CC BY
35Н.А. Кузьмичева ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАВЫ ГРУШАНОК
Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет
Проведен макроскопический, хроматографический и количественный химический анализ травы трех видов грушанок, произрастающих в Республике Беларусь: Pyrola rotundifolia, P media и P. minor. Выделены морфологические диагностические признаки, касающиеся в основном формы листовой пластинки и строения пестика. Предложена методика ТСХ-анализа, позволяющая проводить идентификацию видов грушанок по флавоноидному составу, в то время как состав фенолгликозидов в изученных видах практически идентичен. Количественное содержание флавонои-дов в траве грушанок превышает 2%, содержание проантоцианидинов находится в пределах 815%. Содержание арбутина в траве грушанки круглолистной и грушанки средней составляет 4,5% и более, что позволяет рекомендовать эти виды в качестве перспективного источника лекарственного растительного сырья, аналогичного листьям брусники.
Ключевые слова: Pyrola, тонкослойная хроматография, денситометрия, арбутин, флавоноиды, проантоцианидины.
ВВЕДЕНИЕ
В научной медицине в качестве уро-септического и мочегонного средства широко используются листья толокнянки обыкновенной и брусники обыкновенной. Основными носителями фармакотерапев-тического действия листьев толокнянки являются фенольные соединения: арбутин, флавоноиды, дубильные вещества. Потребность в листьях толокнянки и брусники удовлетворяется не более, чем на 50%, поскольку значительно истощены заросли в традиционных районах сбора [1].
В связи с этим возникла необходимость поиска новых растительных диуретиков, которые бы пополнили ресурсные возможности и устранили дефицит сырья в данной группе лекарственных средств. Перспективными в этом отношении являются ортилия однобокая, грушанка круглолистная и зимолюбка зонтичная - растения семейства грушанковых, листья которых содержат арбутин, флавоноиды, дубильные вещества.
В Республике Беларусь растения семейства грушанковых широко распространены, встречаются нередко в хвойных и смешанных лесах. Наиболее известна ортилия однобокая Orthilia secunda L. (House) или рамишия однобокая -Ramischia secunda (L.) Garcke, которая присутствует в аптечном ассортименте в виде БАДов к пище под названием боровая матка. Род Pyrola (грушанка) самый
многочисленным в этом семействе и представлен в белорусской флоре 4 видами: г. зеленоватая, г. круглолистная, г. малая и г. средняя [2].
Листья, цветки и стебель растения содержат дубильные вещества, иридои-ды (монотропеин), тритерпеноиды (та-раксерол, урсоловую кислоту), фенольные гликозиды (арбутин, метиларбутин, гидрохинон, гомоарбутин, изогомоарбу-тин, пиролазиды А и В, ренифолин, эри-колин), а также флавоноиды (кемпферол, дигидрокверцетин, катехины), галловую кислоту, витамины, микроэлементы (магний, цинк, медь, барий и др.), эфирные масла и смолы. В корнях обнаружены стероиды, гликозиды, хиноны (на-фтохинон, химафилин) и органические кислоты [3, 4].
В народной медицине используют листья и траву грушанки в качестве мочегонного, антисептического, противовоспалительного, кровоостанавливающего, желчегонного, вяжущего, болеутоляющего и ранозаживляющего средства. При некоторых формах диабета грушанка снижает содержание сахара в крови, улучшает аппетит и нормализует процессы пищеварения [4].
Экстракты грушанки, помимо основного своего действия, могут применяться при заболеваниях полости рта. Причем это связано не только с заживлением слизистой ротовой полости, но, что особенно интересно, с исключительно стойким
дезодорирующим эффектом, в результате чего настои грушанки стали употреблять как самостоятельный напиток для освежения дыхания. Экстракты грушанки обладают очень высокой и избирательной антибактериальной активностью в отношении гнилостных микроорганизмов, которые в основном и вызывают образование дурного запаха изо рта, значительно усиливают местное кровообращение в полости рта, оказывают вяжущее и анестезирующее действие на слизистую оболочку полости рта и таким образом способствуют заживлению слизистой и укреплению десен [5].
Экспериментально установлено, что отвары листьев грушанки круглолистной в дозе до 10 г/кг не обладают острой токсичностью. Проявляют выраженную антимикробную активность в отношении различных групп микроорганизмов, выделенных от пациентов с хроническими пиелонефритами: представителей семейства энтеробактерий, псевдомонад, стафилококков, грибов рода Кандида. Обладают отчетливым противовоспалительным действием на моделях экссудативного и про-лиферативного воспаления, а также существенным диуретическим и натриуретиче-ским действием. Отвар листьев грушанки проявляет отчетливую терапевтическую эффективность при экспериментальном гломерулонефрите [1].
Фармакологические эффекты гру-шанки сходны с классическими видами лекарственных растений, издавна применяемых для лечения урологических заболеваний (толокнянка, брусника), и вместе с тем грушанки обладают более выраженным противовоспалительным действием, что является очень желательным при лечении заболеваний мочевыделительных органов.
В Республике Беларусь грушанки не разрешены к медицинскому применению в установленном порядке, однако заслуживают обстоятельного изучения как перспективное средство лечения заболеваний мочевыводящих путей в качестве дополнения и частичной замены листьев брусники и толокнянки, которые нуждаются в охране из-за сокращения ресурсов.
Целью настоящего исследования является проведение фармакогностического анализа грушанок, произрастающих в Республике Беларусь.
Научные публикации МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы травы грушанки круглолистной (Pyrola rotundifolia L), г. средней (P media Sw.) и г. малой (P minor L.) собраны в фазу цветения - начала плодоношения в Брестской и Гродненской областях. Сушка воздушно-теневая. Макроскопический анализ проводили по методике ГФ РБ. Из показателей доброкачественности были определены потеря в массе при высушивании и содержание действующих веществ. Методики фитохимического анализа адаптировались к данному виду сырья на основе имеющихся в литературе [6 - 8].
Получение извлечения. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 70% этанола. Колбу с содержимым соединяли с обратным холодильником и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа, затем охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через вату в мерную колбу вместимостью 50,0 мл. Вату промывали небольшим количеством 70% этанола и доводили им же до метки (раствор А).
Около 0,1 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в стеклянный флакон вместимостью 10 мл, прибавляли 5 мл воды очищенной, закрывали пробками, помещали в специальное устройство для герметизации и нагревали на кипящей водяной бане в течение 40 минут. К горячему извлечению прибавляли 0,1 г основного ацетата свинца, перемешивали и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 7 минут. Центрифугат переносили в сухие флаконы (раствор Б).
Хроматографический анализ. Для хроматографического анализа использовали пластинки TLC Silicagel 60 F254 Merck и TLC Cellulose Мегск KGaA. В качестве стандартов использовали водный раствор арбутина-стандарта в концентрации 500 мкг/мл и этанольный раствор рутина-стандарта в концентрации 500 мкг/ мл. Условия хроматографирования были следующие:
1) по 3 мкл извлечений (растворы Б) и арбутина-стандарта 500 мкг/мл наносили на пластинки с силикагелем, помещали в камеру с системой растворителей этилаце-тат-метанол-вода (30:4:3), после прохождения фронтом растворителей 10 см пластинки высушивали, обрабатывали 0,5% раствором 2,6-дихлорхинон-4-хлоримида
в метаноле и выдерживали в парах аммиака в течение 2 минут;
2) по 4 мкл извлечений (растворы А) наносили на пластинки с силикагелем, хроматографировали в системе растворителей этилацетат - муравьиная кислота - вода (7:1:1); после высушивания просматривали пластинки в УФ-свете до и после обработки 2-аминоэтиловым эфиром ди-фенилборной кислоты.
Определение содержания фенолгли-козидов. Содержание суммы фенолглико-зидов в пересчете на арбутин определяли методом прямой спектрофотометрии растворов Б при длине волны 285 нм [6].
Содержание арбутина и суммы фе-нолгликозидов определяли также в растворах Б денситометрическим способом, разработанным для листьев брусники. Хроматограммы извлечений из трех видов грушанок, обработанные 0,5% раствором 2,6-дихлорхинон-4-хлоримида в метаноле и выдержанные в парах аммиака в течение 2 минут, сканировали (сканер EPSON Perfection 1270 в режиме: RGB, 24 бит, 400 dpi). Полученное цифровое изображение обрабатывали с помощью компьютерной программы Imagej ver.1.41 h обработки изображений. В качестве стандарта использовали арбутин-стандарт [7].
Определение содержания суммы фла-воноидов. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин определяли методом дифференциальной спектрофотометрии растворов А при длине волны 410 нм с использованием алюминия хлорида в качестве комплексообразователя [8]. В качестве стандарта использовали Рутин-стандарт Rotichrom Art.7176.1, оптическую плотность растворов определяли через 40 минут после приготовления растворов.
Определение содержания суммы про-антоцианидинов. Содержание суммы проантоцианидинов в пересчете на циа-нидин определяли методом дифференциальной спектрофотометрии растворов А с использованием нагревания в среде 5% кислоты хлористоводородной в бутаноле по методике определения проантоциани-динов в корневищах с корнями сабельника болотного [8].
Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре СФ-26. Данные подвергали статистической обработке с использованием программы Microsoft Office Excel 2007.
Научные публикации РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Трава грушанки малой представлена прикорневыми листьями и цветочными стрелками длиной от 10 до 18 см, цельными или частично измельченными, плотными. Стебли безлистные или с 1-2 чешуевидными листочками, тонко-ребристые, диаметром до 1 мм, не ветвистые. Листья на длинных черешках, скучены при основании стебля, продолговато-овальные с острой верхушкой, цельнокрайние, матовые, жесткие, длиной от 1,6 до 5,0 см и шириной от 1,2 до 3,0 см. Жилкование перисто-сетчатое, главная жилка слегка выступает с верхней и нижней стороны листа. Черешки длиной около 2 см, сверху желобоватые, голые, зеленые. Соцветие -разносторонняя кисть, количество цветков от 7 до 15. Венчик белый или розовый, шаровидный, почти замкнутый. Столбик прямой, не выдается из венчика. Кольцеобразное утолщение под рыльцем отсутствует. Плод - повислая коробочка, длиной до 5 мм, шириной до 7 мм. Запах слабый. Вкус слегка вяжущий.
Трава грушанки средней отличается формой листьев и строением цветка. Листья округлые или овальные, неясно-город-чатые, до 3 см длиной. Венчик полураскрытый, до 8 мм в диаметре, белый, к основанию розоватый. Чашелистики с отогнутыми верхушками, треугольные (длина долей немного больше ширины). Столбик выдается из венчика, слегка отклоненный книзу, наверху расширен в кольцо, которое шире сидящего над ним 5-лопастного рыльца.
Трава грушанки круглолистной состоит из стеблей с верхушечным кистеобразным соцветием и прикорневых листьев. Длина стеблей от 15 до 30 см, толщина до 3 мм. Листья на длинных черешках, округлые или овальные, кожистые, сверху блестящие, до 6 см в диаметре. Край неясно городчатый или листья цельнокрайние. Листья могут быть как текущего года, так и перезимовавшие. Соцветие - разносторонняя 8-15-цветковая кисть. Прицветники равны цветоножкам или длиннее их. Венчик белый, широко раскрытый, диаметром до 2 см. Столбик длиннее венчика, криво изогнут и резко отклонен вниз, на верхушке с кольцеобразным утолщением. Чашелистики продолговатые, почти ланцетные, с отогнутыми краями. Запах слабый. Вкус слегка вяжущий.
Таким образом, можно выделить диагностические признаки, позволяющие отличить изученные три вида грушанок (таблица 1).
Хроматографический анализ. При
хроматографии извлечений Б в системе эти-лацетат-метанол-вода (30:4:3) после обработки фенолгликозиды проявлялись в виде пятен синего цвета на розовом фоне. Все виды грушанок имеют в своем составе два одинаковых фенолгликозида, один из кото-
рых по хроматографическому поведению идентичен арбутину (Rf арбутина = 0,44), другой фенолгликозид имеет Rf = 0,57. Для большей наглядности полученные хромато-граммы сканировали и обрабатывали с помощью программы Image. Денситограммы представлены на рисунке 1.
Для сравнения, трава ортилии однобокой содержит дополнительный фенолгли-козид, проявляющийся в виде пятна синего цвета с Rf= 0,60 (рисунок 2).
Таблица 1 - Диагностические признаки травы трех видов грушанок
Диагно стиче ские признаки Грушанка малая Грушанка средняя Грушанка круглолистная
Форма листовой пластинки продолговато-овальные с острой верхушкой округлые или овальные округлые или овальные
Венчик шаровидный полураскрытый, диаметром до 8 мм широко раскрытый, диаметром до 2 см
Чашелистики треугольные широко-треугольные продолговатые, почти ланцетные
Столбик прямой, не выдается из венчика выдается из венчика, слегка отклоненный книзу длиннее венчика, криво изогнут и резко отклонен вниз
Кольцеобразное утолщение на столбике нет есть есть
Рисунок 1 - Денситограммы фенолгликозидов травы грушанок
Рисунок 2 - Денситограмма фенолгликозидов травы ортилии однобокой
При хроматографии извлечений А в системе этилацетат - муравьиная кислота - вода (7:1:1) в УФ-свете обнаруживаются коричневые пятна флавоноидов, которые после обработки 2-аминоэтиловым эфиром дифенил-борной кислоты становятся ярко-желтыми в видимом свете и темно-желтыми в УФ-свете. По составу флавоноидов наиболее близки г. малая и г. круглолистная. Обнаружены два основных флавоноида с Rf = 0,60 и Rf = 0,66, которые у Р. rotundifolia находятся прибли-
зительно в равных количествах, а у P. minor второй преобладает, а также два дополнительных вещества флавоноидной природы с Rf = 0,83 и с Rf = 0,89. У грушанки средней представлены только два флавоноида: с Rf = 0,60 и Rf = 0,83.
Для большей наглядности различий в составе флавоноидов трех видов грушанок полученные хроматограммы сканировали и обрабатывали с помощью программы Image. Денситограммы представлены на рисунке 3.
Рисунок 3 - Денситограммы суммы флавоноидов трех видов грушанок
Количественное содержание действующих веществ. Результаты количественного определения действующих веществ в траве грушанок представлены в таблице 2.
Наибольшее содержание арбутина и флавоноидов обнаружено в траве грушанки средней (4,9% и 2,5%, соответственно). Не-
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Трава грушанки малой, средней и круглолистной отличается в основном формой листовой пластинки и строением цветка. Хроматографический анализ извлечений из травы грушанок позволяет хорошо различать их между собой по флавоноидному составу, в то время как состав фенолгликозидов в изученных видах практически идентичен.
Содержание арбутина в траве грушан-ки средней и круглолистной составляет 4,5% и более, что позволяет рекомендовать эти виды в качестве перспективного источника лекарственного растительного сырья, аналогичного листьям брусники и толокнянки. Содержание флавоноидов в листьях изученных видов грушанок превышает 2%, содержание проантоцианиди-нов находится в пределах 8-15%.
Максимальное количество действующих веществ накапливается в траве грушанки средней, которую и следует рекомендовать для дальнейшего изучения.
SUMMARY
N.A. Kuzmichova PHARMACOGNOSTIC ANALYSIS
OF HERB OF PYROLA SPECIES A macroscopic, chromatographic and quantitative chemical analysis of herb of three Pyrola species that grow in Republic of Belarus (Pyrola rotundifolia, P. media и P minor) were carried out. A morphological diagnostic marks primarily concerning leaf shape and pistil structure were distinguished. The methods of TLC analysis that allow to conduct identifi-
сколько меньше их содержание в траве грушанки круглолистной (4,5% и 2,0%, соответственно). По содержанию проантоцианиди-нов соотношение изученных видов другое: максимальное количество накапливается в траве грушанки малой (15,4%), затем следует трава грушанки средней (12,4%) и трава грушанки круглолистной (8,3%).
cation of Pyrola species by flavonoid content was proposed, while phenolglycoside content of researched species is identical. Flavonoid content in Pyrola herb exceeds 2%, proantho-cyanidin content falls within 8-15%. Arbutin content in Pyrola rotundifolia and P media herb reach 4,5% and more, that allows to recommend these species as perspective source of herb raw materials similar to Vitis idaeae folia.
Keywords: Pyrola, thin layer chromatography, densitometry, arbutin, flavonoids, proanthocyanidins.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пензина, Т.Н. Фармакологическая активность некоторых растений семейства грушанковых: автореф. дис. ...канд. фарм. наук / Т.Н. Пензина. - Барнаул, 1999. - 24 с.
2. Определитель высших растений Беларуси / под ред. В.И. Парфенова. - Минск: Дизайн Про, 1999 г. - 471с.
3. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т. 2. Семейства Actinidiaceae - Malvaceae, Euphorbiaceae, Haloragaceae / Отв. ред. А.Л. Буданцев. - СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2009. - 513 с.
4. Мазепина, JI.C. Фитохимическое изучение листьев грушанки круглолистной / Л.С. Мазепина, М.С. Коротаева, Ю.А. Джурко // Актуальные проблемы фармации: Межрегиональный сб. науч. труд. Рязань, 2006. - С. 157 - 159.
5. Грушанка круглолистная - долгая свежесть дыхания // [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://manager.dreambiz.e-
Таблица 2 - Количественное содержание арбутина, суммы флавоноидов
и проантоцианидинов в траве трех видов грушанок
Виды грушанок Содержание,%
арбутина флавоноидов проантоцианидинов
P. minor 3,28±0,10 1,92±0,06 15,39±0,58
P. media 4,86±0,18 2,52±0,09 12,41±0,44
P. rotundifolia 4,48±0,16 1,96±0,04 8,34±0,31
gloryon.com/4567932117. - Дата доступа: 18.12.2013.
6. Фурса, Н.С. Содержание арбутина в траве вереска обыкновенного / Н.С.Фурса, С.В.Онегин // Фармация. - 2007. - №6. - С. 12-14.
7. Иванкова, М.Н. Количественное определение арбутина в листьях брусники видеоденситометрическим методом и методом ВЭЖХ / М.Н. Иванкова // Достижения фундаментальной медицины и фармации. Материалы 67-ой научной сессии сотрудников университета. 2-3 февраля 2012 г. - Витебск: ВГМУ, 2012. - С. 276.
8. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Том 2. Контроль качества
вспомогательных веществ и лекарственного растительного сырья / УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении»; под общ.ред. А.А. Шерякова. - Молодеч-но: Типография «Победа», 2008. - 472 с.
Адрес для корреспонденции:
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27, УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра фармакогнозии c курсом ФПК и ПК, тел. раб.: 8(0212) 37-09-29, Кузьмичева Н.А.
Поступила 23.01.2014 г.
