CC BY
122
УДК Б15.015/.03
ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ СУХОГО ЭКСТРАКТА ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО (SOLIDAGO CAUCASICA KEM.-NATH.)
В.В. Федотова, В.А. Челомбитько, Н.В. Постникова,
Пятигорский филиал ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет»
Федотова Виктория Владимировна - e-mail: [email protected]
В статье представлены результаты исследования фенольных соединений сухого экстракта золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.-Nath.), полученных методом ВЭЖХ. Впервые в экстракте идентифицированы рутин, лютеолин-7-гликозид, умбеллиферон, виценин, эскулетин, геспередин, галловая кислота, цикориевая кислота, хлорогеновая кислота, кофейная кислота. Изучено антибактериальное действие водных растворов сухого экстракта золотарника кавказского. Наиболее широкий спектр антибактериального действия и наибольшая его активность отмечены у 20%-го водного раствора экстракта в отношении S. aureus, S. epidermidis, Bacillus subtilis, Вас. anthracoides, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa.
Ключевые слова: сухой экстракт золотарника кавказского, фенольные соединения, ВЭЖХ,
антибактериальное действие.
In the paper are presented the results of research of phenolic compounds of a dry extract Goldenrod caucasian (Solidago caucasica Kem.-Nath.), which were received by HPLC. For the first time in the extract there were identified rutin, luteolin-7-glycoside, umbelliferone, vicenin, esculetin, hesperedin, gallic acid, chicory acid, chlorogenic acid and caffeic acid. Antibacterial action of water solutions of the dry extract Solidago caucasica Kem.-Nath. was studied. By the widest a spectrum of antibacterial action and its greatest activity it is noted at 20% water solutions of the extract in relation S. aureus, S. epidermidis, Bacillus subtilis, Вас. anthracoides, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa.
Key words: dry extract, Solidago caucasica Kem.-Nath., phenolic compounds,
HPLC, antibacterial action.
Введение
Эндем Кавказа - золотарник кавказский (БоИСадо саисаБ1са Кет.-1\1а№.) - многолетнее травянистое растение высотой до 70 см с мелкими желтыми цветками, собранными в колосовидное соцветие из сем. астровые (Asteraceae). Отличительными морфолого-анатомическими признаками этого вида и его сырья (травы) являются: 2-, 3-рядная обвертка, корзинки 15-20 мм шириной, цветоносы корзинок обычно без прицветников; клетки верхнего эпидермиса листа овальной, округлой или многогранной формы со слабоизвилистыми, равномерно утолщенными стенками, особенно на нижней стороне; морщинистость кутикулы выражена слабо; устьица расположены преимущественно на нижнем эпидермисе, околоустьичных клеток 4-5 (аномо-цитный тип); трихомы двух типов: железистые (короткие на одно-, двухклеточной ножке и с одноклеточной головкой) и простые (многоклеточные остроконусовидные, тонкостенные, с гладкой поверхностью) [1].
Трава золотарника кавказского нами была впервые изучена на содержание некоторых биологически активных веществ. Установлено, что в его сырье содержатся фенольные соединения (рутин, умбеллиферон, виценин, эскулетин, дигидрокумарин, геспередин, галловая кислота, цико-риевая кислота, хлорогеновая кислота, кофейная кислота) [2]; органические кислоты (лимонная, яблочная, янтарная) [3]; аминокислоты (аспарагиновая кислота, треонин, серин, глутаминовая кислота, глицин, аланин, валин, метионин, лейцин, изолейцин, тирозин, фенилаланин, гистидин, лизин, аргинин); 5 макроэлементов и 16 микроэлементов [4].
Ввиду того, что водно-спиртовые экстракты других видов рода БоИСадо входят во многие отечественные и иностранные индивидуальные и комбинированные препараты, пред-
ставляло интерес изучить его фенольные соединения и антибактериальное действие полученного нами водноспиртового экстракта.
Приводим основные препараты на основе видов рода Solidago, широко представленные на европейском фармацевтическом рынке [5]:
1. Цистиум солидаго раствор (Pharma Wernigerode GmbH, Deutschland) - водный раствор сухого экстракта Solidago gigantea; оказывает диуретическое, противовоспалительное, спазмолитическое действие, применяется для лечения и профилактики воспалительных заболеваний мочевыводящих путей и мочекаменной болезни.
2. Солидагорен моно (Klein, Deutschland) - таблетиро-ванная форма сухого экстракта Solidago, применяется при нефрите и мочекаменной болезни.
3. Марелин (Украина): сухие экстракты Rubia tinctorum, Equisetum arvense, Solidago canadensis, магния фосфат одно-замещенный, коргликон, келлин, салициламид. Таблетки проявляют спазмолитическое, противовоспалительное действие, способствуют отхождению почечных конкрементов, снимают боли при почечной колике.
4. Простанорм (Фармстандарт-Томскхимфарм ОАО, Россия): экстракт из смеси сырья - травы Hypericum perforatum L., травы Solidago canadensis L., корня Glycyrrhiza glabra L., корневищ с корнями Echinacea purpurea L. Таблетки или водно-спиртовая жидкость для приема внутрь обладают андрогенной, противовоспалительной, анальгезирующей, диуретической и улучшающей микроциркуляционную активность в простате.
5. Фитодолор (Steigerwald Arzneimittelwerk GmbH, Deutschland): водно-спиртовые экстракты Populus tremula, Solidago virgaurea, Fraxinus excelsior. Раствор для приема
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
внутрь оказывает противовоспалительное, анальгетическое, цитостатическое действие и применяется при хроническом полиартрите.
По литературным сведениям антибактериальным действием обладает водно-метанольный экстракт Solidago virgaurea L. (в отношении Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, Enterobacter fecalis) [6], водно-этанольный и гексано-вый экстракты Solidago virgaurea L., Solidago canadensis L., Solidago gigantea Ait. (в отношении Staphyllococcus aureus, Staphyllococcus faecalis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa) [7].
Цель исследования - изучение фенольных соединений сухого экстракта золотарника кавказского методом ВЭЖХ и исследование его антибактериального действия.
Материалы и методы
Объектом исследования являлся сухой экстракт травы золотарника кавказского, собранной во время цветения в субальпийской зоне в Даутском ущелье Карачаево-Черкесской Республики в августе 2011 г. Экстракт получен по схеме: 1) экстракция 50% спиртом этиловым методом дробной мацерации в 4-й стадии; 2) фильтрация полученного извлечения; 3) упаривание до густого состояния; 4) сушка полочная под вакуумом. Выход конечного продукта 24%.
Изучение фенольных соединений
Изучение качественного состава фенольных соединений сухого экстракта золотарника кавказского проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы GILSON, модель 305,Франция; инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 USA с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром» для Windows.
В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка размером 4,6х250 мм Kromasil C18, размер частиц 5 микрон.
В качестве подвижной фазы метанол-вода-кислота фосфорная концентрированная, в соотношении 400:600:5. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин. Продолжительность анализа 50 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора GILSON UV/VIS модель 151 при длине волны 254 нм, 360 нм.
Для исследования около 0,6 г (точная навеска) сухого экстракта золотарника кавказского помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 20 мл 70% спирта этилового, помещали в ультразвуковую баню и перемешивали при температуре 50°С в течение 15 минут. Объём раствора доводили до метки тем же растворителем (исследуемый раствор).
Параллельно готовили серию 0,05% растворов сравнения в спирте этиловом 70%: рутина, кверцетина, лютеолина,
лютеолин-7-гликозида, галловой кислоты, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, гиперозида, геспередина, апиге-нина, кемпферола, феруловой кислоты, цикориевой кислоты, умбеллиферона, дигидрокумарина, скополетина, эску-летина, виценина, кумарина, дикумарина, дигидрокверци-тина, катехина, эпикатехина.
По 20 мкл исследуемых растворов и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали по вышеприведенной методике.
Количественное определение фенольных соединений в пересчете на рутин в сухом экстракте золотарника кавказского методом ВЭЖХ
Около 0,5 г (точная навеска) сухого экстракта помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 20 мл спирта этилового 70%, помещали в ультразвуковую баню и перемешивали при температуре 50°С в течение 15 минут. Объём раствора доводили до метки тем же растворителем (исследуемый раствор).
Параллельно готовили раствор РСО рутина в спирте этиловом 70%. Для этого около 0,020 г (точная навеска) рутина помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 20 мл спирта этилового 70%, перемешивали до растворения и доводили объём до метки тем же растворителем (РСО).
По 20 мкл исследуемого раствора и раствора РСО вводили в хроматограф и хроматографировали по вышеприведенной методике.
Расчёт количественного содержания рутина производили методом абсолютной калибровки с помощью компьютерной программы «Мультихром» для «WinСows» и с помощью формулы:
„ Бис.ХСХБОХ 100X100 х“ Бст.Х 25 ХаХ(100-\Л/)
где:
Б ис. - площадь пика рутина в исследуемом растворе;
Б ст. - площадь пика стандартного раствора РСО рутина;
Х - концентрация рутина, в %;
С - концентрация РСО рутина, в г;
а - навеска сухого экстракта, в г;
W - потеря в массе при высушивании, в %.
Определение антибактериального действия
Для определения антибактериального действия были приготовлены водные растворы сухого экстракта золотарника кавказского в концентрациях 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1%.
Антибактериальное действие полученных растворов изучали способом «колодцев». Способ основан на диффузии испытуемых веществ из «колодцев» в питательный агар, засеянный различными тест-культурами. Этот принцип диффузии положен в основу фармакопейного метода определения антимикробной активности антибиотиков [8].
При выполнении метода толстый слой агара в чашках Петри засевали 2 мл 100-млн взвесей суточных тест-культур, излишек взвесей удаляли, чашки подсушивали; сверлом диаметром 6 мм пробуравливали отверстия («колодцы») на расстоянии 2,5 см от центра и на одинаковом расстоянии друг от друга. Колодцы заполняли исследуемыми растворами экстракта. Через 16-18 часов инкубации в термостате измеряли диаметры зон отсутствия и угнетения роста.
Результаты и их обсуждение
Результаты проведенных исследований приведены в таблицах 1, 2 и на рисунке. Установлено, что количественное содержание фенольных соединений в пересчете на рутин в траве золотарника кавказского составляет 3,056%.
Проведенные исследования выявили антибактериальное действие (преимущественно бактерицидного характера) по отношению как к грамположительным бактериям: стафилококкам (тест-культуры №№ 1-3) и бациллам (тест-культуры №№ 5-7), так и к грамотрицательным бактериям: протею
ТАБЛИЦА 1.
Результаты идентификации фенольных соединений сухого экстракта золотарника кавказского методом ВЭЖХ (детектирование при длине волны 360 нм)
(тест-культура № 8), Е. coli M-17 (тест-культура № 9), синегнойной палочке (тест-культура № 11).
Отмечена зависимость спектра антибактериального действия и степени его выраженности от концентрации экстракта в растворе.
Так, спектр антибактериального действия у 5%-го, 2,5%-го, 1%-го растворов включал соответственно к 7, 6 и 2 тест-культурам (из 11), тогда как и у 20%-, и 10%-го растворов он был заметно шире (и одинаков): 9 из 11 тест-культур.
Степень выраженности антибактериального действия у 2,5%-го и особенно 1%-го растворов была низкой; диаметр зоны задержки (отсутствия) роста составлял 7-8 мм (за исключением диаметра зоны задержки роста 16 мм по
отношению к 11-й тест-культуре), и антибактериальное действие было преимущественно бактериостатического характера.
ТАБЛИЦА г.
Антибактериальное действие экстракта золотарника кавказского
Объекты Тест-культуры
1 г 3 4 Б б 7 а 9 10 11
Диаметры зон задержки роста в мм
Ї Ї5* Ї7* Ї9* - Ї2* Ї2* 9* Ї9 Ї5* - ЇВ
2 Ї5* Ї5* ЇВ* - 9* ЇЇ* В* Ї9 Ї4* - ЇВ
3 В* 7 ЇЇ* - В* 9* - - Ї0* - ЇВ
4 В* 7 В - - В* - - 7 - Ї6
5 - 7 - - - 7* - - - - -
Условные обозначения: - диаметр зоны задержки роста отсутствует; цифра со значком* - диаметр зоны отсутствия роста (бактерицидное действие); цифра без значка - диаметр зоны угнетения роста (бактериостатическое действие). Объекты: 1 - 20%-й водный раствор экстракта; 2 - 10%-й раствор;
3 - 5%-й раствор; 4 - 2,5%-й раствор; 5 - 1%-й раствор экстракта. Тест-культуры: 1 - S. aureus (Макаров); 2 - S. aureus Type; 3 - S. epidermidis Wood-46; 4-Escherichia coli 0-55; 5 - Bacillus subtilis L2; 6 - Вас. anthracoides-96; 7 - Вас. anthracoides-1; 8 - Proteus vulgaris; 9 - E. coli M-17; 10 - E. coli 675; 11- Pseudomonas aeruginosa.
Несколько выше была выраженность антибактериального действия (с преобладанием бактерицидного действия над бактериостатическим) у 5%-го раствора: диаметр зон задержки (отсутствия) роста колебался от 7 до 11 мм по отношению к стафилококкам (тест-культуры №№ 1-3) и бациллам (тест-культуры №№ 5, 6) и 10 мм, 18 мм по отношению к эшерихиям (тест-культура № 9) и синегнойной палочке (тест-культура № 11) соответственно.
Существенно выше была выраженность антибактериального действия у 20%-го раствора: по отношению к стафилококкам, энтеробактериям (протею и эшерихиям) и синегнойной палочке диаметр зоны задержки (отсутствия) роста колебался от 15 до 19 мм и от 9 до 12 мм - по отношению к бациллам. При этом антибактериальное действие по отношению к 7 (№№ 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9) тест-культурам из 9 было бактерицидным.
Название Время, мин. Высота, mV Площадь, mVXсек. ФО Конц.
галловая кислота 3,Ї2 252,6В 5В3Ї,55 Ї 6,Ї6
неидент. 3,54 Ї69,23 4ВЇ6,4В Ї 5,09
умбеллиферон 4,Ї69 559,3В Ї60В2,Ї Ї Ї6,9В
цикориевая кислота 5,6Ї 74,29 ЇВ24,4 Ї Ї,93
хлорогеновая кислота 5,ВВ5 70,4Ї 24ВВ,69 Ї 2,63
виценин 6,65В 54,9Ї 3Ї32,Ї6 Ї 3,3Ї
зскулетин 7,977 7В,4Ї ЇВ49,3В Ї Ї,95
кофейная кислота В,427 ЇВ4,55 Ї0762,Ї2 Ї ЇЇ,36
гесперидин Ї2,5 3Ї2,ВЇ Ї7В53,34 Ї ЇВ,В5
рутин Ї3,9Ї 206,95 Ї47Ї2,4Ї Ї Ї5,53
неидент. Ї6,79 2Ї,2Ї Ї40Ї,3В Ї Ї,4В
неидент. Ї7,В6 Ї5,92 Ї3Ї9,34 Ї Ї,39
лютеолин-7-гликозид 20,2 ВЇ,3В 6ЇВ5,53 Ї 6,53
неидент. 22,02 Ї9,2В ЇВ93,34 Ї 2
неидент. 25,03 9,06 Ї574,43 Ї Ї,66
неидент. 30,09 3,45 Ї0Ї0,2Ї Ї Ї,07
неидент. 3В,67 Ї4,65 ЇВ57,04 Ї Ї,96
неидент. 45,92 -0,02 ЇЇЇ,74 Ї 0,Ї2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48мин
РИС.
ВЭЖХ фенольных соединений сухого экстракта золотарника кавказского (длина волны детектирования 360 нм).
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Степень выраженности антибактериального действия у 10%-го раствора по отношению к стафилококкам (тест-культуры №№ 1-3) и грамотрицательным бактериям (№№ 8, 9, 11) существенно не отличалась от антибактериального действия 20%-го раствора, будучи несколько слабее по отношению к бациллам (№№ 5-7).
Выводы
Методом ВЭЖХ впервые установлено содержание в сухом экстракте золотарника кавказского 18 фенольных соединений, из которых идентифицированы рутин, лютеолин-7-гликозид, умбеллиферон, виценин, эскулетин, геспередин, галловая кислота, цикориевая кислота, хлорогеновая кислота, кофейная кислота. Определено количественное содержание фенольных соединений в пересчете на рутин -3,056%. Выявлено антибактериальное действие различной концентрации водных растворов сухого экстракта травы золотарника кавказского. Наиболее широкий спектр антибактериального действия отмечен у 20%-го водного раствора экстракта в отношении S. aureus, S. epidermidis, Bacillus subtilis, Вас. anthracoides, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa. Антибактериальное действие 10%-го раствора существенно не отличалось от 20%-го раствора, но было существенно ниже у 5%-го, 2,5%-го растворов и почти отсутствовало у 1%-го раствора.
ЛИТЕРАТУРА
1. Федотова В.В., Челомбитько В.А. Анатомо-диагностическое изучение золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.-Nath.) флоры Северного Кавказа. Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. ПятГФА. 2012. Вып. 67. С. 128-131.
2.Федотова В.В., Челомбитько В.А. Изучение фенольных соединений золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.-Nath.) Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина, Фармация. 2012. № 10 (129). Вып. 18. С. 175-177.
3.Федотова В.В., Охремчук А.В., Челомбитько В.А. Изучение органических кислот золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.-Nath.) и черноголовника многобрачного (Poterium polygamum Waldst. & Kit.) Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина, Фармация. 2012. № 16 (135). Вып. 19. С. 173-175.
4. Федотова В.В., Челомбитько В.А. Аминокислотный и минеральный состав травы золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.-Nath.) Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес: сб. науч. тр. БелГУ. 2012. С. 184-187.
5.Федотова В.В., Челомбитько В.А. Виды рода золотарник (Solidago): значение для медицинской практики, перспективы изучения. Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина, Фармация. 2012. № 16 (135). Вып. 19. С. 136-145.
6.Demir H., Adk L., Bali E.B., Юх L.Y., Kaynak G. Antioxidant and antimicrobial activities of Solidago virgaurea extracts. African Journal of Biotechnology. 2009. Vol. 8. № 2. P. 274-279.
7. Kolodziej B., Kowalski R., Kedzia B. Antibacterial and antimutagenic activity of extracts aboveground parts of three Solidago species: Solidago virgaurea L., Solidago canadensis L. and Solidago giganteа Ait. Journal of Medicinal Plants Research. 2011. Vol. 5. № 31. P. 6770-6779.
8. Государственная фармакопея Российской Федерации, XII изд., часть I. М.: «Научный центр экспериментальных средств медицинского применения», 2007. 704 с.
Ш
