CC BY
119
УДК 615.43 + 582.912.3
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ОРТИЛИИ ОДНОБОКОЙ (ORTHILIA SECUNDA (L.) HOUSE)
© С.С. Ломбоева1, Д.Н. Оленников2 , Л.М. Танхаева2
1 Иркутская государственная сельскохозяйственная академия, пос. Молодежный, Иркутск, 664031 (Россия)
2Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия). E-mail: [email protected]
Проведен фармакогностический анализ надземной части ортилии однобокой (Ortilia secunda (L.) House., сем. Pyrolaceae). Определены основные показатели качества сырья. В ходе анализа химического состава выявлено наличие аминокислот, органических кислот, аскорбиновой кислоты, терпеновых и фенольных соединений, макро- и микроэлементов. С применением метода ВЭЖХ доказано, что в сырье, произрастающем в Бурятии, отсутствует арбутин. Установлено присутствие кверцетина, кемпферола, галловой и хлорогеновой кислот.
Ключевые слова: Ortilia secunda (L.) House., фармакогнозия, товароведческий анализ, ВЭЖХ, арбутин.
Сокращения: БАС - биологически активное соединение, БХ - хроматография на бумаге, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография, Д - детектор, ЦП - цено-популяция; Cit - лимонная кислота, Mal - яблочная кислота, Suc - янтарная кислота.
Введение
Семейство Pyrolaceae насчитывает до 60 видов, включенных в четыре рода: Pyrola L., Orthilia Rafin., Moneses Salisb., Chimaphila Pursh [1]. Имеются данные, указывающие на то, что до настоящего времени существуют разные взгляды на систематическое положение рода Orthilia (нередко виды этого рода помещают в род Pyrola). Согласно системе А.Л. Тахтаджяна [2], O. secunda относится к семейству Ericaceae A. L. de Jussieu (incl. Pyrolaceae Dumort.), подсемейству Pyroloideae, роду Orthilia Rafin; за основу системы семейства Ericaceae им была принята система, разработанная Стевенсом. В пользу включения Pyroloideae в Ericaceae могут свидетельствовать данные об общности для этих таксонов таких хемотаксономических признаков, как присутствие флавонола кемпферола, простых фенолов - гидрохинона и метилгидрохинона [3]. Несмотря на то, что единого мнения об объемах и систематике этих таксонов нет и необходимы дальнейшие исследования в этом направлении, несомненным является их филогенетическое родство.
Объем рода и его систематическое положение принимаются нами согласно С.К. Черепанову, который приводит три вида рода Orthilia Rafin.: о. карельская - O. kareliniana (A. Skvorts.) Holub, о. тупая - O. ob-tusata (Turcz.) Hara и о. однобокая - O. secunda (L.) House. Во флоре Сибири встречаются два близкородственных вида - O. obtusata и O. secunda [1].
O. secunda - циркумполярный бореальный вид, распространенный в умеренных и холодных областях Северного полушария. Основной ареал охватывает большую часть Европы (за исключением степных районов), Малую и Среднюю Азию, Западную и Восточную Сибирь, север Монголии, восточную часть Китая, затем наблюдается разрыв ареала до Нижнего Приамурья, далее он встречается в Приморском крае, на Сахалине и в Японии; имеются обособленные местообитания в центральной части Камчатки, в Индии [4].
Согласно литературным данным в O. secunda обнаружены иридоиды (монотропеин) [5], фенологликози-ды (арбутин, ренифолин) [3, 6-8] и органические кислоты [9].
* Автор, с которым следует вести переписку.
В отделе биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН проведено исследование фармакологических свойств сухого экстракта данного растения. Результаты, полученные при определении острой токсичности, позволили отнести данное средство к группе практически нетоксичных веществ. Сухой экстракт оказывает выраженное антиоксидантное, мембраностабилизирующее, противовоспалительное, спазмолитическое, жаропонижающее, анальгетическое, антимикробное, седативное, диуретическое, а также гонадотропное виды активности [10-14]. Широкий диапазон экологической приспособляемости, обширный ареал и многогранность фармакологического действия O. secunda свидетельствуют о перспективности его применения в медицинской практике и получения на его основе лекарственных средств.
Целью настоящей работы является определение внешних признаков сырья, анатомическое исследование надземной части O. secunda вегетативного и генеративного состояния с целью выявления диагностических признаков сырья, а также установление товароведческих показателей и предварительное изучение химического состава основных групп БАС.
Экспериментальные условия
Сырье O. secunda (надземная часть) собранно в 1999-2003 гг. в разных районах Республики Бурятия из пяти ценопопуляций (ЦП) (табл. 1, 2).
Таблица 1. Характеристика исследованных ЦП
ЦП Район и год сбора Обилие O. secunda*
ОБ-1 с. Горячинск, Прибайкальский р-он, 1999 г. сор1
ОБ-2 с. Уро, Баргузинский р-он, 2000 г. ер
ОБ-3 с. Петуховка, Иволгинский р-он, 2001 г. ер
ОБ-4 г. Улан-Удэ, Верхняя Березовка, 2002 г. сор1
ОБ-5 с. Горячинск, Прибайкальский р-он, 2003 г. ер
* Обилие вида определяли по шкале Друде [15].
Таблица 2. Запасы сырья O. secunda в исследованных ЦП*
ЦП Площадь ЦП, м2 Запас, кг Объем ежегодных заготовок, кг
биологический эксплуатационный
ОБ-1 1125 16,20 13,45 2,69
ОБ-2 980 13,00 10,76 2,15
ОБ-3 546 4,44 3,72 0,74
ОБ-4 1131 12,22 10,09 2,02
ОБ-5 736 6,20 5,11 1,02
* Оценка ресурсов сырья проводилась согласно общепринятой методике определения запасов лекарственных растений [16].
Товароведческий анализ проводился в 5 параллельных опытах для цельного сырья. Отбор проб и проведение анализа осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XI [17]. Масса средней пробы составляла 400 г.
Спектральные измерения проводили на спектрофотометре UV-Vis-mini (Shimadzu). В работе использовали бумагу хроматографическую FN-12 (аминокислоты, флавоноиды), FN-16 (органические кислоты), ВЭТСХ-пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Сорбполимер).
В качестве стандартных образцов веществ-свидетелей использовали лимонную, яблочную, янтарную, кофейную, хлорогеновую, феруловую, галловую кислоты, лютеолин, кверцетин, арбутин (Fluka), мангифе-рин, мирицетин, рутин, кемпферол, сиреневую, коричную кислоты (Acros Organics).
Качественный состав БАС устанавливали качественными реакциями [18] и хроматографическими методами: органические кислоты - БХ (этилацетат - муравьиная кислота 4 : 1, бутиловый спирт - муравьиная кислота 3 : 1, Д: 0,08% бромкрезоловый зеленый), аминокислоты - БХ (бутиловый спирт - уксусная кислота - вода 4 : 1 : 2, Д: 5% нингидрин), флавоноиды - БХ (бутиловый спирт - уксусная кислота - вода 4 : 1 : 2, 15% уксусная кислота, Д: 5% А1С13, УФ), фенолокислоты - ВЭТСХ (этилацетат - толуол - муравьиная кислота - вода 100 : 5 : 10 : 10, Д: КН3, 5% БеСЬ, УФ).
ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Милихром А-02 (Эконова), колонка (1 = 75 мм, 0 2 мм) упакована сорбентом Nucleosil 100-5 С18, режим элюирования - градиентный. Элюент А - 0,05 М КН2Р04 -ацетонитрил 95 : 5; элюент В - спирт метиловый. Градиент элюента В 15-70% за 23,3 мин, расход элюентов
0,15 мл/мин. Детекция - фотометрическая: флавоноиды - 280, 330, 350 нм, фенологликозиды - 202, 224, 270,
278 нм, фенолокислоты - 218, 236, 260, 274 нм. Температура колонки - 35 (арбутин), 40 (фенолокислоты) и 50 °С (флавоноиды). Образцы извлечений O. secunda и стандартных веществ растворялись в спирте метиловом; концентрация растворов - 5 мг/мл.
Количественный анализ осуществляли с использованием следующих методик: органические кислоты [19], аскорбиновая кислота [17], дубильные вещества [20], флавоноиды [21], простые фенолы [17].
Качественный состав и количественное содержание макро- и микроэлементов определяли с применением эмиссионного спектрального анализа на спектрографе ДФС-8 в образцах проб, высушенных до воздушно-сухого состояния и подвергнутых сухому озолению. О концентрировании элементов судили путем сравнения их количеств со средними величинами (кларками) для растений сходных зон произрастания [23].
Результаты и их обсуждение
Товароведческий анализ. Результаты товароведческого анализа приведены в таблице 3. Установлены следующие показатели качества для измельченного сырья: суммарное содержание флавоноидов в пересчете на рутин - не менее 2%; потеря в массе при высушивании - не более 10%; золы общей - не более 5%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлороводородной, не более 2%; органической примеси - не более 1%; минеральной примеси - не более 0,5%.
Таблица 3. Результаты товароведческого анализа надземной части O. secunda (измельченное сырье), %
ЦП Содержание флавоноидов в пересчете на рутин Потеря в массе при высушивании Зола общая Зола, нерастворимая в 10% HCl Органическая примесь Минеральная примесь
OS-1 2,б2 S,01 3,SS 1,41 0,33 0,15
OS-2 2,75 7,S4 3,4б 1,22 0,6s 0,25
OS-3 3,32 7,7S 2,51 0,S6 0,59 0,36
OS-4 2,5б S,00 4,04 1,72 0,54 0,27
OS-5 3,3S 7,91 2,99 0,70 0,75 0,32
Химический состав. В таблице 4 приведены данные исследования качественного состава и количественного содержания БАС в надземной части O. secunda. Установлено присутствие аминокислот, углеводов, органических кислот, аскорбиновой кислоты, терпеновых соединений, а также ряда групп фенольных соединений.
Таблица 4. Качественный состав и количественное содержание БАС в надземной части O. secunda
Класс БАВ Компоненты* Количественное содержание, % а.с.с.
Аминокислоты Asn, Ala, Ser, Met, Cis
Кислота аскорбиновая 0,051±0,002
Органические Свободные (Cit, Mal, Suc) 4,53±0,03
кислоты Связанные (Cit, Mal, Suc) 1,0б±0,01
Общее содержание 5,58±0,08
Фенольные Простые фенолы 6,88+0,33
соединения Флавоноиды (кверцетин, кемпферол) Фенолокислоты (галловая, хлорогеновая) 3,01±0,08
Дубильные вещества 12,б2±0,5б
Иридоиды, тритерпеновые соединения присутствуют
Антраценпроизводные, алкалоиды, сердечные гликозиды * _ не обнаружены
* шрифтом выделены доминирующие компоненты.
В результате фармакологического исследования установлено, что наибольшей активностью обладает этилацетатная фракция O. secunda, состоящая преимущественно из веществ фенольной природы.
Для семейства Pyrolaceae характерными представителями простых фенолов и их производных Дж Харборном определены гидрохинон и его гликозиды [24]. В научной литературе содержатся противоречивые данные о наличии арбутина в O. secunda. С применением ВЭЖХ было установлено, что во всех исследованных образцах сырья арбутин не содержится в концентрациях выше предела обнаружения метода, что позволяет судить об отсутствии данного фенологликозида в сырье (рис. 1). Близость хроматографиче-
ского поведения и спектральных данных арбутина и неидентифицированного вещества, имеющегося в О. secunda, говорит в пользу вероятного присутствия метиларбутина.
Хроматографический анализ (БХ) на наличие флавоноидов показал, что данный класс БАС представлен в растении в основном флавоноловыми гликозидами. После гидролиза в этилацетатной фракции О. secunda обнаружены и идентифицированы кверцетин и кемпферол., также выявлено наличие хлорогеновой и галловой кислот. Методом ВЭЖХ подтверждено присутствие кверцетина, кемпферола и галловой кислоты (рис. 2).
Известно, что лекарственные растения различного химического состава проявляют избирательную способность к накоплению одного или нескольких элементов, что, по-видимому, связано со специфическим направлением обмена у отдельных растений [25].
А
Б
Рис. 1. Хроматограмма (ВЭЖХ) этилацетатной фракции надземной части О. secunda без (А) и с добавкой стандартного образца арбутина (1) (Б)
А
Б
Рис. 2. Хроматограммы (ВЭЖХ) этилацетатной фракции надземной части О. secunda. 1 - кверцетин, 2 - кемпферол, 3 - галловая кислота
В частности, обнаружено, что отдельные виды растений с фенольным типом обмена накапливают определенные элементы, которые играют значительную роль в биосинтезе БАС. Результаты определения элементного состава надземной части О. secunda представлены в таблице 5.
Таблица 5. Элементный состав надземной части O. secunda
Элемент Содержание, мг/кг а.с.с. Элемент Содержание, мг/кг а.с.с. Элемент Содержание, мг/кг а.с.с.
Ag 0,04 Mg 3818 Sn 0,13
Al 254 Mn б3б,4 Sr 1,90
Ba 3,81 Mo 0,13 Ti 190,9
Be 0,13 Na 254,5 V 2,50
Ca 12730 Ni 1,91 Y 1,27
Co 1,02 P 1 909 Yb 0,13
Cr 1,27 Pb 1,27 Zn 12,7
Cu б,3б Sc 1,27 Zr 3,82
Fe 127 Si 7б0
Установлено, что O. secunda является умеренным накопителем Fe, Cu, Co, сверхконцентратором Mn и Cr, что вполне согласуется с данными о специфической роли этих элементов в образовании и накоплении фенольных соединений.
Выводы
На основании проведенных исследований надземной части O. secunda можно сделать следующие выводы. В результате товароведческого анализа установлены показатели качества сырья. В надземной части O. secunda с использованием качественного анализа и хроматографических исследований идентифицированы флавоноиды (кверцетин, кемпферол), фенолокислоты (галловая, хлорогеновая), простые фенолы, дубильные вещества, аскорбиновая кислота, органические кислоты (лимонная, яблочная, янтарная), аминокислоты, тритерпеновые соединения, иридоиды, макро- и микроэлементы. С применением метода ВЭЖХ доказано отсутствие арбутина в сырье, произрастающем в Бурятии.
Список литературы
1. Черепанов С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств. СПб., 1995. 992 с.
2. Тахтаджян А. Л. Система магнолиофитов. Л., 1987. 439 с.
3. Harborn J.B., Williams C.A. A chemotaxonomie survey of flavonoids and simple phenols in leaves of the Ericaceae // Bot. J. Linn. Soc. 1973. V. 66. Pp. 37-54.
4. Толмачев А.И. Основы учения об ареалах. Л., 1962. 152 c.
5. Hegnauer R. Chemotaxonomie der Pflazen. Stuttgart, 1973. 882 s.
6. Drahtschmidt K., Lechner L. The arbutin content of some native Pyrola species // Scientia Pharm. 1938. V. 9. Pp. 137138.
7. Proner M. Investigation of the melanogenesis by Pyrola secunda L. // Wiadomosci Farm. 1937. V. 64. Pp. 623-628.
8. Walewska E. Phenol glucosides in the Pyrolaceae family // Chem. Abstrs. 1972. V. 76. №158253.
9. Оленников Д.Н., Ломбоева С.С., Танхаева Л.М. Органические кислоты лекарственных растений. 2. Orthilia secunda (L.) House // Химия природных соединений. 2005. №5. С. 486-487.
10. Чукаев С.А., Ботоева Е.А., Бураева Л.Б., Ломбоева С.С. Антиоксидантные и мембраностабилизирующие свойства сухого экстракта ортилии однобокой // Человек и лекарство: матер. VIII Росс. нац. конгресса. М., 2001.
С. 636.
11. Николаев С.М., Ботоева Е.А., Бураева Л.Б., Ломбоева С.С. Влияние сухого экстракта ортилии однобокой на течение экспериментального эндометрита // Сибирский медицинский журнал. 2002. №5. С. 78-81.
12. Ботоева Е.А., Баханова Е.М. Антимикробная активность экстракта ортилии однобокой // Науки о человеке: матер. III конгресса молодых ученых и специалистов. Томск, 2002. С. 204-205.
13. Ботоева Е.А. Экспериментальная фармакотерапия повреждений матки и ее придатков сухим экстрактом ортилии однобокой : автореф. дис. ... канд. мед. наук. Улан-Удэ, 2003. 22 с.
14. Ботоева Е.А., Ломбоева С.С., Бураева Л.Б., Чукаев С.А. Химическое и фармакологическое исследование ортилии однобокой Orthilia secunda (L.) House // Сибирский медицинский журнал. 2003. №1. С. 69-71.
15. Раменский Л.Г. Проблемы и методы изучения растительного покрова // Избранные труды. Л., 1971. 334 с.
16. Методика определения запасов лекарственных растений. М., 1986. 50 с.
17. Государственная фармакопея СССР. XI издание. Вып. 2. М., 1990. 398 с.
18. Практикум по фармакогнозии. Харьков, 2004. 510 с.
19. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г., Маркарян А.А. Методика количественного определения суммарного содержания органических кислот в растительном сырье // Растительные ресурсы. 2004. Т. 40. С. 112-117.
20. Хворост О.П., Беликов В.В., Сербии А.Г., Комиссаренко Н.Ф. Сравнительная количественная оценка содержания дубильных веществ у Alnus gluticosa (Ь.) Оаейп // Растительные ресурсы. 1986. Т. 22. С. 258-262.
21. Ломбоева С.С., Танхаева Л.М., Оленников Д.Н. Методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части ортилии однобокой // Химия растительного сырья. 2008. №2. С. 65-68
22. Ловкова М.Я., Соколова С.М., Бузук Г.Н., Шелепова О.В., Пономарева С.М. Избирательное накопление элементов растениями, синтезирующими сапонины // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. С. 635-642.
23. Ловкова М.Я., Соколова С.М., Бузук Г.Н., Тютекин Ю.В. Избирательное накопление элементов растениями, синтезирующими фенольные соединения // Доклады АН. 1999. Т. 369. С. 141-144.
24. Харборн Дж., Симмондс Н.У. Распространение фенольных агликонов в природе // Биохимия фенольных соединений. М., 1968. С. 70-108.
25. Кабата-Пендиас А., Пендиас Х. Микроэлементы в почвах и растениях. М., 1989. 440 с.
Поступило редакцию 25 мая 2008 г.
После переработки 22 декабря 2008 г.
