CC BY
25
BÍCHMK Украгнсъког жедичног стоматологгчног акадежШ
УДК 576.35-546.92
ФАЗОСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПОЛИПЛАТИЛЛЕНА
Шалимов С.А., Волченскова И.И., Яценко Л.Д., Майданевич H.H., Корчевая Л.М., Нежина М. В., Майданевич H.H., Ленок Е.В..
Институт онкологии АМН Украины, г. Киев
Изучено влияние дозо-временных нагрузок противоопухолевого лекарственного препарата поли-платиллена на пролиферативную активность и распределение по фазам клеточного цикла культивированных in vitro клеток. Показано, что антипролиферативная активность обусловлена неспецифической цитотоксичностью при пролонгирующем действии высоких доз препарата, в то время как специфическая антипролиферативная активность вызвана его способностью блокировать клетки в S-фазе и синхронизировать клеточные популяции в G 1 фазе клеточного цикла при малых дозах и длительном действии.
Ключевыеслова: культуры клеток, антипролиферативная активность, цитотоксичность, полиплатиллен, фагоспецифичность.
чебных мероприятий клинической онкологии. Объект и методы исследования Синтез полимерного комплекса I и приготовление на его основе полиплатиллена осуществляли по методике [10]. Цитологическую активность препарата изучали на монослойных и суспензионных культурах перевиваемых опухолевых и нормальных клеток: НЕР-2 (клетки карциномы гортани человека), VERO (клетки почки зеленой мартышки), СПЭВ ^трансформированные клетки эпителия почки эмбриона свиньи), RH (клетки почки эмбриона человека). Клетки выращивали при 37°С на поверхности стекла во флаконах вместимостью 1,5 л. Посев проводили в концентрации 2,5*10 кп./мл с плотностью 2*104 клеток на 1 см2. Выращивали
Вступление
Внедрение в клиническую химиотерапевтиче-скую практику цисплатины позволило повысить эффективность лечения до 25-30% [2,4]. Химиотерапия с применением препаратов платины улучшает результаты на разных этапах лечения. Однако отсутствие избирательного действия на опухоль, приводит к неизбежному развитию токсических побочных реакций и осложнений [3,5]. Именно токсичность химиотерапии лимитирует в большинстве случаев проведение лечения в полном объеме.
Принципиально важным прогрессом в области противоопухолевого лечения платиносодержа-щими препаратами является использование соединений комплексов платины с биополимерами в реакциях нукпеофильного замещения, обладающих существенно более высокой биосовместимостью и низкой токсичностью [6,7]. Было установлено, что иммобилизация цис-дихлорамминоплатины (ДДП, цисплатин) на ДНК значительно (приблизительно в 10 раз) снижает общую токсичность высоких доз препарата и обеспечивает преодоление лекарственной устойчивости. ДНК в качестве носителя способствует усиленному накоплению препарата растущей опухолью при сохранении иммунологической активности и существенно пролонгирует противоопухолевый эффект комплексного препарата. Биологические основы терапевтического действия макромолекулярных комплексов платины с ДНК до сих пор не были изучены, поэтому необходимо исследовать различные виды их активности, в часности цитологической, которая проявляется в результате нарушения закономерностей клеточного размножения, приводящего в конечном итоге к гибели опухолевых клеток.
Цель исследования заключалась в определении антипролиферативной активности и фазос-пецифичности полиплатиллена in vitro. Данные о влиянии препарата на интенсивность пролиферации и на фазовое распределение культивируемых клеток помогут выяснить механизм действия полиплатиллена, позволят построить рациональные схемы его применения и дадут возможность включить препарат в комплекс ле-
и поддерживали клетки в 150 мл сбалансированных солевых растворах Хенкса, Игла или 199. В ростовую среду добавляли 10% телячьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина. Через 24 ч после посева, когда клетки находились в логарифмической стадии роста, среду роста заменяли поддерживающей средой. Часть клеточных культур оставляли для контроля, а остальные обрабатывали раствором полиплатиллена в дозах, изменяющихся в интервале от 0,001 до 1,0 мкг/мл в расчете на активную субстанцию. Длительность обработки составляла 24, 48 и 72 ч при определении про-лиферативной активности или 6-8 ч при оценке фагоспецифичности. Перед заменой среды роста и добавлением препарата платины с помощью визуального микроскопирования проверяли качество монослоя. Для прижизненного наблюдения клеток использовали инвертированный микроскоп МБИ-12 при фазово-контрастном освещении. Количество живых морфологически неизмененных и погибших клеток подсчитывали в камере Горяева, а также с помощью микроскопа Люмам Р-3 после окрашивания клеток акридиновым оранжевым [1]. Диссоциацию клеток монослоя осуществляли с применением среды Версена. Все эксперименты повторяли дважды с тремя или четырьмя образцами на одну дозу препарата или длительность инкубации. Конечным результатом считали усредненные значения. Достоверность сравниваемых средних зна-
Актуальт проблеми сучасно!" медицини
чений оценивали с помощью критерия Стьюден-та (Р < 0,05). О реакции клеток на препарат платины судили по их способности к размножению, морфологическим изменениям, а также по изменениям в распределении по фазам клеточного цикла. Интенсивность размножения характеризовали индексом пролиферации, который выражали в процентах от величины в контроле после расчета отношения количества клеток в момент наблюдения к количеству засеянных клеток.
Результаты исследований и их обсуждение
Из результатов, суммированных в табл. 1, видно, что с увеличением дозы полиплатиллена и времени его экспозиции пролиферативная активность клеток падает, но неравномерно и по-разному для разных линий.
Наиболее высокую чувствительность к препарату демонстрируют клетки СПЭВ и 1-41, которые гибнут через 48 ч после введения 1 мкг/мл
Таблица 1.
Индексы пролиферации клеток, обработанных разными дозами полиплатиллена в течение 24, 48 и 72 ч, выраженные в процентах по сравнению с контролем
препарата. При этом клетки СПЭВ более восприимчивы, так как они погибают и от дозы 0,1 мкг/мл при длительности воздействия 72 ч. Пролонгированная инкубация с высокими дозами полиплатиллена ингибирует также выживаемость клеток НЕР-2. Наименее чувствительны к действию препарата оказались клетки VERO. Они сохраняют свою пролиферативную активность на достаточно высоком уровне даже после 72 ч обработки дозой 1 мкг/мл. Различия в степени выраженности повреждающего действия на клетки эпителия СПЭВ и на опухолевые клетки L-41 или НЕР-2 по сравнению с клетками VERO указывают на дифференцированность антипролиферативного действия полиплатиллена. Эти данные согласуются с результатами биологических испытаний in vivo, которые показывают, что,обладая энтеротоксичностью, по-липлатиллен проявляет высокую противоопухолевую активность, но не поражает клетки почек.
До-
заммкг/м л
Индекс пролиферации клеток,% по с
равнению с контролем
СПЭВ
L-41
НЕР-2
VERO
24
48
72
24
48
72
24
48
72
24
48
72
Контр. 0,001 0,01 0,1 1,0
100 100 100 90 93 80 80 80 75 60 30 0 11 0 0
100 100 100 92 90 97 68 45 43 52 39 37 12 0 0
100 100 100 92 96 87 81 83 48 62 58 21 23 21 0
100 100 100 93 86 83 77 57 47 67 54 44 63 37 27
Как свидетельствует микроскопический контроль за живыми и погибшими клетками, уменьшение клеточной массы в культурах, обработанных полиплатилленом в дозах 1,0 и 0,1 мкг/мл, объясняется прямым общетоксическим действием препарата. Дозы 0,01 и 0,001 мкг/мл не вызывают гибели клеток. Однако они тормозят скорость клеточного размножения, что говорит о наличии у препарата специфического антипролиферативного действия.
Изучение методом проточной цитофлуори-метрии исследуемых клеточных культур, разделенных на фракции по фазам клеточного цикла, позволило установить, что антипролифератив-ная активность препарата платины обусловлена в первую очередь избирательностью действия на S фазу. Разделение клеток на фракции проводили с помощью ультрацентрифугирования клеточных культур в градиенте плотности сахарозы. Качественный и количественный состав каждой фракции характеризовали содержанием ДНК, которое определяли по результатам анализа ДНК-гистограмм, полученных после комбинированного окрашивания ядер на лазерном проточном цитофлуориметре "FACSTAR" фирмы Becton Diskinson USA no программе DNA Cell-Cycle Analysis Software Vcr C5/87 Sum of Broadened Rectangles Model [9]. Полученные результаты показывают, что после добавления препарата в культуру, содержащую клетки в Gl,
Б и в2+М фазах клеточного цикла, количество клеток в фазе увеличивается, тогда как в фазе в2+М уменьшается, а в фазе Б не обнаруживается вовсе (табл. 2). С увеличением дозы полиплатиллена количество клеток в в! фазе продолжает увеличиваться.
Следует отметить, что фагоспецифичность полиплатиллена не зависит от природы клеток и от среды их культивирования. Данные, приведенные в табл. 2, получены из анализа ДНК-гистограмм клеток, культивируемых в среде Хенкса. Такие же данные получены при замене среды Хенкса на среду Игла или 199.
Таблица 2.
Распределение клеток по фазам клеточного цикла при инкубации в течение 6 чс различными дозами полиплатиллена в среде Хенкса
Культура Клеток Доза, мкг/мл Содержание клеток в фазах циклам/о
G1 | S | G2+M
НЕР-2 Контроль 62,60 2,70 34,70
0,09 95,50 - 4,50
0,45 97,65 - 2,35
0,90 99,95 - 0,05
VERO Контроль 76,00 12,00 12,00
0,9 100 - -
СПЭВ Контроль 39,70 48.60 11,70
0,9 100 - -
RH Контроль 19.50 76,50 4,00
0,9 100 - -
Том 7, Выпуск 1-2
89
BiCHHK Украгнсъког медичног стоматологгчног акадежш
Накопление клеток в в! фазе указывает, что полиплатиллен блокирует клеточный цикл на уровне Б фазы, не препятствуя клеткам, находящимся в момент блокирования вв2+М фазе продолжать клеточный цикл до их вступления в в! фазу.
Следовательно, механизм действия препарата связан с его избирательным ингибированием биологических процессов, наиболее интенсивно протекающих в период Б-фазы клеточного цикла, т.е. на стадии синтеза ДНК.
Фагоспецифичность полиплатиллена является одним из важных звеньев в цепи событий, обусловливающих способность препарата ингиби-ровать рост злокачественных новообразований твердых тканей и потенцировать противоопухолевую активность других химиопрепаратов, поражающих клетки преимущественно в других фазах клеточного цикла: цисплатина — в фазе ¿1, блеомицина — в фазе ¿2+М, винкристина, винбластина, колхамина — в фазе М (8). Сопоставление цитологической активности с клиническими наблюдениями позволяет заключить, что результаты применения полиплатиллена подтверждают идею о синхронизации клеток как фактора повышения эффективности химиопрепаратов, эффективность которых впервые была продемонстрирована при лечении лимфом цик-лофосфаном после предварительного использования синхронизатора винкристина (9). Синхронизация клеток в ¿1 фазе отличает полиплатиллен от синхронизаторов блокирующих опухолевые клетки в фазе М и не способных поэтому эффективно действовать на рост солидных опухолей, большую часть которых составляют клетки вне стадии митоза.
Блокирование клеток в определенной фазе митотического цикла и обеспечение большей части клеток возможности синхронно вступать в следующие фазы клеточного размножения, помимо онкологии, представляет интерес для биотехнологии. Последняя особенно нуждается в методах получения клеток, синхронизированных в ¿1 фазе, так как именно в этой фазе достигается наиболее эффективный биосинтез вирусных частиц, антигенов, ферментов, алкалоидов,
инсектицидов и других биологически активных веществ.
Выводы
1. Установлено, что антипролиферативное действие противоопухолевого препарата полеп-латиллена дифференцировано по отношению к клеткам СПЭВ, L-41, HEP-2 и NERO, культивируемых in vitro.
2. Антипролиферативная активность полиплатиллена при малых дозах дозо-временных нагрузках обусловлена избирательностью действия на S-фазу клеточного цикла.
3. При повышении дозо-временных нагрузок действие полиплатилена на клетки теряет фа-зоспецифичный характер.
Литература
1. Культура животных клеток: Методы /Под ред. Р. Фрешни.
— М.: Мир, 1989. — 332 с.
2. Переводчикова Н.И. Химиотерапия немелкокпеточного рака лёгкого - состояние проблемы в 2000 г. //Практическая онкология. - 2000. - № 3. - С. 29-37.
3. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний /Под ред. Н.И. Переводчиковой. - М.: Практическая медицина, 2005. - 704 с.
4. Тюляндин С.А. Млоекулярная патология рака лёгкого: новые терапевтические возможности //Практическая онкология. - 2000. - № 3. - С. 43-48.
5. Филоненко Е.В. Оптимизация химиотерапии больных распространённым раком лёгкого //Диссертация ... канд. мед. наук - Уфа, 2004. - 217с.
6. Применение полиплатиллена для лечения злокачественных новообразований IV стадии /С.А. Шалимов, Л.В. Кейсевич, И.И. Волченскова и др. //Клиническая хирургия. - 1992. - № 1. - С. 40-41.
7. Противовирусное действие производного платины с де-зоксирибонуклеиновой кислотой у больных со злокачественной опухолью печени /С.А. Шалимов, Л.В. Кейсевич, Е.Б. Медведский и др. //Клиническая хирургия. - 1994. -№ 8. - С. 36-38.
8. Meyn R. E., Meistrich M.L., White R.A. Cycle-Dependent Anticancer Drug Cytotoxicity in Mammalian Cells Synchronized by Centrifugal Elutriation //J. National Cancer Institute.
— 1980. — Vol. 64, № 5. — P. 1215-1219.
9. Plow Cytometric Analysis of Human Uterine Sarcomas and Cell Lines /K.J. Nelson, J.S. Haskili, S. Sloan et al. //Cane. Res. — 1987. — Vol. 47. — P. 2814-2820.
10. Derivatives of platinum (P) with polysmon of deoxyribo-nuclcic acid. Method for obtaining them and pharmaceutical antitumor preparation based on them /I.I. Volchemkova, N.N. Maidanevich, L.I. Budarin et al. //European Patent Bulletin.
— 1990. — № 26. — P. 27.
Реферат
ФАЗОСПЕЦИФ1ЧНАД1Я ПОЛ1ПЛАТИЛЕНУ
Шал1мов C.O., Волченськова I.I., Яценко Л.Д., Майданевич Н.М., Корчева Л.М., Нежина М.В., Майданевич H.I., Ленок О.В.
Ключов1 слова: культури кп1тин, антипрол1феративна активнють, цитотоксичнють, пол1платиллен, фагоспециф1чнють.
Вивчено вплив дозо-часових навантажень протипухлинного л1карського препарату пол1платиллену на прол1феративну актив -н1сть та розподгп по фазах кл1тинного циклу культивованих in vitro кл1тин. Показано, що антипрол1феративна активнють обумов-лена неспециф1чною цитотоксичнютю при пролонгуючш дм високих доз препарату, в той час як специф1чна антипрол1феративна активнють визвана його здатнютю блокувати кл1тини в S- фаз1 i синхрошзувати кл1тинн1 популяци в G 1 фаз1 кп1тинного циклу при малих дозах i тривалм дм.
