах сиблингов больных РС прослеживается умеренная, но значимая конкордантность по клиническому течению заболеванию [7]. Однако здесь много противоречий и неоднозначных заключений.

ДНК-диагностика многофакторных заболеваний неразрывно связана с биоэтическими проблемами, с соблюдением прав человека, защитой его интересов [2]. Ее использование создает необходимость особенно внимательно относиться к соблюдению традиционных моральных принципов медико-генетического консультирования, а также искать новые пути повышения точности прогнозов. Всё это делает актуальными исследования в клинической генетике по семейным случаям РС.

Цель исследования — выявить особенности фенотипа и генотипа семейных случаев РС на примере Новосибирской области.

Задачи исследования: изучить полиморфизмы ге6074022, ге1883832, ге1535045

и ге11086998 гена СВ40, ге1800629 (Т^а), ге4149584 (ТЫЕЯ8Е1Л), а также двух полиморфизмов, не относящихся к генам цитокинов ге10492972 (КШ1Е) и ге3135388; описать основные клинические характеристики семейных случаев РС; оценить вклад генетических факторов на примере изученных полиморфизмов различных генов в формирование своеобразного фенотипа семейного РС.

Материалы и методы исследования. Обследовано 326 больных с РС по критериям McDonald (2005) [10], русских по национальности, проживающих в г. Новосибирске и Новосибирской области. Исследование было одобрено Этическими комитетами ГБУЗ НСО «Государственная Новосибирская областная клиническая больница» и ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет». До участия в исследовании все участники подписали форму информированного согласия.

Все пациенты прошли стандартное клиническое обследование, МРТ-исследование на высокопольном томографе (с целью подтверждения диагноза), молекулярногенетическое исследование. На каждого участника заполнялась специально разработанная формализованная анкета, включающая демографические данные (возраст, пол, национальность), медицинскую информацию (возраст дебюта, длительность заболевания, скорость прогрессирования, тип течения, сопутствующие аутоиммунные заболевания) и генетический статус (относительно наличия родственников с РС или другими аутоиммунными заболеваниями).

Отмечается преобладание женщин в соотношении 1:1,9 (112 мужчин и 214 женщин). Медиана возраста составила 35 лет. Средняя длительность заболевания составила 8,98 ±

8,70 лет. Медиана возраста дебюта РС составила 26 лет (min — 9, max — 51). Длительность первой ремиссии в среднем — 16 мес. (min — 1, max — 300).

Тип течения РС определялся в соответствии с международной классификацией, предложенной F. D. Lublin и S. C. Reingold [9]. У большинства больных (69 %) этой группы был диагностирован ремитирующий характер течения РС. Вторично -прогрессирующее течение наблюдалось у 22 % пациентов, ремитирующе-прогредиентное и первично-прогредиентное — по 3 %. У 3 % пациентов, включенных в исследуемую группу, заболевание находилось на стадии клинически изолированного синдрома.

Для объективизации клинической картины заболевания использовалась оценка функциональных систем (FS) по Куртцке и расширенная шкала инвалидизации по Куртцке EDSS (Expanded Disability Status Scale) [8].

Для оценки быстроты нарастания неврологического дефицита (т.е. прогрессирования РС) использовались 2 параметра: балл по шкале тяжести РС (MSSS, Multiple Sclerosis Severity Score) [12] и скорость прогрессирования, определяемая путем соотношения степени тяжести в баллах шкалы EDSS к длительности заболевания в годах [4, 13]. Ключевой принцип MSSS — корректировка единичного балла по шкале инвалидизации отдельного пациента путем сравнения с распределением значений баллов EDSS у пациентов с аналогичной продолжительностью болезни. Все пациенты со средним уровнем инвалидизации для своей продолжительности болезни будут иметь балл MSSS около 5. Соответственно больные с ускоренными темпами прогрессирования получат более высокие значения этого индекса. Для расчета баллов MSSS нами использовалась специально разработанная программа MSSStest (версия 3.0, 2007), реализующая основные принципы метода, описанного R. H. S. R. Roxburgh с соавт. [12].

Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Исследовано 8 полиморфизмов: CD40 (rs6074022, rs1883832, rs1535045 и rs11086998), rs1800629 (TNFa), rs4149584 (TNFRSF1A), rs10492972 (KIF1B), rs3135388 (генетический маркер носительства аллеля HLA-DRB1*15). Все изученные варианты являются однонуклеотидными заменами (SNP, от англ. Single nucleotide polymorphism). На момент анализа доступно 95 % результатов генотипирования.

ДНК выделяли из 3-5 мл венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенол-хлороформом и осаждение ДНК этанолом. Генотипирование проводилось с использованием технологии TaqMan. Амплификация проводилась с помощью амплификатора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США).

Статистический анализ полученных результатов проводился на Intel-совместимом персональном компьютере с использованием статистических программ Statistica for Windows, v.8.0 (StatSoft, Inc.) и языка программирования R (version 2.11.0, www.r-project.org). Различия в возрасте пациентов анализировали с помощью U-критерия Мана-Уитни. В качестве нулевой гипотезы принималась гипотеза об отсутствии различий в группах. Корреляционный анализ данных проведен с помощью определения коэффициента корреляции Пирсона.

Тесты на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга и выявление ассоциаций генотипа с развитием заболевания проводили методом хи-квадрат с помощью онлайн программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия) [http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl]. Нулевыми гипотезами являлись соответствие

распределению Харди-Вайнберга и отсутствие ассоциаций (OR = 1). Для выявления ассоциаций темпов прогрессирования по баллу MSSS с генотипом и определения достоверности различий медиан нескольких подгрупп рассчитывался H-критерий Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis test) с помощью программы MSSStest. Для сравнений двух групп генотипов применялся идентичный тесту Краскела-Уоллиса U-критерий Манна-Уитни. Пациенты с длительностью заболевания менее одного года исключены из данного анализа, так как на основании EDSS-оценки в первый год болезни нельзя адекватно спрогнозировать дальнейшую скорость прогрессирования заболевания.

Для всех видов статистического анализа различия считались статистически достоверными при достигнутом уровне значимости р< 0,05.

Результаты и обсуждение. В группе включенных в исследование больных РС преобладали пациенты с легкой и умеренной степенью инвалидизации, на что указывает средний показатель EDSS 3,01 ± 1,76 балла (min 1, max 8,5). Другие рассчитанные параметры, описывающие темпы нарастания инвалидизации, также указывают на среднюю скорость прогрессирования у большинства больных. Медиана балла MSSS составила 3,90 (2,1; 6,1), скорости прогрессирования 0,55 баллов в год (0,2^0,6), при этом у 30 % пациентов скорость прогрессирования составила менее 0,25 баллов в год, у 46 % больных — от 0,25 до 0,75, и у 24 % — выше 0,75 баллов в год.

Случай РС определялся как семейный при наличии у пациента как минимум одного родственника (любой степени родства) с данным заболеванием. В исследованной группе выявлено 25 больных, имеющих родственников с РС в 23-х семьях (в 68 % случаев — родственники первой линии родства: мать — дочь/сын; отец — дочь/сын; сестра-брат). Семейный риск повторяемости составил 7,0 % у родственников первой, второй или третьей степени родства, общий риск повторяемости — 7,6 %.

После проведенного анализа выявлено, что группа семейного РС статистически значимо не отличалась от остальных включенных больных РС по возрасту, длительности заболевания и уровню инвалидизации (табл. 1). Однако при этом выявлены клинические особенности по другим параметрам, в том числе относящимся традиционно к прогностическим.

Таблица 1

Общая характеристики больных РС

Спорадический РС Семейный РС P-value

Общее количество пациентов 321 25

Возраст(лет) 36,4 ± 10,2 36,0 ± 13,9 > 0,05

Пол мужчины : женщины 1 : 1,92 1 : 1,78 > 0,05

Возраст дебюта (лет)* 27,5 ± 8,5 (26) 23,6 ± 8,1 (23) > 0,05

БЭББ 3,0 ± 1,7 3,2 ± 2,3 > 0,05

Длительность заболевания (лет) 9,0 ± 7,8 12,6 ± 11,2 > 0,05

Длительность первой ремиссии (мес)** 17,5 [3,0-144] 16,5 [2,1-175,2] > 0,05

КИС/РПРС/ ППРС/ВПРС/РРС 8/9/11/64/209 1/0/0/9/15 —

Скорость прогрессирования (балл/год)* 0,60 ± 0,61 (0,36) 0,30 ± 0,25 (0,33) —

MSSS (медиана) 4,38 3,27 0,03

Среднегодовая частота обострений 0,80 ± 0,62 0,50 ± 0,61 —

Примечание: * — данные приведены в формате: среднее значение ± SD (в скобках — Медиана),

** — данные приведены в формате: Медиана [95 % ДИ]

Возраст дебюта РС в группе семейных случаев оказался немного ниже по сравнению со спорадическими, однако статистически недостоверно (23,6 ± 8,1 против 27,5 ± 8,5, р > 0,05). Симптомы дебюта были различными, но при семейном РС преобладали зрительные, глазодвигательные и чувствительные нарушения (60 %) и не встречались прогностически неблагоприятные тазовые расстройства, только в одном случае (4 %) первыми симптомами были мозжечковые нарушения. Достоверных различий в длительности первой ремиссии РС не выявлено (р > 0,05).

Показатель прогрессирования заболевания, оцененный по шкале MSSS, в подгруппе семейного РС был достоверно ниже по сравнению со спорадическим случаями (3,27 против 4,38, р = 0,03). Причем балл MSSS коррелировал с возрастом дебюта (г = 0,49, р <

0,01), и была выявлена обратная зависимость с длительностью первой ремиссии (г = —

0,35, р < 0,01), т. е. прогрессирование было замедлено у пациентов с более ранним дебютом и длительной первой ремиссией.

Распределение генотипов всех изученных полиморфных локусов изученных генов, за исключением полиморфизма ге4149584 (TNFRSF1Л), соответствовало закону Харди-Вайнберга как в группе спорадического РС, так и в группе семейного РС (HWE р > 0,05) (табл. 2). Аллель А локуса ге4149584 (TNFRSF1Л) является очень редким в популяции (около 2 %), а в нашей немногочисленной группе семейного РС вообще не встречается, не соблюдается распределение Харди-Вайнберга по данному полиморфизму (р = 0,00).

Таблица 2

Частоты встречаемости генотипов, соответствие распределению Харди-Вайнберга

№ Ген (SNP) Хромо- сома Группа Количество пациентов (частота, %) Всего HWE *Р- value

1. CD40 20 т/т т/с С/С

Примечание', p-value — уровень статистической значимости соответствия частот генотипов закону распределения Харди-Вайнберга; HWE — Hardy-Weinberg equilibrium (равновесие Харди-Вайнберга)

У больных, имеющих родственников с РС, отмечена большая частота аллеля Т полиморфизма rs3135388 (44 против 33 %, р = 0,003). Поскольку данный полиморфный локус является генетическим маркером носительства аллеля HLA-DRB1*15 [8] и увеличивает риск РС более чем в 3 раза, по данным нашего исследования [3], можно предполагать, что гаплотип HLA в определенной мере вносит вклад и в формирование своеобразного течения семейных форм заболевания. Также возможно, что аллель HLA-DRB1*15 определяет большую вероятность передачи РС последующим поколениям, т. е. появления новых семейных случаев.

На уровне тенденции отмечена немного более высокая частота аллеля T полиморфного варианта rs1883832 гена CD40, однако не достигшая уровня статистической значимости.

Не показано достоверного влияния изученных полиморфизмов генов цитокинов на риск развития семейного РС (табл. 3).

Таблица 3

Частотный анализ аллелей исследованных полиморфных локусов в зависимости

от семейного анамнеза

Ген SNP Аллель Частота аллеля, % Х2 Р

спорадический семейный

rs6074022 С 23 22 0,02 0,89

CD40 rs1883832 Т 32 43 2,35 0,12

rs1535045 Т 26 22 0,47 0,50

rs11086996 G 1 2 0,49 0,42

KIF1B rs10492972 C 31 30 0,01 0,91

rs3135388 T 33 * 8,56 0,003

TNF-a rs1800629 А 10 8 0,13 0,77

TNFRSF1A rs4149584 А 2 0 0,41 1,00

Выводы. На репрезентативном клиническом материале, на примере сибирской когорты подтверждено наличие особенностей фенотипа семейного РС. В отличие

от спорадических, семейные случаи РС характеризуются более мягким,

доброкачественным течением с медленной скоростью прогрессирования. Генеалогический анализ подтверждает неменделевский тип наследования. Выявлена более высокая частота аллеля Т полиморфизма ге3135388 в группе семейного РС. Необходимы дальнейшие

исследования для уточнения молекулярно-генетических особенностей семейных случаев РС и определения прогностической значимости выявленных различий для пациентов и их родственников.

Работа поддержана Российской федеральной программой «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» (2012-1.5-12-000-1002). Государственный контракт № 8490.

Список литературы

1. Эпидемиология и этиология рассеянного склероза / А. Н. Бойко, О. О. Фаворова,

О. Г. Кулакова, Е. И. Гусев // В кн. : Рассеянный склероз / Под ред. Е. И. Гусева, И. А. Завалишин, А. Н. Бойко. — М., 2011. — С. 7-43.

2. Ижевская В. Л. Некоторые этические аспекты / В. Л. Ижевская, С. И. Козлова // Мед. генетика. — 2004. — Т. 4, № 8. — С. 370-375.

3. Генетические и клинические особенности семейного рассеянного склероза в Новосибирске / Д. С. Коробко, Н. А. Малкова, Е. В. Булатова [и др.] // Материалы 12-й межрегиональной научно-практической конф. «Актуальные вопросы неврологии» с обсуждением смежных вопросов неврологии и медицинской генетики. — Новосибирск, 2012. — С. 50-55.

4. Малкова Н. А. Рассеянный склероз / Н. А. Малкова, А. П. Иерусалимский. — Новосибирск, 2006. — 197 с.

5. Evidence for polygenic susceptibility to multiple sclerosis — the shape of things to come : The International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC) // Am. J. Hum. Genet. — 2010. — Vol. 86. — P. 621-625.

6. Risk alleles for multiple sclerosis identified by a genomewide study / D. A. Hafler [et al.] // N. Engl. J. Med. — 2007. — Vol. 357. — Р. 851-862.

7. Familial effects on the clinical course of multiple sclerosis / A. E. Hensiek [et al.] // Neurology. — 2007. — Vol. 68, N 5. — Р. 376-383.

8. Kurtzke J. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis : an expanded disability status scale (EDSS) / J. Kurtzke // Neurology. — 1983. — Vol. 33. — Р. 1444-1452.

9. Lublin F. D. Defining the clinical course of multiple sclerosis: results of an international survey. National Multiple Sclerosis Society (USA) Advisory Committee on Clinical Trials of New Agents in Multiple Sclerosis / F. D. Lublin, S. C. Reingold // Neurology.

— 1996. — Vol. 46, N 4. — Р. 907-911.

10. Diagnostic criteria for multiple sclerosis: 2005 revisions to the «McDonald Criteria» /

C. H. Polman [et al.] // Ann. Neurol. — 2005. — Vol. 58, N 6. — Р. 840-846.

11. Ramagopalan S. V. Genetics and epidemiology of multiple sclerosis / S. V. Ramagopalan, A. D. Sadovnick // In : Primer on multiple sclerosis / Ed. : B. S. Giesser.

— Oxford University Press, New York, 2011. — Р. 15-29.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

12. Multiple Sclerosis Severity Score : Using disability and disease duration to rate disease severity / R. H. S. R. Roxburgh [et al.] // Neurology. — 2005. — Vol. 64. — Р. 11441151.

13. Clinical parameters and intrathecal IgG synthesis as prognostic features in multiple sclerosis / E. Verjans [et al.] // Part I. J Neurol. — 1983. — Vol. 229 (3). — Р. 155-65.

PHENOTYPE AND GENOTYPE OF FAMILIAL MULTIPLE SCLEROSIS

/ / ? •? •?

D. S. Korobko , N. A. Malkova ’ , E. A. Sokolova , M. L. Philipenko

1CBGH «Novosibirsk State Regional Clinical Hospital Minhealthsocdevelopment»

(Novosibirsk c.)

SEIHPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment» (Novosibirsk c.) 3SEBSE «Institute of chemical biology and fundamental medicine of the SB RAMS»

(Novosibirsk c.)

Retrospective and prospective research of 326 patients with multiple sclerosis (MS) on criteria of McDonald (2005) is performed. 25 family cases of RS are revealed. The familial risk of repeatability made 7,0%. 8 polymorphisms being mononucleotide replacements were genotyped with TaqMan technology: CD40 (rs6074022, rs1883832, rs1535045 and rs11086998), rs1800629 (TNFa), rs4149584 (TNFRSF1A), rs10492972 (KIF1B) and rs3135388. Features of PC familial phenotype — softer, innocent course with slow speed of progressing are revealed. The genealogical analysis confirms not Mendelian type of inheritance. Higher frequency of T allelic gene of rs3135388 polymorphism in group of PC familial phenotype is revealed.

Keywords: multiple sclerosis, familial cases, mononucleotide polymorphisms, rs3135388.

About authors:

Korobko Denis Sergeyevich — neurologist of Regional center of multiple sclerosis and other autoimmune diseases of nervous system at CBGH «Novosibirsk State Regional Clinical Hospital Minhealthsocdevelopment», office phone: 8 (383) 346-01-22, e-mail: [email protected]

Malkova Nadezhda Alekseevna — doctor of medical sciences, professor of clinical neurology and algology chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment, head of the Regional center of multiple sclerosis and other autoimmune diseases of nervous system at CBGH «Novosibirsk State Regional Clinical Hospital Minhealthsocdevelopment», office phone: 8 (383) 346-01-22, e-mail: [email protected]

Sokolova Ekaterina Alekseevna — engineer at SEBSE «Institute of chemical biology and fundamental medicine of the SB RAMS», office phone: 8 (383)-363-51-71, e-mail: [email protected]

Philipenko Maxim Leonidovich — head of pharmacogenomics group at SEBSE «Institute of chemical biology and fundamental medicine of the SB RAMS», office phone: 8 (383)-363-51-71, e-mail: [email protected]

List of the Literature:

1. Epidemiology and etiology of multiple sclerosis / A. N. Boyko, O. O. Phavorova, O. G. Kulakova, E. I. Gusev // In book: Multiple sclerosis / Under the editorship of E. I. Gusev,

I. A. Zavalishin, A. N. Boyko. — M, 2011. — P. 7-43.

2. Izhevskaya V. L. Some ethical aspects / V. L. Izhevskaya, S. I. Kozlova // Medical genetics. — 2004 . — № 4, 8. — P. 370-375.

3. Genetic and clinical features of familial multiple sclerosis in Novosibirsk / D. S. Korobko, N. A. Malkova, E. V. Bulatova [etc.] // Materials of the 12th interregional scientific and practical conf. «Topical issues of neurology» with discussion of related issues of neurology and medical genetics. — Novosibirsk, 2012. — P. 50-55.

4. Malkova N. A. Multiple sclerosis / N. A. Malkova, A. P. Iyerusalimsky. — Novosibirsk, 2006. — 197 P.