CC BY
116
УДК 630.232.328.9
Зонтиков Дмитрий Николаевич
кандидат сельскохозяйственных наук Костромской государственный университет им. Н.А. Некрасова
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА МОРФОГЕНЕЗ ТРИПЛОИДНОЙ ОСИНЫ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
В статье рассматриваются проблемы культивирования триплоидной осины в культуре in vitro. Показано действие стерилизующих агентов на донорные экспланты, влияние генотипа и вида питательной среды на морфогенез. Ключевые слова: триплоидная осина, геммогенез, ризогенез, питательная среда.
Использование осины для плантационного выращивания ограничивается частым её поражением грибом Phellinus tremulae Bond. et Boris, который вызывает разрушение древесины. Решение данной проблемы возможно при выращивании осины с триплоидным набором хромосом (2n=38, 3n=57). Проблема при размножении триплоидной осины - в невозможности получения от неё семян. Поэтому возможно только вегетативное размножение, что обеспечит сохранение хозяйственно ценных свойств. Вегетативное воспроизведение лучших генотипов даёт возможность значительно повысить интенсивность лесовосстановления.
Осина относится к видам, которые успешно размножаются вегетативным способом. Однако для повышения экономической эффективности и получения высококачественного растительного материала необходимо использовать метод клонального микроразмножения. В России данную технологию при размножении осины используют в Санкт-Петербургском НИИ лесного хозяйства, Воронежском НИИ лесной генетики и селекции, Филиале института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. Используя метод клонального микроразмножения триплоидной осины, можно получать древесину, не поражённую грибом Phellinus tremulae Bond. et Boris, уже через 30 лет.
Технология клонального микроразмножения осины в культуре in vitro на сегодняшний день достаточно хорошо отработана, однако требует дополнительной отработки некоторых этапов, чтобы понизить себестоимость получаемого растительного материала.
Методы инициации геммогенеза на донорных эксплантах осины весьма разнообразны. В настоящее время используется несколько различных подходов, отличающихся разными типами используемых регуляторов роста и их концентрациями.
Эффективность каллусогенеза и геммогенеза, их скорость сильно зависят как от генотипических особенностей, так и от условий инициации.
Исследования проводились в 2010-2011 годах на базе лаборатории клонального микроразмножения филиала ФГУ ВНИИЛМ Центрально-европейской лесной опытной станции и лаборатории биотехно-
логии Костромского государственного университета им. Н.А. Некрасова.
В качестве донорных эксплантов использовали метамеры молодых побегов, изолированные от маточных растений триплоидной осины. Побеги изолировали из средней части кроны. В исследованиях использовали деревья клона N° 35 и диплоидные контрольные растения.
Исследования в условиях in vitro проводили в соответствии с методическими указаниями по культуре ткани и органов в селекции растений [2].
В лабораторных условиях нами изучалось:
1. Влияние на инфицированность донорных эксплантов осины различных стерилизующих агентов. В качестве стерилизующих агентов использовали водно-спиртовой раствор 75% (1 минута), водный раствор гипохлорита натрия в концентрации 2% и экспозициях 10, 15, 20 минут; пероксид водорода 6% в экспозициях 10, 15, 20 минут, после трехкратно промывали в стерильной дистиллированной воде 15 минут. Простерилизованные экспланты помещали на питательную среду и культивировали при температуре 18-20°С. 2. Подбор различных типов донорных эксплантов апикальных и латеральных метамер различного срока изоляции (апрель, май, июнь, июль, август). 3. Влияние различных видов питательных сред на морфогенез осины. Нами использовались питательные среды: McWP, MS1/2 и WPM.
Большое значение на морфогенез растения оказывает способ стерилизации донорного эксплан-та [6]. Наиболее распространенными стерилизующими агентами в настоящее время являются: гипохлориты кальция и натрия, пероксид водорода.
В ходе наших исследований было установлено, что из взятых для работы стерилизующих агентов наиболее эффективным оказался гипохлорит натрия при концентрации хлора в растворе 2,5% и пероксид водорода в концентрации 6,5% (табл. 1). При использовании этого стерилизующего агента нами было получено наибольшее число стерильных морфогенных эксплантов (рис. 1). Необходимо отметить, что на стерильность донорных эксплантов осины сильно влияет время года, в которое ведутся работы. У осины наиболее благоприятным периодом получения донорных эксплантов считается промежуток с середины мая до первой декады июля, в дру-
8
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 1, 2012
© Зонтиков Д.Н., 2012
Таблица1
Влияние на инфицированность донорных эксплантов осины различных стерилизующих агентов,
при экспозиции 10 минут
Стерили- зующий агент Концентрация стерил. агента, % Получено эксплантов
стерильных нежизнеспо собных стерильных жизнеспо собных инфицированных
бактериями грибами
шт. %±Sp шт. %±Sp шт %±Sp шт %±Sp
Гипохлорит натрия Конт- роль: 1,0 6 10,З±1,0 9 15,5±1,4 28 48,2±2,7 15 25,8±1,4
1,5 7 12,9±0,7 10 19,2±1,0 2З 42,5±1,0 12 22,2±0,9
2,0 12 2З,1±0,9 11 20,5±0,4 20 З8,4±0,9 10 19,2±0,9
2,5 15 29,4±1,3 12 23,2±0,7 15 29,4±1,8 10 19,6±0,7
З,0 2З 44,2±З,8 8 15,З±0,7 12 2З,0±1,0 9 17,З±1,0
Пероксид водорода 5,0 7 12±1,1 8 1 З,7±1,З 26 44,8±2,5 17 29,З±2,0
5,5 5 10,6±1,0 12 25,5±1,2 20 42,5±З,2 10 21,2±2,0
6,0 7 15,5±1,2 1З 2З,8±1,6 19 42,2±З,1 6 1З,З±0,9
6,5 8 19,5±0,9 13 31,7±2,2 15 З6,5±2,5 5 12,1±0,6
7,0 15 40,5±2,З 6 16,2±1,2 11 29,7±2,1 5 1 З,5±0,8
гое время стерильные экспланты получить проблематично.
Эффективность морфогенеза во многом зависит от типа донорного экспланта. В качестве источника эксплантов могут быть использованы ткани, взятые из многих органов растения. Известны работы, в которых регенерация была индуцирована в тканях незрелых зародышей [3], в культуре почек [4], из листовых дисков [5], из семядольных листьев и гипо-котильных сегментов стерильных проростков [1].
Для регенерации осины применялись экспланты двух типов - апекальный и латеральный метамер. В результате опыта наибольшей регенерационной активностью обладали апекальные метамеры. Наибольшей регенерационной активностью обладал клон N° 35. Апекальные метамеры обладали большей энергией роста, большей жизнеспособностью (табл. 2).
В практике биотехнологических исследований применяется достаточно большое количество раз-
нообразных вариантов питательных сред — MS, В5, NLN, WPM, McWP, Sh-2, MSm, A 22 m, Грессхофф и Доу, Уайта, Андерсена [6].
Проанализировав литературу, мы выделили три наиболее успешно применяемые для культивирования осины in vitro среды (McWP, MS1/2 и WPM), на которых было проведено изучение влияния состава питательной среды на индукцию геммогене-за. Среды были дополнены регуляторами роста БАП в концентрации 0,5 мг/л и аденин 20 мг/л, гиббере-ловая кислота 0,1 мг/л [7].
В результате нашего опыта среди отобранных питательных сред выделилась среда McWP, на которой было получено у клона З0-16,4% побегов, клона З5-12,6% побегов, клона 27-1З,0% побегов (табл. З).
Питательные среды McWP и WPM очень близки по своему компонентному составу, различаются
Рис. 1. Стерильные морфогенные донорные экспланты триплоидной осины клона №З5
Рис. 2. Триплоидная осина клон №З5
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 1, 2012
9
Таблица2
Морфогенез осины в зависимости от генотипа и типа экспланта
Клон № Тип экспланта Всего эксплантов, шт. Число растений-регенерантов
шт. %±Sp
З0 Апекальный метамер 175 7 4,0±0,4
Латеральный метамер 116 2 1,7±0,4
З5 Апекальный метамер 101 6 5,9±0,3
Латеральный метамер 107 2 1,9±0,7
27 Апекальный метамер 112 5 4,5±0,2
Латеральный метамер 178 7 З,9±0,4
Таблица3
Влияние различных видов питательных сред на морфогенез осины, число донорных эксплантов п = 500
Питательная среда № клона Число побегов Число каллусов
шт. %±Sp шт. %±Sp
McWP З0 82 16,4±3 14 2,8±0,7
З5 6З 12,6±1,6 12 2,4±0,7
27 65 13,0±1,6 1З 2,6±0,7
MS1/2 З0 11 2,2±0,7 2 4±0,З
З5 5 1,0±0,4 0 0
27 З 6±0,З 1 2±0,2
WPM З0 1 2±0,2 З 6±0,З
З5 9 1,8±0,6 4 9±0,4
27 7 1,4±0,5 2 4±0,З
только содержанием таких макроэлементов, как СаС12-2Н20, MgSO4•7H2O, Са(Ш3) 2'2Н20. Поэтому необходимо дальнейшее изучение влияния макроэлементов на морфогенез осины.
Таким образом, для стерилизации донорных эксплантов возможно применение в качестве стерилизующих агентов пероксида водорода в концентрации 6,5% и гипохлорита натрия в концентрации 2,5%. Использование апикальных метамер имеет более высокую морфогенную активность. В качестве питательной среды рекомендуем использовать McWP.
Библиографический список
1. Белоногова М.А. Генетическая трансформация льна-долгунца с использованием семядольных эксплантов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 2006. -24 с.
2. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей как метод изучения процессов роста и морфогенеза растений. - М.: Наука, 1964. - 256 с.
3. ГапоненкоА.К., ВоронинаИ.П., БелецкийЮ.Д. Эффективность трансформации незрелых зароды-
шей подсолнечника // Новые методы биотехнологии растений: материалы симпозиума. - Пущино, 1991. - 223 с. - С. 13-14.
4. Ивашута С.И., Мазин В.В., Солодкая Л.А. Генетическая трансформация культуры клевера лугового // Новые методы биотехнологии растений: материалы симпозиума. - Пущино, 1991. - 223 с. -С. 18-19.
5. КартельН.А., Курочкина С.Д., ЗабеньковаК.И. Трансгенные растения картофеля, полученные ко-культивацией листовых дисков с агробактериями // Новые методы биотехнологии растений: материалы симпозиума. - Пущино, 1991. - 223 с. - С. 20.
6. Поляков А.В. Получение регенерантов овощных культур и их размножение in vitro: метод. рекомендации. - М.: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, 2005. - 36 с.
7. Русин Н.С., Машкина О.С., Табацкая Т.А. Рекомендации по выращиванию быстрорастущих форм (клонов) тополя и осины для промышленного использования: метод. рекомендации. - Воронеж: ФГУП НИИЛГиС, 2010. - 38 с.
10
Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова ♦ № 1, 2012
