CC BY
44
УДК 636.4.087.7:620.3:612
ОСОБЕННОСТИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА У СВИНЕЙ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ НАНОКАПСУЛИРОВАННОГО ПРОБИОТИКА И СЕЛЕНСОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА
Сеин О.Б., доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО Курская ГСХА E-mail: [email protected]
Масалов В.Н., доктор биологических наук Прудникова Е.Г., кандидат сельскохозяйственных наук, доцент ФГБОУ ВПО Орел ГАУ E-mail: biodek2008@yandex. ru
Долженков А.А., Чернов В.Е., аспиранты ФГБОУ ВПО Курская ГСХА E-mail: [email protected]
АННОТАЦИЯ
В статье приводятся результаты проведенных исследований по влиянию нанокапсулированного препарата, условно названного «ВетСел», содержащего пробиотик «Ветом 1.1» и микроэлемент селен в его органической форме в виде селенометионина и селеноцистенина (препарат «Сел-Плекс»), на физиологический и биохимический статус свиней. Показано, что нанокапсулированный препарат в результате выраженной устойчивости к агрессивной кислой среде желудка, предотвращает разрушение пробиотических бактерий и позволяет доставить большую их часть в кишечник в жизнеспособном состоянии. Установлено, что использование нанокапсул с пробиотиком и селеном у опытных, по сравнению с контрольными и животными, получавших препараты «Сел-Плекс» и «Ветом 1.1» отдельно, привело к значительному повышению содержания в крови гемоглобина, общего белка, альбуминов, витаминов А и С на фоне снижения малонового диальдегида и физиологической норме активности аланинаминотрансфераз и аспартатаминотрансфераз. Используемый препарат способствовал интенсификации обмена веществ у опытных животных, о чем свидетельствует высокое содержание в крови глюкозы - основного энергетического эквивалента клетки. Кроме того, у животных под воздействием нанокапсулированного препарата выявлено увеличение в органах и тканях белкового азота, что также указывает на высокий уровень метаболизма. В конечном итоге, в результате интенсификации метаболических процессов у свиней, получавших комбинированный препарат в виде нанокапсул, показано увеличение среднесуточных приростов живой массы. Физическая оценка нанокапсул с помощью атомно-силовой сканирующей микроскопии показала наличие у инкапсулированного препарата супрамолекулярных свойств. В опытах in vitro при инкубации фильтрата содержимого кишечника с внесением препарата в нем обнаруживалось 1,0105 бактерий. При этом в инкубированном фильтрате желудка пробиотических бактерий не выявлено. На лабораторных животных и собаках показано, что препарат «ВетСел» не токсичен и не вызывает аллергических реакций, что, несомненно, повышает ценность используемых нанокапсул.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Кровь, нанокапсулы, препарат, пробиотик, свиньи, селен, физиологический статус.
Из множества различных препаратов, применяемых в животноводстве в качестве балансирующих кормовых добавок, регулирующих пищеварение и в целом обменные процессы в организме, в последние годы особое внимание стали уделять пробиотикам,
что связано с их уникальными и многосторонними свойствами [6, 11]. Пробиотики способны подавлять патогенную и условно патогенную микрофлору за счёт продукции биологически активных веществ, они участвуют в нормализации моторики желудочно-кишечного тракта, в образовании аминокислот и процессах всасывания [7, 8, 9, 10].
Известно также, что пробиотическая микрофлора детоксицирует соли тяжёлых металлов за счёт перевода их в нетоксические соединения, инактивирует попадающие извне или образующиеся в организме потенциальные токсические продукты, в том числе и канцерогены [3, 14].
Важной особенностью пробиотиков является способность предотвращать прикрепление патогенной микрофлоры к эпителию слизистой оболочки кишечника, её нейтрализации путём агглютинации, бактериостаза и других бактерицидных механизмов [16]. Поэтому пробиотики используют не только для восстановления микрофлоры кишечника, но и с целью профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта у животных [1, 2, 4, 12, 15].
Несмотря на то, что количество пробиотических препаратов с каждым годом увеличивается, многие вопросы, связанные с их применением в животноводстве, остаются неизученными. Необоснованные дозировки, безсистемное применение без учёта взаимоотношений пробиотической микрофлоры и макроорганизма зачастую приносит не пользу, а вред.
Имеются новые данные [5], указывающие на то, что остаточные количества пробиотических микроорганизмов, которые достигают толстого отдела кишечника в жизнеспособном состоянии, являются чужеродными для естественной микрофлоры.
Немаловажной задачей для исследователей является получение пробиотических препаратов, устойчивых к кислой среде желудка животных. Пробиотические микроорганизмы, попадая в желудок, испытывают действие соляной кислоты и ферментов, находящихся в желудочном соке.
Экспериментально подтверждено, что количество колониеобразующих единиц после прохождения пробиотиком желудка снижается на 4-6 порядков, и в кишечник с его благоприятной средой попадает лишь незначительная часть пробиотических микроорганизмов, способных образовывать жизнеспособные колонии [13].
Для защиты пробиотиков от «агрессивной» среды желудка в медицинской практике применяются капсулированные пробиотические препараты с использованием желатиновых или полимерных капсул. Однако перспектива их использования в животноводстве и ветеринарной медицине не высокая, так как данные препараты имеют относительно высокую стоимость и требуют индивидуального введения.
Принимая во внимание актуальность и научно-практическую значимость указанной проблемы, целью наших исследований являлось изготовление нанокапсулированного препарата и изучение его влияния на физиологический статус свиней.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проводили на кафедре органической и аналитической химии Юго-Западного государственного университета (ЮЗГУ), кафедре терапии и акушерства Курской ГСХА и лечебно-диагностическом Центре Орловского ГАУ. Работа состояла из трёх экспериментов.
Во время первого эксперимента был изготовлен нанокапсулированный препарат, условно названный нами «ВетСел», который включал в свой состав пробиотик «Ветом 1.1» и селенсодержащий препарат «Сел-Плекс». Пробиотик «Ветом 1.1» представляет собой комплекс бактерий Bacillussubtilis рекомбинантного штамма ВКПМ В-10641, а препарат «Сел-Плекс» - органическую форму селена (селенометионин и селеноцистеин).
Подбор основных частей препарата «ВетСел» был не случайным, пробиотик «Ветом 1.1» и селенсодержащий препарат «Сел-Плекс» обладают уникальными биологическими свойствами, дополняющими друг друга.
Нанокапсулирование препарата проводили по технологии, разработанной профессором А.А. Кралевцом (ЮЗГУ). Физическую оценку препарата «ВетСел» осуществляли с использованием атомно-силовой сканирующей электронной микроскопии. Биологические свойства препарата определяли на лабораторных животных и беспородных собаках согласно Методическим рекомендациям «Оценка безопасности наноматериалов (приказ Роспотребнадзора № 280 от 12.10.2007).
Второй эксперимент был посвящен определению свойств препарата «ВетСел» в условиях in vitro, моделирующих пищеварение в организме свиней. Для этого при убое свиней отбирали содержимое желудка и тонкого отдела кишечника и подвергали его пресс-фильтрации, фильтрации через марлево-ватный фильтр и центрифугированию. Полученный центрифугат пропускали под давлением последовательно через керамический и стеклянный бактериальные фильтры.
В пробирке с фильтратами содержимого из различных участков желудочно-кишечного тракта свиней вносили 1 дозу препарата «ВетСел» и проводили инкубацию при 37°С в течение 4 и 12 часов. После инкубации подсчитывали общее количество бактерий в камере Горяева.
В третьем научно-производственном эксперименте изучали физиологический и биохимический статус у свиней после скармливания препарата «ВетСел». Исследования проводили в ООО «Надежда» Курской области и ЗАО свинокомплекс «Ивановский» Белгородской области. Было сформировано три группы поросят 2-месячного возраста с соблюдением принципа аналогов. Поросятам первой опытной группы скармливали препарат «ВетСел». Поросята второй опытной группы получали препараты «ВетСел» и «Сел - Плекс». Поросята третьей группы являлись контролем. Животные всех групп находились в одинаковых условиях и получали одинаковый рацион.
У животных всех групп в 2 и 6-месячном возрасте брали кровь, в которой определяли содержание биохимических компонентов с использованием наборов реактивов «Био-Ла-Тест» и «Клини-Тест», а также биохимического анализатора ILAB-650.
В 6 месяцев в каждой группе было убито по 3 животных. После убоя отбирали пробы тканей печени, длиннейшей мышцы спины и стенки тонкого отдела кишечника для биохимического анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты первого эксперимента показали, что каждая нанокапсула представляет собой «контейнер» сферической, или близкой к ней, формы (рис.1), состоящий из оболочки и внутреннего содержимого (пробиотика и селенсодержащего препарата).
Рисунок 1 - Схематическое изображение структуры нанокапсулы препарата «ВетСел»
Исследование поверхности капсул с использованием атомно-силового сканирующего электронного микроскопа, совмещённого с конфокальной микроскопией на микроспектрометре Omega Scope, показало, что поверхность нанокапсул имеет неоднородную структуру, что значительно увеличивает её рабочую поверхность.
Попадая в водный раствор, нанокапсулы, при их достаточно низкой
концентрации, создают фрактальные композиции, обладающие самоорганизацией. При этом исследования показали, что образование нанокапсул происходит спонтанно за счёт нековалентных взаимосвязей, это свидетельствует о характерной для нанокапсул самосборке. Следовательно, инкапсулированные препараты обладают супрамолекулярными свойствами.
Исследования фармакокинетических свойств нанокапсулированного препарата, проведённые на лабораторных животных и собаках, показали, что он не токсичен, не вызывает аллергических реакций и других побочных действий.
В ходе проведения второго эксперимента было установлено, что после 4-часовой инкубации в фильтрате содержимого из желудка пробиотические бактерии не обнаруживались (рис. 2). При инкубации фильтрата содержимого кишечника после внесения в него препарата «ВетСел» через 4 часа обнаруживалось 1,0105 бактерий.
Рисунок 2 - Схема локализации нанокапсулированного препарата «ВетСел» в желудочно-кишечном тракте свиньи
Разумеется, созданная нами модель in vitro не может полностью соответствовать физиологическому состоянию желудочно-кишечного тракта животного в естественных условиях, тем не менее, полученные результаты указывают на то, что кислоустойчивые нанокапсулы в желудочном соке разрушаются в незначительном количестве. Однако, попав в тонкий отдел кишечника, оболочка «наноконтейнеров» вскрывается, и их содержимое выходит в полость кишечника, изменяя его микробиоценоз.
Результаты третьего научно-производственного эксперимента показали, что у свиней, получавших нанокапсулированный препарат «ВетСел», были больше среднесуточные приросты массы тела в среднем по сравнению с контролем на 60-65 г. Препарат обладал выраженным биологическим действием. После его скармливания у свиней 6-месячного возраста повышалось содержание в крови гемоглобина (111,0 ± 1,97 г/л), общего белка (65,5 ± 5,59 г/л), альбуминов (43,0 ± 0,31%). У животных 2 опытной группы содержание этих компонентов крови было меньше и соответственно составляло - 105,5 ± 2,13 г/л; 63,3 ± 0,82 г/л; 42,0 ± 0,46 %; а у свиней 3 контрольной группы - 98,5 ± 0,84 г/л; 62,9 ± 0,96 г/л; 40,5 ± 0,56%.
Положительной особенностью являлось относительно высокое содержание в крови свиней 1 опытной группы гамма-глобулинов (21,8 ± 0,40%) по сравнению с контрольными животными (18,0 ± 0,21%), что, в определённой степени, указывает на более высокую неспецифическую резистентность их организма.
Более низкое содержание в крови свиней, получавших препарат «ВетСел», малонового диальдегида (1,44±0,04-1,56±0,06 мкмоль/л) и, наоборот, высокое содержание витаминов А (0,88±0,04-0,97±0,04 мкмоль/л), Е (7,8±0,10-9,4±0,23 мкмоль/л) и С (17,6±0,41-18,3±0,32 мкмоль/л) по сравнению со свиньями контрольной группы (1,8±0,02-1,92±0,05 мкмоль/л; 0,76±0,04-0,08±0,04 мкмоль/л; 7,2±0,24-7,3±0,12 мкмоль/л; 15,4±0,30-16,1±0,30 мкмоль/л) свидетельствует об антиоксидантных
свойствах препарата.
Из других особенностей проведённого нами биохимического анализа крови следует остановиться на результатах исследования селена, содержание которого в крови свиней опытных групп в среднем на 2,4-3,0 мкг/100 мл было больше, чем у контрольных животных. Также отмечено, что у свиней, получавших препараты, ферментативная активность АЛТ (0,62±0,04- 0,66±0,02 ммоль/ч*л) и ACT(0,65±0,02-0,77±0,02 ммоль/ч*л) была несколько выше, чем в контроле (0,62±0,03- 0,71±0,04 ммоль/ч*л), однако эти данные являлись статистически недостоверными (Р>0,05) и не выходили за границы физиологических норм. Это свидетельствует о том, что используемые препараты не оказывали повышенной «нагрузки» на печень.
Более высокое содержание глюкозы в крови свиней опытных групп (2,93±0,05-3,05±0,02 ммоль/л), чем у контрольных животных (2,70±0,02-2,85±0,05 ммоль/л), связано с обеспечением интенсивного обмена веществ энергетическим материалом у свиней, получавших препараты.
В то же время, при исследовании общего кальция и неорганического фосфора нами не было выявлено достоверных различий (Р>0,05) их содержания в крови опытных (Са-2,63 ± 0,04-2,71 ± 0,04 ммоль/л; Р-1,58 ± 0,02-1,63 ± 0,04 ммоль/л) и контрольных (Са-2,70 ± 0,05-2,74 ± 0,05 ммоль/л; Р-1,51 ± 0,02-1,60 ± 0,02 ммоль/л) животных.
Результаты исследования белкового азота в органах и тканях подопытных свиней представлены в таблице 1, из которой следует, что его содержание было больше у животных, получавших препарат «ВетСел», чем у свиней 2 и 3 групп. При этом по сравнению с контролем полученные данные были статистически достоверными (Р<0,05).
Таблица 1 - Содержание белкового азота в крови и органах подопытных свиней, г%
Группа Кровь Стенка тонкого Длиннейшая Печень
отдела кишечника мышца спины
1 (опытная) 1,88±0,02 2,48±0,03 2,69±0,03 2,71±0,03
2 (опытная) 1,79±0,01 2,40±0,02 2,58±0,04 2,68±0,04
3(контрольная) 1,45±0,02 2,08±0,06 2,42±0,04 2,57±0,04
* -при Р<0,05 по сравнению с контролем.
Более высокое содержание белкового азота в крови и органах свиней, получавших препараты, по-видимому, связано с высоким уровнем метаболизма как местного направления - в кишечнике, так и общего - во всём организме под действием пробиотической микрофлоры и селена.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты проведённых нами исследований указывают на то, что нанокапсулированный препарат «ВетСел» обладает выраженной устойчивостью к кислой среде желудка. Нанокапсулы предотвращают разрушение пробиотических бактерий и позволяют доставлять их в конечную точку назначения - кишечник.
Препарат «ВетСел» можно рекомендовать к использованию как при выращивании свиней, так и других видов домашних животных.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Алимов А.М. Лечебно-профилактическое значение пробиотиков при желудочно-кишечных инфекциях поросят и цыплят / А.М. Алимов, М.Ш. Алиев // Акткальные проблемы биологии в животноводстве: Тез. докл. 3й междунар.конф. - Боровск, 2000. - С. 382-383.
2. Бабина М.П. Пробиотики в профилактике желудочно-кишечных заболеваний и гипоавитаминозов животных и птицы /М.П. Бабина, И.М. Карпуть // Аналит.обзор
Белнаучцентринфоммаркетинг АПК. - Мн, 2001. - 28 с.
3. Бондаренко В.М. Механизм действия пробиотических препаратов / В.М. Бондаренко, Р.П. Чуприна, Т.В. Мацулевич // БИОпрепараты. - 2003. - №3. - С.2-5.
4. Данилевская Н.В. Фармакологические аспекты применения пробиотиков / Н.В. Данилевская // Ветеринария. - 2005. - №11. - С.6-11.
5. Драмов И.В. Сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro / И.В. Драмов, И.Ю. Чичерин, А.С. Ердякова и др. // Кишечная микрофлора, взгляд изнутри: сб. научных статей. Вып.1, ВятГУ. - 2012. - С.11-16.
6. Коваленко В.Ф. Применение пробиотиков в свиноводстве / В.Ф. Коваленко, А.А. Биндюг, С.Г. Зиновьев // Современные проблемы интенсификации производства свинины: мат. науч. - практич. конф. - Ульяновск, 2007. - Т.2. - С.124-130.
7. Некрасов Р.В. Использование пробиотиков нового поколения в кормлении свиней / Р.В. Некрасов, Н.А. Ушакова // Актуальные проблемы биологии в животноводстве. -Боровск, 2010. - С. 292-293.
8. Панин А.Н. Пробиотики - неотъемлемый компонент рационального кормления животного / А.Н. Панин, Н.И. Малик // Ветеринария. - 2006. - №6. - С. 3-6.
9. Рамонова Э.В. Эффективность использования пробиотиков в кормлении свиней / Э.В. Рамонова, Р.Г. Кабисов, Б.Г. Цугкиев // Аграрная наука. - 2010 - №11. - С. 2223.
10. Сидоров М.А. Пробиотики в ветеринарии / М.А. Сидоров, В.В. Субботин, Н.В. Данилевская // Ветеринария. - 2000. - №11. - С. 17-22.
11. Учасов Д.С. Влияние пробиотика «Биокорм Пионер» на неспецифическую резистентность и продуктивность поросят / Д.С. Учасов // Научные проблемы производства продукции животноводства и улучшения ее качества: сб.науч.тр.межд. науч.-практич.конф. - Брянск. - 2007. - С. 367-378.
12. Учасов Д.С. Неспецифическая резистентность организма свиноматок и поросят при применении пробиотиков: Автореф. дис. на соиск. уч. степ. канд. биол. наук / Д.С.Учасов - Орел, 2006. - 22 с.
13. Чичерин И.Ю. Выживаемость бифидобактерий и лактобактерий в условиях invitro в желудочном соке и дуоденальном содержимом людей / И.Ю.Чичерин, И.В. Драмов, И.П. Погорельский и др. // Кишечная микрофлора, взгляд изнутри: сб. научных статей. Вып.1, ВятГУ. - 2012. - С. 7-11.
14. Grill J.P. Effect of bifidobacteria on nitrites and nitrosamines / J.P. Grill, J. Crociani, J. Ballongue // Letts. Appl. Microbiol. 1995. - V.20. - P. 328-330.
15. Kastel R. The effect of probiotics potentiated with polyunsaturated fatty acids on the digestive tract of germ-free piglets / R. Kastel, A. Bomba, L. Vaskol // Vet.Med. - 2007. -52: 63-68.
16. Hunter J.O. A review of the role of the gut microflora in irritable bowel syndrome and the effects of probiotic / J.O. Honter, J.A. Madden // Br.J.Nutr. 2002. - V.88. - P. 67-72.
