CC BY
63
УДК 615.1; 543.257.063
С. Ю. Гармонов, Н. С. Шитова, А. В. Яковлева,
Т. А. Киселева, В. И. Погорельцев, М. В. Макарова
ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ АКТИВНОСТИ МИКРОСОМАЛЬНЫХ ОКСИДАЗ ПЕЧЕНИ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
Разработан метод определения фенотипа окисления по фармакокинетике выведенного антипирина со слюной испытуемых. Проведена апробация разработанного метода на группе здоровых добровольцев, группе больных сахарным диабетом 2 типа и пациентов с хроническим вирусным гепатитом С.
В настоящее время активность микросомальных оксидаз (МО) определяется прямыми и косвенными методами. Прямые методы включают в себя биофармацевтический анализ биопсийных проб ткани печени, косвенные же методы предполагают определение фармакокинетических параметров выведения лекарственных веществ (ЛВ) из организма или оценку активности с помощью эндогенных маркеров биотрансформации [1,2]. При использовании прямых методов определения активности МО существуют технические трудности пробоподготовки, так как они включают в себя травматические процедуры отбора биоптата печени [1]. Аналитические определения осуществляются в основном хроматографическими методами с использованием методов разделения и концентрирования [1,3].
Прямые методы определения активности МО могут проводиться с такими биологическими образцами, как кровь, в частности, с лимфоцитами и моноцитами крови, а также кожей и волосяными фолликулами [1]. Массовые клинические исследования по определению активности МО направлены на выяснение фенотипических особенностей метаболизма ксенобиотиков конкретным человеком, поэтому весьма актуальным становится использование неинвазивных подходов биофармацевтического анализа. Они основаны на введении в организм обследуемого тест-препаратов и изучения параметров кинетики его выведения в биожидкостях, таких как моча, слюна, смывы с поверхности кожи и т.д. [1,4,5].
Для фенотипирования окислительного метаболизма широко используются соединения, подвергающиеся гидроксилированию, окислению по сере и азоту, деалкилированию [6,7].
Распространенным косвенным методом определения активности МО является определение такого фармакокинетического параметра, как величина периода полувыведения ЛВ на основе определения их концентрации в крови [8,9]. Для определения скорости биотрансформации тест-маркеров часто применяется определение отношения количества введенного ЛВ к количеству экскретируемого за определенное время метаболита или чистого вещества. Для фенотипирования процессов окисления широкое практическое применение приобрел антипириновый тест [4]. Диапазон колебаний периода полувыведения антипирина у взрослого здорового человека колеблется от 5 до 22 часов [6].
Целью данной работы является разработка методов фенотипирования активности ферментов системы цитохрома Р450 путем оценки фармакокинетических параметров экскреции антипирина со слюной пациентов и применение разработанных методов на группе здоровых добровольцев, а также в группе больных сахарным диабетом 2 типа и хроническим вирусным гепатитом С.
Результаты и их обсуждение
Для идентификации антипирина (феназона или 2-фенил-2,3-диметилпиразолона-5) Государственная фармакопея РФ рекомендует реакцию его взаимодействия с нитритом натрия в сильнокислой среде [10]. Продуктом этого взаимодействия является окрашенный в изумрудно-зеленый цвет нитрозоантипирин:
<т-
'СИ,
м^_СНэ N 3
I
С6Н5
NaNO2
н2эо4
0 = М
^СН3
^СН,
С6Н5
Антипирин
4-Нитрозоантипирин
В течение долгого времени активность окислительных ферментов определяли по периоду полувыведения антипирина, который оценивался по исчезновению этого соединения из крови [4,11]. Однако забор крови представляет собой весьма травматичную и технически трудную процедуру в связи с необходимостью создания условий для забора и хранения крови.
В связи с этим впоследствии были разработаны неинвазивные методы определения фенотипа окисления по периоду полувыведения антипирина в слюне [12,13].
Нами была оценена возможность определения антипирина и разработан новый метод оценки активности окислительных ферментов. Было изучено, что максимум поглощения 4-нитрозоантипирина наблюдается при длине волны 350 нм (рис. 1).
Рис. 1 - Спектр поглощения нитрозоантипирина (рН=1,72 ): 1 - через 20 минут; 2 -через 1 ч после проведения реакции нитрозирования
Оптимальную концентрацию нитрита натрия при проведении реакции нитрозиро-вания определяли экспериментально. Для этого поддерживали постоянную концентрацию антипирина (10-4 моль/л) и условия проведения дериватизации, а ее изменяемым параметром являлась концентрация нитрита натрия. При содержании нитрита натрия 0,1 мл после
20 минут термостатирования и при 0,07 мл при часовом термостатировании (рис. 2) происходило количественное завершение аналитической реакции. Следовательно, можно сделать заключение, что при определении антипирина оптимальной концентрацией нитрита натрия при данных условиях является его десятикратный избыток при двадцатиминутном термостатировании и семидесятикратный избыток при часовом термостатировании. Использование двадцатиминутного термостатирования является более оптимальным и удобным, как вследствие экономии времени, так и вследствие исключения погрешности при заборе слишком маленьких объемов реагента.
Рис. 2 - Зависимость оптической плотности нитрозоантипирина от концентрации нитрита натрия (рН=1 ,72 ): 1 — через 20 минут, 2 — через 1 ч после проведения реакции нитрозирования
Возможность избирательного определения антипирина в слюне оценивали методом «введено - найдено» (табл. 1). В пробирку вводили разные концентрации антипирина, доводили слюной, отделенной от белков до 3 мл и после 5 мин термостатирования при 250С добавляли 0,05 мл 4 Н серной кислоты и 0,1 мл 0,2%-ного раствора нитрита натрия. После 20 мин инкубирования определяли количество антипирина спектрофотометрическим методом. Полученные данные показывают, что при выбранных условиях детектирования нитрозоантипирина компоненты слюны не оказывают мешающего влияния на спектрофотометрическое определение ЛВ.
Таблица 1 - Результаты спектрофотометрического определения антипирина в слюне (П=4, Р=0,95)
Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл эг
0,82 0,80±0,15 0,19
1,37 1,34±0,21 0,16
2,74 2,72±0,23 0,08
5,48 5,43±0,31 0,06
8,22 8,15±0,25 0,03
10,96 10,87±0,40 0,04
При этом количество выведенного антипирина определяют по градуировочному графику. Зависимости оптической плотности от концентрации линейны для области концентраций 5-10"5 - 10-3 М:
А = 0,0187Сх (мкг/мл)+0,0052 (Я2 = 0.9991). (1)
Предел обнаружения антипирина при указанных условиях спектрофотометрического определения снижается до 1,88 мкг/мл.
Таким образом, реакцию нитрозирования антипирина можно использовать для избирательного спектрофотометрического определения ЛВ в свободной от белковой матрицы слюне человека [14].
Хорошее всасывание и равномерное распределение антипирина приводят к тому, что после введения его концентрация в плазме, слюне, плевральной, перикардиальной и спинно-мозговой жидкости почти одинакова. Основой данного фармакокинетических исследований является определение уровня антипирина в слюне, освобожденной от белков.
Для группы ферментов системы цитохрома Р450 характерен полиморфизм метаболизма. Пациенты по активности МО были распределены на «быстрый», «средний» и «медленный» фенотип окисления.
Фенотип окисления (ФО) определяли по количеству выведенного со слюной антипирина суммарно за 12 ч. Критерии фенотипирования обследуемых на «быстрых», «средних» и «медленных» окислителей и степень достоверности разработанного метода представлены в табл. 2. Была оценена достоверность результатов для тримодального распределения фармакокинетических параметров выведения антипирина. По параметрическому критерию Стьюдента нулевая гипотеза опровергалась в обоих случаях на 0,1%-ном уровне значимости (Р<0,001, 151=2,66). Это значит, что с уверенностью можно говорить о достоверности разработанного метода и возможности с помощью него фенотипировать инактиваторов антипирина на три группы: быструю, среднюю и медленную.
Таблица 2 - Фармакокинетические параметры экскреции антипирина слюной (П=39)
Фенотип окисления Количество антиритина, выведенного со слюной за 12 ч, мкг Вероятность распределения
Быстрый 2,84±1,80 Р<0,001
Средний 10,69±0,83
Медленный 24,25±3,19 Р<0,001
Известно, что концентрация препаратов в слюне пропорциональна их концентрации в крови [14,15]. Исходя из этого положения, а также, учитывая характер распределения концентрации препарата в слюне, для обработки данных предложена фармакокинетическая модель, представленная на рис. 3.
В схему распределения антипирина (рис. 3) включена «задержка по времени» (так называемый параметр time-lag - т). Этот параметр позволяет учесть «запаздывание» концентрации препарата, связанное с эффектом первичного прохождения через печень [1,15].
Предполагаем, что все процессы всасывания препарата в системный кровоток, распределения и элиминации следуют кинетике первого порядка.
Область
введения
Рис. 3 - Фармакокинетическая модель распределения антипирина у пациентов после его перорального введения. Камера «0» - область введения антипирина (ЖКТ); камера «1» - тест-ткань; Dpo - доза (количество) препарата, введенное пациентам; кд - константа скорости накопления препарата в тест-ткани; kei - константа скорости элиминации препарата; т - задержка по времени (time-lag)
С учетом этих предположений математическое описание распределения антипирина в слюне (в тест-ткани) можно представить в аналитической форме следующим эмпирическим уравнением:
Ci(t) = A-[exp{- kei - (t-T)+} - exp{- kA - (t-T)+}, (2)
где A - макроконстанта, зависящая от кинетических параметров модели [16]:
A = Fa - Dpo - kA , (3)
Vi - (kA - kei) W
Dpo - доза (количество) препарата, введенное пациентам;
| 0,еслиt<т
(t-T)+ = \ (4);
(t-т), если t > т
kA - константа скорости накопления препарата в тест-ткани (аналог константы скорости всасывания); kei - константа скорости элиминации препарата; т - задержка времени (time-lag); Fa - степень всасывания препарата в системный кровоток (биодоступность); Vi - наблюдаемый объем распределения препарата.
Так как значение параметра биодоступности не определялось, то принимаем величину Fa равной 1. При этом мы можем оценить лишь наблюдаемый объем распределения препарата, но не его истинное значение:
Vi= Vi. (5)
Fa
Математическая модель (2) - (3) включает четыре неизвестных параметра (кд, ke, Vi и т). При поиске оценок параметров модели (2) - (3) фиксируем значение временной задержки т и с помощью нелинейного метода наименьших квадратов найдем оценки остальных трех параметров. Причем, будем определять параметры уравнения (2), а затем по найденным значениям кд, kei и А рассчитаем оценку наблюдаемого объема распределения препарата из формулы (3). Расчет проводится при разных фиксированных значениях параметра т.
При вычислении фармакокинетических параметров использованы методики расчета, приведенные в [14,17-20].
Оценка наблюдаемого объема распределения получена по следующей формуле (принято, что Fa =1):
Fa - Dno - kA
V = _а----Р0 ^ . (6)
1 A - (kA - kei) W
Значение максимума концентрации антипирина в слюне и время его достижения вычислены из условия:
dCi(t)/dt=0; (7)
inf kVk
TMAX = “Г 7~ + т. (8)
kA - kel
Cimax = Ci(Tmax). (9)
Период полуэлиминации препарата:
T1/2.ei = 0,693/ kel. (10)
Площадь под кривой «концентрация-время»:
“ D
AUC0-^ = fCi(t)dt = -^-. (11)
X V1 - kel
Наблюдаемый клиренс:
CL = Vi-kei. (12)
Среднее время пребывания:
MRTb = т +1/КА + 1/кв1. (13)
Среднее время накопления препарата:
МАТ = т +1/ка; (14)
Среднее время прохождения препарата:
МТТв = MRTb - MAT. (15)
Распределение добровольцев контрольной группы по активности цитохромов Р450 при определении фенотипа окисления антипирина показало наличие трех групп: быстрого (20%), среднего (44%) и медленного типа (36%), что наглядно показано на гистограмме (рис. 4).
Рис. 4 - Полиморфизм окисления у здоровых лиц (п = 39): 1 - быстрые 20 %,
2 - средние 44%, 3 - медленные 36%
Таким образом, полученные экспериментальные данные и рассчитанные по ним фармакокинетические параметры показывают высокую эффективность, экспрессность и практичность разработанного метода оценки активности ферментативной системы микро-сомального окисления. Кроме того, весьма перспективным является применение методов, имеющих более совершенные аналитические характеристики (экспрессность, точность, воспроизводимость, чувствительностьи возможность автоматизации анализа). В результа-
те таких биофармацевтических и клинических исследований можно с высокой вероятностью и экспрессностью диагностировать биохимические фенотипы человека. Таким образом, предложенный метод позволяет проводить оценку индивидуальных особенностей генетически детерминированных процессов биотрансформации ЛВ, рассчитать их фармакокинетические параметры и применять разработанный метод в клинических условиях.
В качестве клинической базы для апробирования разработанного метода использовалась группа больных сахарным диабетом (СД) 2 типа, который является проблемой здравоохранения вследствие высокой распространенности во многих странах мира. В связи с этим оценка индивидуальных особенностей генетически детерминированных процессов ацетилирования и окисления у больных СД 2 типа имеет важное клиническое значение, поскольку эти процессы во многом определяют патобиохимические процессы обмена веществ. Описано влияние сахароснижающих препаратов на систему метаболизма ксенобиотиков [21]. Эти биохимические процессы играют критическую роль в метаболизме жирных кислот, что может приводить к инсулинорезистентности и СД 2 типа [22].
Данные о содержании антипирина в слюне пациентов без патологии и больных СД
2 типа после его перорального введения в дозе 0,6 г представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Данные о содержании антипирина в слюне пациентов после его перорального введения в дозе 0,6 г.
Время после Концентрация антипирина в слюне, мкг/мл
принятия тест-препарата, ч Здоровые Больные СД 2 типа
Быстрые (п=8) Средние (п=17) Медленные (п=14) Средние (п=6) Медленные (п=21)
3 0,55±0,08 3,33±0,3 4,82+0.9 4,37+1,3 8,36+3,8
6 1,42±0,2 4,19+0,1 8,66+1,2 3,54+0,9 6,8+1,5
9 0,73±0,01 1,23±0,2 5,47+0,9 2,1+0,8 9,9+2,2
12 0,25±0,09 3,9±0,8 3,61+1,1 0,51+0,1 3,6+1,6
Результаты фармакокинетического расчета представлены в таблице 4. В таблице приведены величины суммы квадратов отклонений расчетных и измеренных откликов для каждого набора данных. Кумулятивное количество экскретируемого антипирина при быстром, среднем и медленном фенотипе окисления составляет 2,84±1,8; 10,69±0,83 и 24,25±3,19 мкг соответственно.
Как указывалось выше, распределение добровольцев контрольной группы по активности цитохромов Р450 при определении фенотипа окисления антипирина показало наличие трех групп: быстрого (20%), среднего (44%) и медленного типа (36%) (рис. 4). Однако в изучаемой группе наблюдалось распределение лишь на две статистически значимо различающиеся группы: 22% составили средний и 78% - медленный фенотип (рис. 5).
По данным биохимического исследования показатели печеночных проб у больных СД 2 типа не отличались у таковых у лиц контрольной группы. Результаты фенотипирова-ния окисления у больных СД 2 типа представлены в таблице 4. Следует отметить, что с увеличением длительности заболевания у пациентов наблюдается замедление элиминации тест-маркера процессов окисления - антипирина. У больных с медленным фенотипом окисления также выявлена гиперлипидемия и более выраженные изменения углеводного
обмена. Изменение активности МО у больных СД 2 типа сопоставимо с аналогичными изменениями паренхиматозных поражений печени при вирусных гепатитах и циррозах [23]. Это может свидетельствовать об изменениях в гепатоцитах у больных СД 2 типа. На основании полученных данных можно предположить, что и медленный фенотип окисления обусловлены ингибированием цитохромов Р450 в результате особенностей метаболического контроля при сахарном диабете 2 типа. Разработанные подходы по фенотипирова-нию окислительных процессов и ацетилирования можно использовать при оценке метаболической функции у больных СД 2 типа.
Рис. 5 - Полиморфизм окисления у больных при сахарном диабете 2 типа (п = 27): 1 - средние 22%; 2 - медленные 78%
Печень занимает центральное место в биотрансформации ксенобиотиков. При хронических вирусных гепатитах детоксицирующая функция печени нарушается, что необходимо учитывать при проведении комбинированной противовирусной терапии. Распределение пациентов с хроническим вирусным гепатитом С при фенотипировании окисления показало наличие групп только среднего (67 %) и медленного (33 %) типа в отличие от тримодального распределения у здоровых людей (быстрые 20%, средние 44% и медленные окислители 36%).
При хроническом вирусном гепатите С наблюдается нарушение детоксицирующей функции печени в виде снижения активности ферментов монооксигеназной системы, что проявляется изменением соотношения биохимических фенотипов в отличие от здоровых людей. Одной из причин таких изменений может являться уменьшение количества этих ферментов в результате нарушения белковосинтетической функции печени. Необходимо отметить, что степень этих изменений зависит от клинической формы заболевания, его длительности и активности процесса.
Поскольку при хронических заболеваниях печени полностью выпадает быстрый ФО, что скорее всего обусловлено уменьшением количества соответствующих субстратов, нарушается баланс между способностью медленных окислителей быстро ацетилировать вещества, а быстрых окислителей медленно их окислять. Известно, что накоплению в цитоплазме гепатоцитов липидов способствуют нарушения на путях поступления, расщепления, синтеза или секреции липидов. У здоровых же людей поступление жирных кислот, синтез холестерина, фосфолипидов и их выведение находятся в уравновешенном состоянии. Повышенный липолиз при заболеваниях печени влияет на функцию митохондрий, способствуя апоптозу гепатоцитов. При повышенном поступлении липидов происходит накопление жирных кислот в гепатоцитах. Окисление жирных кислот в адекватных количествах осуществляется в клетках (митохондриях), куда они проникают в форме сложных эфиров карнитина и превращаются в активную форму ацилкоэнзима А, который и подвергается окислению. В связи с этим свободные жирные кислоты, образующиеся при гидролизе триацилглицеролов, являются мощными ингибиторами фермента липогенеза (глюко-
зо-6-фосфатдегидрогеназы), а также синтеза и транспорта цитрата в митохондриях, то, скорее всего, быстрый ФО выпадает из-за торможения этих процессов метаболизма.
Таблица 4 - Фармакокинетические параметры антипирина по результатам измерения его концентрации в слюне при введении per os в дозе 0,6 г
Параметр, размерность Фармакокинетические параметры
Здоровые (п = 39) Больные СД 2 (п=27)
быстрые средние медленные средние медленные
Макроконстанта, зависящая от кинетических параметров модели, А, мкг/мл 7,53 6,45 16,07 26,56 16,41
Константа скорости элиминации препарата, ке1, ч-1 0,346 0,114 0,161 0,328 0,105
Константа скорости накопления препарата в крови, ка, ч-1 0,622 1,422 0,951 0,534 0,554
Объем распределения, V/, л 179,9 101,1 44,9 58,4 45,1
Задержка времени т, ч 2,7 2,3 2,5 1,5 1,1
Максимальная концентрации антипирина в слюне, Стах, мкг/мл 1,60 4,77 9,31 4,73 9,03
Время достижения максимума концентрации антипирина в слюне, Ттах, ч 4,72 4,18 4,75 3,72 4,76
Период полуэлиминации препарата, Т1/2, ч 2,00 6,11 4,32 2,12 6,62
Клиренс, СЦ мл/ч 62294 11468 7208 19129 4723
мл/мин 1038 191 120 319 79
Среднее время пребывания, МЯТв, ч 7,10 11,77 9,78 6,27 12,40
Среднее время накопления препарата, МА Т, ч 4,20 2,96 3,55 3,22 2,85
Среднее время прохождения препарата, МТТв, ч 2,90 8,81 6,23 3,05 9,55
Площадь под кривой «концентрация-время», АУС , мкг-час/мл 9,63 52,32 83,24 31,37 127,05
Жирные кислоты тормозят не только гликолиз, но и вхождение пирувата в цикл Кребса посредством торможения пируватдегидрогеназной реакции, соединяющей цитоплазмати-
ческий гликолиз с митохондриальными процессами окисления. При повышенном содержании жирных кислот включается микросомальное ю-окисление липидов системой цитохрома Р450 с образованием токсичных дикарбоновых кислот. Одновременно, при «перегрузке» пероксисом и микросом, повреждении митохондрий, в них также образуются и другие токсичные молекулы - супероксид, Н2О2. Все это в комплексе и приводит к кислотному стрессу.
Таким образом, на основании полученных данных можно предположить, что медленный ФО обусловлен ингибированием цитохромов Р450 в результате глубоких нарушений процессов метаболизма у больных хроническим гепатитом С и СД 2 типа. Проведенное изучение состояния систем окисления показало связь изменений этих систем с течением и прогнозом заболевания.
Экспериментальная часть
Спектрофотометрические измерения проведены на спектрофотометре СФ-26.
Для изучения активности МО были обследованы две группы лиц. Первая группа - группа контроля - состояла из 39 здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 25 лет, масса тела обследуемых составляла от 55 до 85 кг. Вторая группа состояла из 27 пациентов с сахарным диабетом 2 типа в возрасте от 47 до 78 лет. Длительность заболевания варьировала от 1 года до 24 лет. Третью группу составили пациенты с хроническим вирусным гепатитом С в возрасте от 20 до 42 лет в количестве 22 человек.
Построение градуировочного графика. На аналитических весах взвешивается навеска антипирина массой 0,018 г. далее она количественно переносится в мерную колбу вместимостью 100 мл путем растворения в дистиллированной воде и доводится этим растворителем до метки концентрация полученного исходного раствора составляет 188 мкг/мл гинк (С=10-3 моль/л).
Для построения градуировочного графика в пробирки помещаются аликвоты исходного раствора антипирина (С=10-3 моль/л) объемом 0,3; 1,2; 2,4; 3,0; 6,0; 12,0 мл и доводятся дистиллированной водой до 30 мл. Полученная серия растворов соответствует концентрациям антипирина 1,88; 7,52; 15,04; 18,80; 37,60; 75,20 мкг/мл. Пробирка помещается в термостат на 5 мин при температуре 25оС. Затем, не извлекая пробы из термостата, добавляются 0,5 мл 4 Н серной кислоты и 1,0 мл 0,2%-ного раствора нитрита натрия. Инкубация продолжается в течение 20 мин. Далее оптическая плотность измеряется на спектрофотометре при длине волны 350 нм и толщине кюветы 1 см. По полученным результатам строится градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации антипирина, выдержанной в мкг/мл.
Методика определения фенотипа окисления. Антипирин принимают однократно перорально в дозе 0,6 г утром натощак. Слюну собирают через каждые 3 часа в течение 12 часов. Для осаждения твердых частиц слюну центрифугируют в течение 10 минут. В пробирки вносят по 2 мл надосадочной жидкости, 2 мл дистиллированной воды, 2 мл цинкового реактива (100 г 7п8О4 растворяют в 1 л 1,2 %-ого раствора серной кислоты), 2 мл 0,75н гидроксида калия (по каплям). Встряхивают раствор в течение 30 с. Далее производят центрифугирование в течение 15 минут. По
3 мл чистого супернатанта каждого образца переносят в пробирки и помещают в термостат на 5 мин при температуре 25оС. Затем, не извлекая пробы из термостата добавляют 0,05 мл 4 Н серной кислоты и 0,1мл 0,2%-ного раствора нитрита натрия. Инкубацию продолжают в течение 20 мин. Далее оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 350нм. Количество выведенного антипирина определяют по градуировочному графику.
Выводы
Предложен неинвазивный метод определения активности микросомальных оксидаз с помощью оценки общего количества антипирина выведенного за 12 ч со слюной обследуемого.
Разработанный метод применен для оценки активности микросомальных оксидаз и фенотипирования пациентов по типу окисления. Обосновано использование разработанного метода биофармацевтического анализа для оптимизации фармакотерапии и в предиктивной медицине.
Установлены фармакокинетические параметры тест-препарата окисления - антипирина - для лиц без патологии, при сахарном диабете 2 типа и у больных хроническим вирусным гепатитом С.
Литература
1. Краковский М.Э., Аширметов А.Х. // Лаб. дело. 1990. №10. С. 21 - 26.
2. Weber J.L. // Curr. Opin. Biotech. 1990. № 1. P. 166 - 171.
3. Zhang Z., King B.M., Wong Y.N. // Analyt. Biochem. 2001. V. 298. № 1. P.40 - 49.
4. Аширметов А.Х., Краковский М.Э // Лаб. дело. 1990. №1. С. 16 - 20.
5. Симонов Е.А. Изотов Б.Н., Фесенко А.В. Наркотики. Методы анализа на коже, в ее придатках и выделениях. - М.: Анахарсис, 2000. 130 с.
6. ХолодовЛ.Е., ЯковлевВ.П. Клиническая фармакокинетика. М.: Медицина, 1885. 464 с.
7. Куценко С.А. Основы токсикологии. Санкт-Петербург: Фолиант, 2004. 720 с.
8. Peter R., Bocker R., Beaune P.H., Iwasaki M., Guengerich F.P., Yang C.S. // Chem. Res. Toxicol. 1990. V. 3. P. 566 - 573.
9. Tassaneeyakul W., Birkett D.J., McManus M.E., Tassaneeyakul W., Veronese M.E., Anderson T., Turkey R.H., Miners J.O. // Biochem. Pharmacol. 1994. V. 47. P. 1767 - 1776.
10. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия: Учеб. для фармац. институтов и фармац. факультетов мед. институтов. М.: Высшая школа, 1985. 768 с.
11. Abernethy D.R., Greenblatt D.I., Zumbo A.M. // J. Chromatogr. 1981. V. 223. P. 432.
12. Семенюк А.В., Колесникова Л.И., Куликов В.Ю., Неделькина С.В., Салганик Р.И. // Лаб. дело.
1982. № 10. С. 31 - 33.
13. Андреева Т.В., Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г., Горохов А.Г. // Хим.-фарм. журн. 2000. - № 1. С. 10 - 11.
14. Сергеев П. В., Шимановский И.Л., Гуревич К.Г. Теоретическая и практическая фармакокинетика: Методические разработки. - М.: РГМУ, 2003. - 114 с.
15. Каркищенко И.И., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Каркищенко В.И. Фармакокинетика. - Ростов-
на-Дону: Феникс, 2001. 284с.
16. Veng-Pedersen P., Gillespie W.// J. Pharm. Sci. 1985. V. 74. P. 791 - 792.
17. Мирошниченко И.И. Основы фармакокинетики. - М.: издательский дом ГЭОТАР-МЕД, 2002. 200 с.
18. Соловьев В.Н., Фирсов А.А., Филов В.А. Фармакокинетика: Руководство. М.: Медицина, 1980. 347 с.
19. Бард Й. Нелинейное оценивание параметров // Пер. с англ. под ред. В. Г. Горского, М.: Статистика, 1979. 368 с.
20. Herman R.A. , Herman R.A., Veng-Pedersen P., Hoffman J., Koehnke R., Frust D.E. // J. Pharm. Sci. 1989. V. 78 P. 165 - 171.
21. Stroev E.A., Belkina Z.V. // Farmakol. Toksikol. 1989. V. 52. № 2. Р. 74 - 77.
22. Zimmet P., Boyko E.J., Collier G.R., Courten M. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1999. V. 892. P. 25 - 44.
23. Цыркунов В.М., БушмаМ.И., Гарелик П.В. // Клин. мед. 1989. - № 2. Р. 87 - 89.
24. Ковалев И.Е., Румянцева Е.И. // Проблемы Эндокринологии. 2000. Т. 46. № 2. С. 16 - 22.
© С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. каф. инженерной экологии КГТУ; Н. С. Шитова - канд. хим. наук, ст. преп. ОПП ЦМД КГТУ ; А. В. Яковлева - асп. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ; Т. А. Киселева - асс. каф. госпитальной терапии с курсом эндокринологии КГМУ ; В. И. Погорельцев - канд. мед. наук, доцент, главный врач поликлиники КНЦ РАН; М. В. Макарова - канд. мед. наук, зам. глав. врача Центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Минздрава РТ.
