CC BY
42
Экспериментальная биология и медицина УДК 616-005.4:612.089.6
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНОМ - НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ОПТИМИЗАЦИИ ВЫЖИВАЕМОСТИ ИШЕМИЗИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ
© Колесник И.М., Покровский М.В., Лазаренко В.А.
Кафедра фармакологии, кафедра хирургических болезней ФПО Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: [email protected]
Проведено экспериментальное исследование влияния дистантного прекондиционировния и рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость изолированного кожного лоскута на ножке. Показано, что дистантное прекондицио-нирование может рассматриваться как доступный универсальный инструмент предупреждения ишемического повреждения тканей, а также обоснована возможность применения рекомбинантного эритропоэтина в субэритропоэтиче-ских дозах для фармакологического прекондиционирования.
Ключевые слова: АТФ-зависимые калиевые каналы, дистантное прекондиционирование, нитритэргическая система, рекомбинантный эритропоэтин, фармакологическое прекондиционирование.
PHARMACOLOGICAL PRECONDITIONING WITH ERYTHROPOIETIN - NEW POSSIBILITIES FOR OPTIMIZATION OF ISCHEMIC TISSUES SURVIVAL POTENTIAL Kolesnik I.M., Pokrovskiy M. V., Lasarenko V.A.
Pharmacology Department, Department of Surgical Diseases of FPE of the Kursk State Medical University, Kursk
The experimental research of remote preconditioning and recombinant erythropoietin influence on survival potential of isolated pedicle skin flap was carried out. It was shown that remote preconditioning can be considered as accessible universal tool for prevention of tissues ischemic damage and also the possibility of recombinant erythropoietin use in suberythropoietic doses for pharmacological preconditioning was substantiated.
Keywords: ATP-dependent potassium channels, remote preconditioning, nitritergic system, recombinant erythropoietin, pharmacological preconditioning.
Профилактика и коррекция последствий локальной ишемии, развивающейся при различных хирургических вмешательствах, является актуальной проблемой современной медицины. В связи с этим высок интерес к изучению ишемического прекондиционирования, суть которого состоит в том, что короткие подпороговые периоды ишемии активируют эндогенные защитные механизмы, снижающие степень повреждения клеток в результате последующего продленного ишемического эпизода. Феномен был открыт Murry и со-авт. в 1986 г. Ученые впервые продемонстрировали, что четыре коротких эпизода коронароок-клюзии, перемежающиеся пятиминутными периодами реперфузии перед длительной, сорокаминутной коронароокклюзией, уменьшали размер инфаркта миокарда почти в 2 раза [12].
Исследования последних лет показали, что одного эпизода преходящей ишемии достаточно, чтобы вызвать прекондиционирование. Защитные свойства проявляются уже через 5 минут реперфузии. Тогда наступает первая защитная фаза прекондиционирования. Продолжительность её -1-2 часа. Затем эффект исчезает и возобновляется в промежуток времени от 24 до 96 часов. Это вторая защитная фаза [2, 10, 13].
В 1993 г. было открыто дистантное ишемическое прекондиционирование, суть которого со-
стоит в том, что кратковременные эпизоды ишемии одного органа (почки, брыжейки, нижней конечности) повышают устойчивость других органов к тяжелым ишемическим повреждениям [2]. Открытие подтвердило предположение о том, что эффект прекондиционирования реализуется не локально, а представляет систему многоуровневого иерархического дублирования, включающую нейрогенный компонент, гуморальный и внутриклеточный. Последнее привело к необходимости поиска гуморального агента, выделяющегося в ответ на ишемию и способного при экзогенном введении инициировать процесс без ишемии. С клинической точки зрения преконди-ционирование фармакологическими средствами выглядит предпочтительнее, так как технологически проще и лишено потенциальной опасности ишемических эпизодов для измененных тканей. Еще больший интерес для клинического применения представляет возможность дозировать введение фармакологических средств, что делает управляемым временной интервал периода толерантности к ишемии.
Наиболее перспективным для изучения, с нашей точки зрения, является эритропоэтин. Это гликопротеиновый гормон, главным фактором, регулирующим его продукцию, является гипоксия [15, 17]. Период полувыведения эритропоэ-
тина значительно выше, чем у других гуморальных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, временной интервал периода толерантности к ишемии, инициируемый им, должен быть существенно шире. Кроме того, открытие рецепторов эритропоэтина на мезангиальных клетках и в миокарде, фибро-бластах мышечной ткани и нейронов позволило изучить неэритропоэтические функции гормона
[3, 11, 15].
В связи с вышеизложенным цель нашего исследования: установить влияние дистантного
прекондиционировния на выживаемость изолированного кожного лоскута на ножке и возможность инициации процесса прекондиционировния рекомбинантным эритропоэтином.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводили на 70 белых крысах линии Wistar массой 250-300 г.
Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим. В ходе эксперимента животные содержались в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты, температура воздуха составляла 22-240С, освещение - 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, все крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду.
Операции и другие манипуляции на крысах проводились в условиях общего обезболивания внутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг веса. Выведение животных из эксперимента осуществляли в соответствии с «Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», принятой Советом Европы (Strasbourg, Франция, 1986), и Директивой Совета 86/609/ЕЕС от 24.11.1986 «По согласованию законов, правил и административных распоряжений стран-участниц в отношении защиты животных, используемых в экспериментальных и научных целях» передозировкой хлоралгидрата, вводимого внутрибрюшинно.
Животных распределяли по группам путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, условиям содержания и питания, а также по проводимым операциям и манипуляциям.
Всем животным моделирование кожного лоскута на ножке проводилось на вторые сутки эксперимента. После наркотизации животное фиксировали в положении на спине. Шерсть на брюшке тщательно выстригали, кожу обрабатывали 70% раствором этилового спирта. Отступя 1 см от ме-
чевидного отростка по белой линии живота, предварительно наметив по трафарету размер, выкраивали кожный лоскут, 1 см - основание, 4 см - длина, (сохранив питающий сосуд) изолировали в полиэтиленовый пакет, края кожи ушивали непрерывным швом [7]. Оценку степени выживаемости кожного лоскута на ножке, проводили на пятые сутки после моделирования (6-е сутки эксперимента) путем планиметрии по Автандилову, измеряя площадь выжившей ткани [1].
Блокаду АТФ-зависимых калиевых каналов проводили внутрибрюшинным введением гли-бекламида (Glib., Sigma) 5 мг/кг за 30 мин до проведения дистантного прекондиционировния или введения рекомбинантного эритропоэтина [6].
Дефицит оксида азота моделировали ежедневным внутрибрюшинным введением с первых суток эксперимента блокатора эндотелиальной NO синтазы (NOS) ^нитро^-аргинин метилового эфира (L-NAME, Sigma) в дозе 25 мг/кг/сут [5].
Дистантное ишемическое прекондициониро-вание осуществляли 10-минутным пережатием бедренной артерии с последующей 30 минутной реперфузией непосредственно перед моделированием патологии, на 3-и и 5-е сутки. Пережатие бедренной артерии осуществляли наложением жгута на верхнюю треть бедра. Контролем правильности наложения жгута служило отсутствие пульса на артериях голени (Oxman T., 1997 г.).
Рекомбнантный эритропоэтин («Эпокрин» эпоэтин альфа; ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых препаратов» Федерального медикобиологического агентства г. Санкт-Петербург, РОССИЯ.) вводили подкожно в дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки эксперимента (Херманн Б.Ф., Херманн Х., 2004). Доказано, что при данном режиме введения препарат не обладает гемостимулирующим эффектом.
Экспериментальные животные были разделены на семь групп, в каждую включили по 10 животных, которым моделировали изолированный кожный лоскут на ножке. Первая группа - контрольная. Во второй группе проводили коррекцию дистантным прекондиционированием. В третьей группе - рекомбинантным эритропоэтином. Животным четвертой группы проводилось комбинированное лечение, включающее сочетание дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина. Животным 5 и 6 групп проводили коррекцию выживаемости изолированного кожного лоскута на ножке дистантным прекондиционированием и рекомбинантным эритропоэтином соответственно, на фоне блокады АТФ-зависимых калиевых каналов. Животным седьмой группы проводили коррекцию вы-
живаемости изолированного кожного лоскута на ножке рекомбинантным эритропоэтином, на фоне блокады эндотелиальной NO-синтазы.
Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel версии 10.0 при помощи средств пакета анализа. «Описательная статистика» применялась для нахождения среднего значения (M) показателей и ошибки среднего (m) в каждой группе животных; данные в тексте и таблицах представлены в виде M±m. «Двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями» использовался для сравнения соответствующих показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними путем вычисления вероятности возможной ошибки (p). Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты планиметрии, проводившейся на пятые сутки после моделирования изолированного кожного лоскута на ножке у животных всех экспериментальных групп, представлены в таблице 1.
Известно, что при моделировании кожного лоскута, выживает часть его длины, превосходящая ширину основания не более чем в 2 раза. Мы заведомо моделировали лоскут, у которого длина в 4 раза превосходила ширину. На пятые сутки после моделирования изолированного кожного лоскута на ножке у животных контрольной группы площадь выжившей ткани составила 39,75% от изначальной площади моделируемого лоскута. Дистантное ишемическое прекондиционирование способствовало увеличению выживаемости изолированного кожного лоскута на ножке в 1,48 раза по сравнению с результатом в контрольной
группе. Введение рекомбинантного эритропоэти-на увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на ножке в 1,58 раза по сравнению с результатом в контрольной группе, оказывая влияние, аналогичное влиянию дистантного ишемического прекондиционирования. Сочетанное применение дистантного прекондициониров-ния и рекомбинантного эритропоэтина привело к увеличению выживаемости изолированного кожного лоскута на ножке в 1,66 раза. Показатели в данных опытных группах достоверно выше показателя в контрольной группе. Достоверных отличий между показателями опытных групп нами выявлено не было.
Молекулярные механизмы ишемического прекондиционировния (ИПК) принято рассматривать в соответствии с концепцией последовательного трехступенчатого развертывания протектив-ного эффекта. Механизм ишемического прекондиционирования запускается через триггеры. В качестве триггеров рассматривают вещества, высвобождаемые в процессе ишемии (оксид азота, ацетилхолин, брадикинин, опиоиды, аденозин, норадреналин, свободные радикалы, кальций). В процесс, через вторичных биохимических "посредников" (мессенджеров), включаются сложные биохимические пути. Мессенджерами выступают внутриклеточные протеинкиназы, тирозин-киназы и митогенактивируемые протеинкиназы. Конечным эффекторным элементом, наиболее вероятно, являются АТФ-зависимые калиевые каналы. Реализацию их защитного потенциала связывают с гиперполяризацией мембраны вследствие их открытия, активацией системы оксида азота, антиапоптическими механизмами [2, 13, 14, 16]. Каналы этого типа располагаются на плазматической мембране нервных клеток, на внутренней мембране митохондрий, широко представлены в эндотелии и гладкомышечных клетках сосудов. Все их изоформы способны принимать уча-
Таблица 1
Показатели выживаемости изолированного кожного лоскута на ножке на 5-е сутки
после моделирования (М±m) (п=10)
Группа Показатели выживаемости в см2 Показатели выживаемости в %
Контрольная 1,59±0,028 39,75%
ДИП 2,36±0,095* 59%
ЕРО 2,51±0,046* 62,75%
ДИП+ ЕРО 2,64±0,165* 66%
ДИП+ Glib 1,62±0,025 40,5%
ЕРО+ Glib 1,59±0,031 39,75%
L-NAME+ ЕРО 1,68±0,056 42%
Примечание: * - р < 0,05 при сравнении с контрольной группой; ДИП - дистантное прекондиционирование перед моделированием патологии, на третьи и пятые сутки; ЕРО - рекомбинантный эритропоэтин подкожно в дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки эксперимента; Glib - глибенкламид в дозе 5 мг/кг веса (растворитель диметилсульфоксид) за 30 минут до прекондиционирования и/или введения EPO; L-NAME-N-нитро-L-аргинин метилового эфира в дозе 25 мг/кг/сут внутрибрюшинно ежедневно.
стие в реализации защитного эффекта прекондиционирования. Однако в настоящее время большинство исследований направлено на изучение роли митохондриального и плазмаллельного пула АТФ зависимых калиевых каналов [17].
В нашем исследовании у животных пятой опытной группы, где коррекция дистантным ишемическим прекондиционированием осуществлялась на фоне блокады АТФ-зависимых калиевых каналов выживаемость кожного лоскута составила 1,62±0,025 см2 или 40,5%. Введение блокатора АТФ-зависимых калиевых каналов животным шестой опытной группы также привело к уменьшению выживаемости изолированного кожного лоскута до значений 1,59±0,031 см2 39,75%. Показатели в двух последних группах статистически не отличаются от показателей в контрольной группе.
Предварительная блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом полностью нивелировала цитопротекторное действие и дистантного ишемического прекондиционировния, и рекомбинантного эритропоэтина в модели изолированного кожного лоскута на ножке. Следовательно, можно говорить, что механизмы цито-протекторного эффекта и в том, и в другом случае реализуются посредством единого эффекторного механизма - АТФ-зависимых калиевых каналов.
Отдельно стоит остановиться на «гипотезе оксида азота» в реализации эффектов преконди-ционировния. Данная гипотеза была предложена R. Bolli в 1998 г. [8]. Экспериментально теория подтверждена работами К. Bolli и соавт. 1998— 2001 гг. [8]. Основные ее положения сводятся к следующему.
Оксид азота (NO) играет ключевую роль как в инициации, так и в опосредовании (медиации) феномена «второго защитного окна».
В роли триггера «второго защитного окна» оксид азота выступает в ходе первого кратковременного ишемического эпизода, когда он вызывает повышенное образование NО (предположительно, за счет эндотелиальной NO-синтазы) и супероксиданион-радикала. Взаимодействуя между собой, NÜ и О2 образуют пероксинит-ритрадикал. Пероксинитрит, в свою очередь, активирует е-изоформу протеинкиназы С. Стимуляция е-изоформы протеинкиназы С может также осуществляться и другими активными формами кислорода, являющимися дериватами O2.
Активация е-изоформы протеинкиназы С запускает комплексный сигнальный каскад, включающий активацию различных тирозинкиназ, ми-тогенактивируемых протеинкиназ и транскрипционного фактора NF-kB. Эти механизмы приводят к повышению транскрипции гена индуцируемой NO-синтазы и, как следствие, к повышению
активности этого фермента во временной интервал отсроченной фазы защиты ИПК (день 2, следуя оригинальной терминологии R. Bolli).
В развитии ИПК имеют значение две различные изоформы NO-синтаз (NOS): кальций-
зависимая эндотелиальная (eNOS), участвующая в ранних фазах ИПК, и кальций-независимая индуцируемая (iNOS), генерирующая оксид азота для защиты миокарда позднее. Выявлено, что на ранних стадиях формирования поздней фазы ИПК оксид азота реализует свое действие через цГМФ-независимые механизмы, а позднее (через 24 ч) - через цГМФ-зависимые механизмы [8].
Авторы «гипотезы оксида азота» считают, что именно повышенная активность iNOS, регистрируемая через 24-72 ч после инициируемого ишемического эпизода, является ответственной за реализацию кардиопротективного эффекта отсроченной фазы ИПК.
В нашем исследовании введение блокатора эндотелиальной NO-синтазы L-NAME нивелировало цитопротективный эффект рекомбинантного эритропоэтина. Площадь выжившей ткани составила 1,68±0,056 см2, что составляет 42% от изначальной площади моделируемого лоскута. Показатель статистически не отличается от показателя в контрольной группе. Данный факт позволяет предположить, что эндотелиальная NO-синтаза играет важную роль в реализации цитопротек-торного эффекта рекомбинантного эритропоэти-на, являясь по всей вероятности триггером второй фазы защиты.
Таким образом, в данном экспериментальном исследовании нами показано, что дистантное прекондиционирование может рассматриваться как доступный универсальный инструмент предупреждения ишемического повреждения тканей, а также обоснована возможность применения рекомбинантного эритропоэтина в субэритропоэти-ческих дозах для фармакологического преконди-ционирования. Влияние рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость ишемизированных тканей аналогично влиянию дистантного прекондиционирования. Эффекторным звеном в механизме реализации цитопротекторного действия в зоне ишемии и в том и другом случае являются АТФ зависимые калиевые каналы. Оксид азота в механизме реализации прекондициониру-ющего эффекта рекомбинантного эритропоэтина играет ключевую роль в инициации и опосредовании феномена «второго защитного окна», причем его инициирующее действие связано с активацией эндотелиальной NO-синтазы, а опосредующее с активацией индуцибельной NO-синтазы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов Г.Г. Основы патологоанатомической практики. - М.: РМАПО, 1994. - 512 с.
2. Бокерия Л.А., Чигерин И.Н. Природа и клиническое значение «новых ишемических синдромов». - М.: НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2007. - 302 с.
3. Корокина Л.В., Колесник И.М., Покровский М.В. и др. Фармакологическая коррекция L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота рекомбинантным эритропоэтином // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 9. - С. 66-69.
4. Пашков Д.В., Покровский М.В., Колесник И.М. и др. Оценка неоангиогенного эффекта L-аргинина и его сочетания с плазмидами гена VEGF при экспериментальной ишемии конечности // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 5. -С. 102-106.
5. Покровский М.В., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Артюшкова Е.Б. Эндотелиопротекторные эффекты L-аргинина при моделировании дефицита окиси азота // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - Т. 71, № 2. - С. 29-31.
6. Самойленкова Н.С., Гаврилова С.А., Дубина А.И. и др. Роль АТФ-зависимых калиевых каналов в процессе гипоксического и ишемического преконди-ционирования у крыс с фокальной ишемией мозга. // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2007. - Т. 24, № 4. - С. 68-77.
7. Шолохов В.М. Новые данные по фармакологии и клиническому применению солей лития. - М., 1984. - С. 86-91.
8. Bolli R. Cardioprotective function of inducible nitric oxide synthase and role of nitric oxide in myocardial ischemia and preconditioning: an overview of a decade of research // J. Mol. Cell. Cardiol. - 2001. -N 33. - P. 1897-1918.
9. Chong Z.Z., Kang J.Q., Maiese K. Erythropoietin is a novel vascular protectant through activation of Akt l and mitochondrial modulation of cysteine proteases // Circ Res. - 2002. - Vol. 106. - P. 2973-2979.
10. Downey J.M., Davis A.M., Cohen M.V. Signaling pathways in ischemic preconditioning // Heart Fail Rev. - 2007. - N 12. - P. 181-188.
11. Mennini T., De Paola M., Bigini P. et al. Nonhemato-poietic Erythropoietin Derivatives Prevent Motoneuron Degeneration In Vitro and In Vivo // Mol Med. -2006. - Vol. 12, N 7-8. - P. 153-160.
12. Murry C.E., Jennings R.B., Reimer K.A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium // Circulation. - 1986. - N 14. -P. 1124-1136.
13. Ran R., Xu H., Lu A. et al. Hypoxia preconditioning in the brain // Develop Neurosci. -2005. - N 27. - P. 8792.
14. Stenzel-Poore M.P., Stevens S.L., King J.S., Simon R.P. Preconditioning reprograms the response to ischemic injury and primes the emergence of unique endogenous neuroprotective phenotypes: a speculative synthesis // Stroke. - 2007. - N 38. - P. 680-685.
15. Xu B., Dong G.H., Liu H. et al. Recombinant human erythropoietin pretreatment attenuates myocardial infarct size: a possible mechanism involves heat shock Protein 70 and attenuation of nuclear factor-kappaB. Ann Clin Lab Sci. - 2005. -Vol. 35, N 2. - P. 161168.
16. Zhang H., Bosch-Marce M., Shimoda L.A. et al. Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to hypoxia // J Biol Chem. -2008. - Vol. 283. - P. 10892-10903.
17. Zhu Y., Zhang Y., Ojwang B.A. et al. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning: role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1 // Investig Ophthalmol Visual Sci. - 2007. - Vol. 48. -P. 1735-1743.
