CC BY
54Факторный анализ показателей фотосинтеза, дыхания и продуктивности у гетерозисных гибридов и родительских линий PISUM SATIVUM L.
Вайшля О. Б. (planta@mail.tomsknet.ru )
Томский государственный университет
Проблема физиолого-биохимического обеспечения продукционного процесса растений достаточно давно привлекает внимание исследователей. В комплексной теории продукционного процесса изучалась количественная связь фотосинтетических показателей с продуктивностью [1-7]; зависимость скорости дыхания от урожая [8-11]; донорно-акцепторные отношения между фотосинтезирующими и потребляющими ассимиляты органами [12-14]; наследование изменчивости физиологических признаков [15-17]; соотношение физиологических параметров фотосинтеза и дыхания [18-22]. В ходе этих исследований выяснилось, что, во-первых, между интенсивностью фотосинтеза и продуктивностью корреляция часто отсутствует, и ни фотосинтез, ни дыхание не лимитируют урожай; во-вторых, очень трудно найти четкие количественные соотношения между интенсивностью этих процессов и продуктивностью потому, что сами они зависят от условий окружающей среды; в-третьих, стало очевидным, что потери ассимилятов в ходе дыхания - это необходимая "плата" клетки за синтез вторичных метаболитов; в-четвертых, показано, что ведущим фактором продукционного процесса является регуляция донорно-акцепторных отношений на уровне клетки, органа и целого растения. В настоящее время существуют различные модели высокопродуктивного растения, недостаточно согласующиеся между собой и не объясняющие всей сложности данного явления, поэтому разработка единой концепции формирования урожая актуальна как в практическом, так и в теоретическом плане.
Продукционный процесс как наиболее интегрированную функцию зеленого растения удобно изучать на реально существующих в природе высокопродуктивных моделях гетерозисных гибридов растений, дающих эффект гибридной силы по семенной продуктивности [23-25]. Поскольку наследование количественных характеристик продукционного процесса чрезвычайно сложно вследствие их полигенности, главным направлением в исследовании феномена гибридной силы считается разделение его на простые, генетически маркированные, конструкции. Наиболее перспективной считается модель моногибридного гетерозиса [26].
В данной работе использовали экспериментальную модель гибридов гороха, проявляющих высокий и стабильный эффект моногибридного гетерозиса по урожаю семян (до 150% от лучшего родителя), и полученных от скрещивания низкопродуктивных хлорофильных мутантов с нормальной по пигментации исходной формой. Именно на этих растительных объектах экспериментально была подтверждена гипотеза В. А. Струнникова [27] о роли компенсационного комплекса генов (ККГ) как генетической причины гетерозиса [28]. До сих пор остается невыясненной природа явления гетерозиса, определяющегося на генетическом уровне, а реализующегося через физиологию гибридных растений. Неизменным в гетерозисном эффекте остается лишь то обстоятельство, что у гибридов не возникают новые признаки, а происходит изменение тех или иных характеристик родительских линий.
Поскольку ККГ, сформированный у мутанта 2004 в ответ на хлорофилльную недостаточность, дает эффект гетерозиса по зерновой продуктивности при внесении в любую генетическую конструкцию [28-29], выявление надежных физиологических маркеров ККГ для ранней диагностики гетерозисного преимущества открывает новые возможности селекционных технологий для получения высокопродуктивных форм. Как правило, анализ средних значений отдельных физиологических показателей фотосинтеза, дыхания, продуктивности не позволяет выявить детальную картину их функциональных взаимосвязей, поэтому в данном исследовании для установления биологических причин разной продуктивности изогенных линий гороха был применен факторный анализ.
Целью работы являлось сравнительное изучение и выявление систем связности фотосинтетических, дыхательных параметров и продуктивности у мутантов chlorotica и их гибридов от скрещивания с исходным генотипом.
Методика
Хлорофилльные мутанты (М) гороха Pisum sativum L., М-2004 и М-2014, (личный каталог К.К. Сидоровой) получены под действием этиленимина из зернового сорта Торсдаг (Т). У М-2004 В. А. Соколовым определена локализация данной мутации «chlorotica» ("chi-''хлорофилльная недостаточность) в первой группе сцепления между генами «af» (ген безлисточковости) и «i» (ген зелёной окраски семядолей), а также причина гетерозисного преимущества гибридов ТхМ-2004 и М-2004хТ - взаимодействие неаллельных генов по типу эпистаза [30]. Локализация мутации у М-2014 не установлена. Однако его исследование важно, поскольку эта изогенная линия также характеризуется типом мутации «chi», но является низкопродуктивной и не даёт эффекта гетерозиса при скрещивании с исходной формой.
Полевые опыты проводили в течение трех лет. Для анализа брали одновозрастные листья верхнего междоузлия, всегда в 9-10 часов утра в ювенильную фазу онтогенеза.
Мезоструктуру листьев изучали, мацерируя ткань в 2% уксусной кислоте на 1н HCl при 80оС; число клеток в камере Горяева, размеры - с помощью окуляр-микрометра на микроскопе (VEB "Carl Zeiss Jena", Германия). Объём клеток вычисляли по формуле объёма цилиндра, по 50 образцов в каждом варианте [31]. Количество хлоропластов в клетке определяли в мацерате и ткани, экспонированной 4 часа в растворе цитазы, ведя подсчёт не менее чем в 120 клетках.
Интенсивность поглощения СО2 измеряли с помощью инфракрасного анализатора "Infralit-4" (Junkalor, Германия), используя камеру-прищепку для листа (концентрация СО2 - 0,04%, интенсивность света 10-70 Клк, температура 22оС). Максимальный СО2 газообмен листьев на свету, скорость реакции Хилла в изолированных хлоропластах регистрировали при освещении 70 Клк. Скорость выделения О2 листьями измеряли амперометрическим способом на полярографе с помощью платинового электрода типа Кларка при освещённости 65 Клк.
Выделение субклеточных фракций проводили методом дифференциального центрифугирования при +4оС на центрифуге К-24 (Германия), промывая осадки несколько раз средой выделения без цистеина, с последующим осаждением. Среда выделения хлоропластов содержала 0,35 М сахарозу; 5 мМ аскорбат натрия; 50 мМ Трис-HCl буфер (рН 7,8); 1 мМ MgCl2; 5 мМ дитиотрейтол и 3 мМ цистеин. Для выделения митохондрий использовали среду, содержавшую 0,35 М сахарозу; 0,02 М HEPES-буфер (рН 8,0); 5 мМ ЭДТА; 5 мМ аскорбат натрия; 3 мМ цистеин; 5% БСА и 1 мМ MgCl2. Среда выделения ядер содержала 0,1 М сахарозу; 0,02 М трис-ацетатный буфер (рН 7,6); 2 мМ Са02; 4% поливинилпирролидон; 4 мМ n-октиловый спирт. Цитоплазматическую фракцию получали после осаждения митохондрий. Чистоту выделенных фракций контролировали по соотношению хлорофилл/белок и цитологическим методом в фазово-контрастном микроскопе МББАУ-42 с использованием камеры Горяева. Для этого митохондрии окрашивали 1% янусом зелёным, ядра-0,04% метиловым зелёным в 6% уксусной кислоте с 0,002 М СаП2.
Содержание пигментов определяли спектрофотометрически в 100%-ном ацетоне [32]. Содержание сахаров измеряли микрометодом по реакции восстановления феррицианида калия [33], крахмала - сульфосалициловым методом [33], аминокислот - на автоматическом анализаторе "ААА-881" (Чехия), малата, лактата и пирувата -энзиматическим методом [34].
Чистую продуктивность фотосинтеза (ЧПФ) рассчитывали по формуле: ЧПФ=2(В1-В2)/[Т(81+82)], где S - площадь листьев, В - сухая масса листьев в моменты времени 1 и 2, Т - количество дней. Индекс мобилизации определяли как отношение массы бобов к массе надземной части [35].
Активность ферментов определяли по изменению оптической плотности реакционной среды при 340 нм, используя спектрофотометры "Specord UV-VIS" (VEB Carl Zeiss Jena, Германия) и СФ-46 (ЛОМО, Россия). Условия активации, состав реакционной среды описаны ранее: для РБФК/О, КФ 4.1.1.39 - в [36]; для ГАФДГ, КФ 1.2.1.13 - в [37]; для ФЕП-карбоксилазы, КФ 4.1.1.31 - в [38]; для НАДФ-МДГ, КФ 1.1.1.82 - в [37]; для НАДФ-МЭ, КФ 1.1.1.40 - в [37]; для НАДФ-ИДГ, КФ 1.1.1.42 - в [39]; для НАД-ИДГ, КФ 1.1.1.41 - в [40]; для НАД-МДГ, КФ 1.1.1.37 - в [37]; для НАД-МЭ, КФ 1.1.1.39 - в [41]; для пируваткиназы, КФ 2.7.1.40 - в [36]; для ГФДГ, КФ 1.1.1.49 -в [21]. Все реакции проводили при температуре 22о С.
В работе использовали реактивы фирм "Reanal" (Венгрия), "Serva" (Германия), "Calbiochem" (США) и минеральные соли марки "х.ч." (Россия). В таблицах 1-2 приведены средние арифметические из трех независимых экспериментов, каждый из которых проведен в 3-4-кратной биологической повторности (определение на группе из 20 растений) и их стандартные ошибки. Факторный и сравнительный анализ проводили с помощью программы "Statistica for Windows 5.5." [42].
Результаты и обсуждение
В ходе трехлетних полевых экспериментов проведено 1970 измерений продуктивности, фотосинтетической и дыхательной активности у нормальных, мутантных и гибридных растений. Результаты представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1. Структурно-функциональные показатели активности фотосинтетического аппарата и продуктивности нормальных, мутантных и гибридных растений гороха.
Показатель Сорт Торсдаг Мутант М-2004 Гибрид ТхМ-2004 Гибрид М-2004хТ Мутант М-2014
Фотосинтетическая продуктивность
Урожай зерна, % 100 20-30 140-150 130-150 2-3
Индекс мобилизации 0,68±0,02 0,55±0,02 0,80±0,03 0,76±0,03 0,29±0,01
Высота растений, см 170±5 96±3 208±6 207±5 110±4
ЧПФ, мг сух. в./ дм2-сутки 63±3 26±1 78±3 75±3 45±2
Содержание пигментов, мкг/г сырой массы
Хлорофилл ^+Ь) 1887±36 1450±19 1912±33 1875±28 1005±30
Хлорофилл a 1350±41 1030±38 1357±43 1365±52 750±23
Хлорофилл Ь 537±16 420±8 555±14 510±18 255±9
Каротиноиды 590±25 441±13 592±19 598±21 312±10
Фотосинтетическая активность листьев
Максимальный фотосинтез, мкмольСО2/дм2- мин
3,2±0,2 2,3±0,1 4,0±0,1 4,5±0,1 1,7±0,1
Скорость выделения кислорода, 10-3 мкмоль О2/ дм2- мин
67,5±4,1 37,3±1,9 98,7±6,8 92,9±7,1 52,0±3,2
Фотосинтез единичного хлоропласта, 10-10 мкмольСО2/хлоропласт-мин
15,9 10,3 25,6 24,9 12,2
Ассимиляционное число, мкмоль СО2/мг хлорофилла-мин
0,56 0,46 0,76 0,76 0,46
Скорость реакции Хилла, мкмоль феррицианида/мг хлорофилла-мин
8,8 10,6 12,2 13,9 11,4
Показатели мезоструктуры листьев
32 Число клеток, 10 /см П 530±20 340±10 550±20 540±30 360±20
Г 810±40 580±30 980±40 970±50 580±20
Объем клетки, 103 мкм3 П 21±1,2 13±0,2 16±0,8 18±1,5 24±1,4
Г 8±0,5 10±0,6 9±0,4 8±0,8 10±0,7
Число ХП в клетке П 18±0,5 25±1,7 19±0,6 20±1,1 17±0,4
Г 10±0,2 15±0,8 10±0,1 13±0,9 10±0,2
Число ХП, млн/см П 9,5±0,3 8,5±0,6 10,5±0,5 10,8±0,4 6,1±0,1
Г 8,1±0,2 8,7±0,4 9,8±0,3 12,6±0,6 5,8±0,1
Коэффициент объема хлоропласта, мкм3 П 1137 490 812 728 1382
Г 770 637 870 585 970
Активность ферментов хлоропласта, мкмоль субстрата/г сырой массы-мин
РБФК/О 5,5±0,2 10,2±0,3 6,1±0,2 9,7±0,4 8,9±0,4
НАДФ - ГАФДГ 24±1,4 73 ±2,5 42±4,0 38±4,5 10±1,8
ФЕПК 0,52±0,01 0,75±0,04 0,59±0,02 0,73±0,04 1,06±0,07
НАДФ - МДГ 2,1±0,08 9,0±0,11 3,2±0,06 8,6±0,17 4,4±0,12
НАДФ - МЭ 0,6±0,03 1,2±0,05 0,7±0,02 1,1±0,03 1,0±0,03
Сравнение урожайности реципрокных гибридов показало явное превышение таковой для исходных форм, урожайность М-2014 оказалась очень низкой (табл. 1). Величина чистой продуктивности фотосинтеза М-2014 явно нарушает очевидное соответствие между этим показателем и урожаем зерна в отношении других форм растений. Исследование ферментов во фракции хлоропластов выявило совершенно неожиданную картину: активность всех ферментов у формы Торсдаг и М-2004 представляют собой минимальные и максимальные показатели, между которыми укладываются результаты для обоих гибридов.
Изучение мезоструктуры листьев показало, что основной причиной хлорофилльной недостаточности мутантов является уменьшение числа клеток и палисадного, и губчатого мезофилла. Мутант 2004, имеющий ККГ, частично компенсирует это увеличением числа хлоропластов в обоих типах клеток, что в итоге не приводит к такому резкому, как у М-2014, снижению числа хлоропластов в единице ассимилирующей поверхности. Очевидная обратная корреляция между числом и объемом клеток тканей у М-2004 явно нарушена в отношении палисадной ткани, чей вклад в фотосинтез составляет 70-90% [31].
Полученные результаты о повышенном числе губчатых клеток на единицу площади листа у гибридов хорошо согласуются с увеличением у них интенсивности транспирации на 70% против исходной формы и снижением устьичного сопротивления для СО2 в 2 раза [28]. Несмотря на то, что оба мутанта имели одинаково маленькие количества палисадных и губчатых клеток, максимальный фотосинтез у М-2014 был ниже, чем у М-2004, на 25%, а урожайность - в 10 раз меньше. Сниженная активность ГАФД плюс повышенная активность ФЕПК объясняют снижение содержания крахмала и увеличение концентрации серина, аспартата и малата в листьях М-2014.
Таблица 2. Активность дыхательных ферментов (мкмоль субстрата/г сырой массы-мин) и содержание метаболитов в листьях нормальных, мутантных и гибридных растений гороха
Показатель Сорт Торсдаг Мутант М-2004 Гибрид ТхМ-2004 Гибрид М-2004хТ Мутант М-2014
М итохондриальный компартмент
НАД - ИДГ 4,3+0,11 12,3+0,93 10,6+0,84 6,8+0,31 2,7+0,12
НАДФ - ИДГ 7,5+0,35 16,1+0,61 17,0+0,41 10,2+0,20 7,0+0,14
НАД - МДГ 78+1,34 149+6,09 126+8,12 97+2,96 270+9,23
НАД - МЭ 0,91+0,03 1,08+0,04 0,82+0,06 0,69+0,02 3,10+0,09
Цитоплазматический компартмент
НАДФ - ИДГ 17+0,51 36+1,27 20+1,63 34+0,83 27+0,96
НАДФ - МЭ 5,8+0,24 7,2+0,31 6,9+0,28 7,0+0,41 10,9+0,39
НАД -ГАФДГ 12+0,83 37+1,46 23+1,12 19+0,92 5,7+0,22
НАДФ-ГФДГ 3,9+0,21 11,8+0,35 6,3+0,17 10,2+0,23 18,2+0,49
ФЕП-карбоксилаза 1,2+0,08 2,4+0,13 1,5+0,07 2,0+0,08 1,8+0,09
Пируваткиназа 0,6+0,02 1,1+0,03 0,8+0,02 1,0+0,02 0,4+0,01
Ядерный компартмент
НАД - ИДГ 1,3+0,03 2,1+0,05 1,5+0,01 2,0+0,02 3,3+0,06
НАДФ - ИДГ 4,1+0,1 10,8+0,3 5,8+0,1 7,6+0,2 3,5+0,1
НАД - МДГ 35+1 66+3 51+3 69+3 19+1
НАДФ - ГФДГ 0,4+0,01 0,8±0,02 0,6±0,02 0,9±0,03 0,3±0,01
Пируваткиназа 0,03±0,01 0,05±0,02 0,04±0,01 0,05±0,02 0,03±0,01
Углеводы, мг/г сырой массы
Крахмал 15,3±0,4 7,7±0,2 12,9±0,8 10,1±0,2 6,8±0,2
Сахароза 9,8±0,3 6,1±0,3 7,8±0,2 6,2±0,3 5,4±0,1
Редуцирующие сахара 10,3±0,3 9,7±0,2 6,3±0,2 7,1±0,2 9,1±0,3
Аминокислоты, мкмоль/г сырой массы
Аланин 42,7±1,6 10,0±0,5 26,4±0,9 10,1±1,0 12,6±1,0
Глицин 1,3±0,1 2,0±0,1 1,6±0,1 1,2±0,1 0,8±0,1
Серин 26,8±1,1 9,6±0,4 25,7±0,8 18,6±0,9 54,2±2,1
Аспартат 19,9±0,6 25,8±0,8 15,9±0,3 10,8±0,4 39,1±1.4
Органические кислоты, мкмоль/мг белка
Малат* 27,9±1,2 29,1±1,0 16,1±0,5 18,3±0,6 50,3±1,2
Пируват* 17,3±0,2 58,9±2,0 56,4±1,2 63,8±1,9 14,4±0,5
Лактат** 12,3±0,3 9,1±0,2 9,7±0,2 8,5±0,1 28,7±1,1
Пируват ** 48,9+2,6 100+4,3 60,5+4,1 80,2+3,7 40,5+1,7
* Данные приведены для хлоропластной фракции, ** - для цитоплазматической фракции.
В работах [19,21,22] показано, что ни гликолиз, ни окислительный пентозофосфатный путь (ОПФП) и цикл Кребса не отключаются в ассимилирующих клетках растений. Исследование ключевых ферментов темнового дыхательного метаболизма выявило, что М-2004 и гибриды имели высокую, по сравнению с Торсдагом, активность НАДФ-ГФДГ (маркер ОПФП), НАДН-ГАФДГ и пируваткиназы (маркеры
гликолиза), НАД(Ф)-ИДГ и НАД-МДГ (маркеры цикла Кребса) во всех компартментах клетки (табл.2). Особенно значительной оказалась активность ферментов терминального участка цикла Кребса НАД-МДГ и НАД-МЭ у низкопродуктивного М-2014. Высокие значения дыхательных параметров объясняют данные о пониженном содержании основных энергетических источников - углеводов в листьях этих растений. Интересно, что у гибридов наследование уровня активности цитоплазматических НАДФ-ИДГ и НАДФ-ГФДГ, как и числа хлоропластов в клетке, идёт по материнской линии.
Отрицательная зависимость содержания аланина, аспартата и малата и зерновой продуктивности может быть связана с более интенсивным метаболизмом этих веществ, одним из первых продуктов превращения которых является пируват. Высокое содержание малата по отношению к пирувату в хлоропластной фракции М-2014 при наличии высокоактивного НАДФ-МЭ и весьма низком отношении концентраций НАДФН/НАДФ в хлоропластах кажется трудно объяснимым. Причина этого явления кроется в необходимом балансе синтезируемых «in vivo» АТФ и НАДФН [43, с.288], при недостаточном синтезе АТФ из-за низкого содержания хлорофилла у М-2014, трехкратном снижении числа реакционных центров обеих фотосистем, скорости циклического фотофосфорилирования [44] и невозможности быстрой утилизации НАДФН ГАФ-дегидрогеназой.
Одновременное увеличение активности НАДФ-ИДГ может обеспечить увеличение как биосинтеза НАД(Ф)Н, так и его непрямой перенос из митохондрий и ядра в цитоплазму, при этом более высокая активность цитоплазматического фермента способна сбалансировать эти процессы. Данная реакция, возможно, компенсирует недостаток пула НАДФН2 фотосинтетического происхождения вследствие двух-трехкратного снижения числа реакционных центров фотосистемы II в хлоропластах мутантов [44]. Эти результаты свидетельствуют о том, что ферментативная составляющая дыхательной функции митохондрий, ядра и цитоплазмы у М-2004 и гибридов изменена таким образом, что способствует синтезу и экспорту большего количества НАД(Ф)Н, чем у исходной формы Торсдаг.
Значительное накопление серина у М-2014 показывает, что этот метаболит далее не используется, то есть фотодыхание, в процессе которого образуется серин, частично подавлено. Это доказывается и пониженным содержанием глицина, из которого образуется серин (табл. 2). У М-2004, напротив, метаболизм серина идёт более интенсивно. Выделяющийся при фотодыхании аммиак обычно включается в реакцию с глутаминовой кислотой [43, с. 149], что тормозит реакцию дезаминирования аспартата и
его превращение в оксалоацетат [43, с.358] и, таким образом, объясняет накопление аспартата у М-2014.
Известно, что фотосинтез и дыхание являются основными биоэнергетическими процессами живой клетки, поставляющими АТФ, восстановитель и углеродные скелеты для биосинтетических реакций, активность которых в конечном итоге определяет продуктивность растений. Несмотря на многолетние исследования донорно-акцепторных отношений этих процессов в ассимилирующих клетках растений и их очевидный функциональный характер, анализ средних значений фотосинтетических и дыхательных показателей не позволяет выявить четкую картину их взаимосвязей. Для выяснения внутренней структуры таких связей между физиологическими показателями изогенных линий гороха, резко контрастных по продуктивности, был проведен факторный анализ данных из таблиц 1 и 2.
Напомним, что в статистике под факторным анализом понимается выявление систем взаимосвязанных параметров, которые, в свою очередь, независимы между собой. Каждая переменная представляется в виде зависимости Хi = • 1у ^ , где Хi - переменная, 1у - факторные нагрузки, Fi - факторы [42]. Факторные нагрузки -это коэффициенты корреляции переменных Хi с фактором Поскольку изучаемые генотипы гороха различаются между собой по физиологическим показателям, что задается их разной нормой реакции, была сформирована суммарная выборка всех изученных параметров, для всех генотипов гороха. Для такой общей выборки были рассчитаны корреляционные матрицы (таблицы коэффициентов корреляций каждого параметра с каждым). Из анализа этих матриц следует, что исследуемая выборка богата статистически значимыми связями.
В ходе факторного анализа все разнообразие переменных было сведено к анализу четырех факторов. В алгоритме факторного анализа факторы ортогональны, то есть коррелировать между собой не могут. На «вход» факторного анализа подается корреляционная матрица, «выход» факторного анализа - факторы и их факторные нагрузки. В таблице 3 представлены данные такого анализа, куда вошли показатели с факторными нагрузками не менее чем 0.75, что при данном объеме выборки соответствует уровню значимости Р > 0,95. Указанные факторы объясняют 95% общей дисперсии исследованных показателей, что свидетельствует о достаточной полноте анализа.
Таблица 3. Факторный анализ показателей продуктивности, фотосинтеза и дыхания.
Фактор 1 Фактор 2 Фактор 3 Фактор 4
Показатель Показатель Показа- Показа-
Факторная нагрузка Факторная нагрузка тель Факторная нагрузка тель Факторная нагрузка
Урожай зерна 0, 91 ГАФДГ цитопл. 0, 86 Реакция 0, 89 НАДФ- -0,75
Чистая продуктивность фотосинтеза 0, 75 Пируват цитопл. 0, 79 Хилла ИДГ митохонд риальная
Индекс мобилизации 0, 92 Число хлоропл. в палисадн. кл. 0, 89 Редуцир сахара -0, 83
Высота растения 0, 84 Число хлоропл. в губчат .кл. 0, 93
Ассимиляционное число 0, 77 НАДФ - МДГ хлоропласт 0, 87
Крахмал 0, 81 НАД-МЭ митох. 0, 75
Хл (а+Ь) 0, 95 НАД - ИДГ 0, 75
Хлорофилл а 0, 95 митохондр.
Хлорофилл Ь 0, 93 НАДФ - ИДГ 0, 80
Каротиноиды 0, 95 цитоплазматич.
Максимальный фотос-з, СО2 0, 86 ФЕПК цитоплазматич. 0, 82
Выделение О2 0, 75 Пируваткиназа 0, 90
Фотосинтез 1 ХП 0,75 цитоплазматич.
Число палис. клеток 0, 89 НАДФ-ИДГ ядерная 0, 94
Число хлоропл. в 1 см2 листа 0, 90 НАД - МДГ ядерная 0, 85
Число губчатых клеток 0, 86 ГФДГ ядерная 0, 86
Объем губч.клет. -0, 82 Пируваткиназа 0, 91
Аспартат -0, 89 ядерная
Малат -0, 86 Серин -0, 76
НАДФ- МЭ цитоплазматич. -0, 83 Объем палисадной клетки -0, 80
ФЕПК хлоропл. -0, 86 Лактат -0, 84
НАД - МДГ митохондриальн. -0, 87 КОХ палисадной ткани -0, 88
НАД - МЭ -0, 83 КОХ губчатой -0, 77
ГФДГ цитопл. -0, 87 ткани
НАД - ИДГ ядерная -0, 87
В факторном анализе фактор определяется как система взаимосвязанных по тем или иным причинам показателей. Рассмотрим показатели, вошедшие в первый фактор. Он характеризуется некими внутренними связями, направленными на поддержание фотосинтетической продуктивности, так как сюда вошли такие интегральные показатели, как урожай зерна, чистая продуктивность фотосинтеза, индекс мобилизации, ассимиляционное число, максимальный фотосинтез и фотосинтез единичного хлоропласта, скорость выделения О2. Условно назовем этот фактор 1 "Продуктивность". Иными словами, группа показателей первого фактора представляет систему, где одни показатели положительно коррелируют, а другие - отрицательно, с продуктивностью. Так, например, для случайно выбранных параметров системы связности фактора 1 показано, что число хлоропластов в единице ассимилирующей поверхности находится в прямой линейной зависимости с индексом мобилизации (Рис.1), в экспоненциальной зависимости - с урожаем зерна (Рис.2). Отрицательная корреляция показана для содержания аспартата и индекса мобилизации (Рис.3).
то
X
ТО
К
О
160
140
120
100
80
60
40
20
----
4 6 8
Число хлоропластов, млн./сМ2
10
12
Рисунок 1. Экспоненциальная зависимость между показателями системы "Фактор 1": числом хлоропластов и урожаем зерна.
0
0,85
Ч 0,75
0
I
н
° 0,65
то
2 0,55
Ю
о
0,45
о 0
х 0,35
0,25
5,5
< * •
< ............. ...........
/
............... ^:.............. ................
.¿с.............
6,5 7,5 8,5 9,5
Число хлоропластов, млн./см2
10,5
11,5
Рисунок 2. Прямая линейная зависимость между показателями системы "Фактор 1": числом хлоропластов и индексом мобилизации.
1,0
0,9
сц 0,8
I
1-о 0,7
0,6
то
со ^ 0,5
^ ю 0,4
о
о 0,3
си
^ 0,2
X
0,1
0,0
• -___
...............____ ................
...................
............... .....................Г"
10 20 30
Содержание аспартата, мкмоль/г сырой массы
40
0
Рисунок 3. Отрицательная корреляция между показателями системы "Фактор 1": содержанием аспартата и индексом мобилизации.
Со знаком "плюс" в систему первого фактора "Продуктивность" вошли такие фотосинтетические показатели, как чистая продуктивность фотосинтеза, содержание пигментов и крахмала, скорость фотосинтеза, число хлоропластов в единице площади листа, объем и число ассимилирующих клеток. Со знаком "минус" сюда вошли
некоторые параметры альтернативных путей фотосинтеза - ФЕПК, НАДФ-МЭ, малат и аспартат; митохондриальные НАД-МДГ и НАД-МЭ, ядерная НАД-ИДГ и цитоплазматическая ГФДГ.
К системе показателей второго фактора относятся параметры, характеризующие работу хлоропластных, цитоплазматических, ядерных и митохондриальных "темновых" ферментов метаболических путей (НАДФ-ИДГ, НАДФ-МЭ, ГФДГ, НАД-ИДГ и НАД-МДГ), участвующих в челночных механизмах переноса веществ и поставляющих " восстановительную силу" клетки - АТФ, НАД(Ф)Н и низкомолекулярные соединения для биосинтетических процессов (пируват, ФЕПК, НАД(Ф)-МЭ, ГФДГ). Сюда же вошли показатели, характеризующие работу пластидной системы: число хлоропластов в клетках, КОХ палисадной и губчатой клеток - объем клетки, "обслуживаемый" одним хлоропластом. Так как все эти параметры в той или иной мере связаны с энергетикой метаболизма клетки, условно назовем второй фактор как фактор "Энергетической сопряженности".
В систему показателей фактора 3 вошли два параметра - скорость реакции Хилла и редуцирующие сахара. Противоположные знаки факторных нагрузок этих параметров понятны, поскольку известно, что при увеличении содержания сахаров скорость работы ЭТЦ уменьшается [43-45], то есть эти показатели противоположно влияют на фактор 3.
Факторный анализ в систему фактора 4 выделил только один показатель -активность митохондриальной НАДФ-ИДГ. Это означает, что он достоверно не связан какими-либо внутренними связями ни с одним из других изученных параметров. Стоит отметить, что НАДФ-ИДГ - это анаплеротический фермент, переключающий пул метаболитов цикла Кребса на синтез аминокислот семейства пролина и катализирующий реакцию, являющуюся источником нефотосинтетического НАДФН2 и СО2. Ранее была показана положительная корреляция между высокой активностью этого фермента и содержанием пролина в листьях М-2004 и обоих гибридов [21].
С целью сравнения систем связности у мутантов и гибридов средние значения параметров всех четырех групп факторов, представленные в таблице 3, были стандартизированы, и по ним построены разностные спектры, сгруппированные по факторам. Далее значения параметров исходного генотипа Торсдаг, принятого за стандарт, вычитались из параметров других изученных линий. Результаты представлены на рисунках 4 и 5. На оси ординат откладывали разницу между значениями показателей гибридов и Торсдага (Рис. 4) или мутантов и Торсдага (Рис. 5), на оси абсцисс -показатели, входящие в систему того или иного фактора.
Физиологические показатели, сгруппированные по факторам
Рисунок 4. Сравнительный анализ выраженности показателей продуктивности, фотосинтеза и дыхания у гибридов гороха. Б1"+" и Б2 "+" - показатели фактора 1 и фактора 2 с положительным коэффициентом корреляции; Б1"-" и Б2 "-" - показатели фактора 1 и фактора 2 с отрицательным коэффициентом корреляции. Б3-4 - показатели, входящие в группы фактора 3 и фактора 4. Нулевая линия соответствует исходной генотипу Торсдаг.
Физиологические показатели, сгруппированные по факторам
Рисунок 5. Сравнительный анализ выраженности показателей продуктивности, фотосинтеза и дыхания у мутантных форм гороха. Пояснения см в рис. 4.
Сравнительный анализ позволил выявить следующие закономерности. По системе показателей фактора 1 - "Продуктивность", для которых установлены высокие положительные коэффициенты корреляции (урожай зерна, ЧПФ, индекс мобилизации, крахмал, пигменты, скорость поглощения СО2 и выделения О2, число ХП и палисадных клеток) мутанты явно "проигрывают" Торсдагу, а гибриды превосходят лучшую родительскую форму (Рис. 4 и 5). Относительно группы Б1"-", показателей фактора 1 с отрицательными коэффициентами корреляции (содержание аспартата, малата, объем губчатых клеток и активность ФЕПК, цитоплазматических НАДФ-МЭ и ГФДГ, ядерной НАД-ИДГ и митохондриальных НАД-МДГ и НАД-МЭ), здесь явно доминирование низкопродуктивного М-2014. Гибриды ведут себя так же, как М-2004, а по отдельным параметрам характеризуются меньшими, чем Торсдаг, отрицательными коэффициентами корреляции с фактором 1.
Анализ сравнительных спектров показал также, что по системе показателей фактора 2 "Энергетическая сопряженность" с положительными факторными нагрузками Б2"+" (число ХП в клетке, ферменты темнового дыхательного метаболизма и содержание пирувата) М-2004 и гибриды ведут себя одинаково: их параметры доминируют над таковыми у Торсдага, и явно преимущество М2004хТ над реципрокным гибридом. По параметрам системы "Энергетическая сопряженность" Б2"+" М-2004 и гибриды доминируют, а по параметрам Б2"-" проигрывают Торсдагу. Низкопродуктивный М-2014, не дающий гетерозиса, имеет прямо противоположную картину по системе фактора 2. Факторы 3 и 4 мы не обсуждаем из-за недостаточности данных.
Для выяснения физиолого-биохимических систем, задействованных в реализации компенсационного комплекса генов, был использован следующий алгоритм поиска: во-первых, определение параметров, одинаково изменяющихся у обоих гибридов; во-вторых, поиск показателей, изменяющихся у гибридов и М-2004 и одинаково, и разнонаправленно, так как трудно предполагать, какие изменения у М-2004 приводят к эффекту гетерозиса у гибридов; в-третьих, идентификация показателей, по которым явно различаются М-2004 и М-2014. После такого сравнительного анализа показателей различных факторов у М-2004, дающего эффект гетерозиса, и у М-2014, не дающего эффект гетерозиса выяснилось, что М-2014 имеет только 4 показателя системы Б2"+", превышающие контрольные значения. Интересную картину выявили при анализе показателей с отрицательными коэффициентами корреляции Б2"-" (содержание серина, лактата, объем палисадных клеток, КОХ обоих типов клеток): резкое снижение у М-2004 по сравнению с Торсдагом и повышение - у М-2014. Оба гибрида по этой системе показателей ведут себя так же, как
М-2004. Таким образом, поиск физиологических маркеров ККГ сузился до пяти изученных параметров, входящих в систему, характеризующую сопряженную работу органелл растительной клетки.
Считается, что полулетальные хлорофилльные мутации являются вполне адекватной модельной системой для интеграции генов жизнеспособности в виде компенсационного комплекса генов в одном генотипе. Вероятно, именно эти физиологические параметры М-2004 из системы связности второго фактора, плюс то обстоятельство, что у гибридов эффект мутации сЫ компенсирован присутствием нормального аллеля, и приводят к изменению онтогенетической программы развития гибридов таким образом, что их продуктивность увеличивается. В.А. Соколовым установлено, что в ответ на негативную хлорофилльную мутацию, ослабляющую жизнеспособность мутантов, у М-2004 формируется ККГ, который в гибридном организме дает эффект гетерозиса по продуктивности, генетической причиной которого является эпистатическое взаимодействие генов[28]. Факторный и сравнительный анализ показали, что физиологическое проявление ККГ - это показатели, входящие в систему второго фактора. Таким образом, в рамках данной модели, можно сделать следующие выводы:
1. Причины, лежащие в основе низкой продуктивности мутантов - те же самые, что и причины, лежащие в основе высокой продуктивности гетерозисных гибридов. Гибриды "сильнее" лучшей родительской формы по группе показателей с положительными коэффициентами корреляции, входящих в систему показателей фактора 1 (урожай зерна, ЧПФ, индекс мобилизации, ассимиляционное число, крахмал, пигменты, скорость поглощения СО2 и выделения О2, число ХП в 1 см2, число клеток) и в систему показателей фактора 2 (число ХП в клетке, ферменты дыхательного метаболизма различных органелл, пируват). По группе показателей с отрицательными коэффициентами корреляции, входящими в систему фактора 2 (содержание серина, лактата, объем палисадных клеток, КОХ обоих типов клеток), гибриды "слабее" Торсдага. Мутанты "проигрывают" Торсдагу по показателям с положительными факторными нагрузками в системе показателей фактора 1, но доминируют по параметрам с отрицательными факторными нагрузками системы показателей этого же фактора (аспартат, малат, объем губчатых клеток и активность ФЕПК, цитоплазматических НАДФ-МЭ и ГФДГ, ядерной НАД-ИДГ и митохондриальных НАД-МДГ и НАД-МЭ).
2. Выражение компенсационного комплекса генов у М-2004 и гибридов на физиологическом уровне - это система показателей второго фактора с отрицательными
факторными нагрузками, характеризующая функциональные связи между реакциями, поставляющими в различных компартментах клетки АТФ, НАД(Ф)Н и низкомолекулярные соединения. Физиологические маркеры ККГ М-2004 - это содержание лактата, серина, объем палисадных клеток, коэффициент объема хлоропласта в палисадных и губчатых клетках.
3. Два разных вида анализа, факторный и сравнительный, показали одни и те же результаты, что указывает на неслучайную природу обнаруженных систем связности физиологических показателей фактора 1 и фактора 2.
Сокращения: ГАФДГ - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа, ГФДГ-глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназа, ИДГ- изоцитратдегидрогеназа, ККГ- компенсационный комплекс генов, КОХ -коэффициент объема хлоропласта, МДГ- малатдегидрогеназа, МЭ - малик-энзим, РБФК/О - рибулезобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа, ФЕПК- фосфоенолпируват-карбоксилаза, ЧПФ - чистая продуктивность фотосинтеза.
Список литературы
1. Ничипорович А.А. Физиология фотосинтеза и продуктивность растений // Физиология фотосинтеза / Под ред. Ничипоровича А. А. М.: Наука, 1982. С. 7-33.
2. Gifford R. M. A comparison of potential photosynthesis, productivity and yield of plants species with differing photosynthetic metabolism // Austral.J.Plant Physiol. 1974. V.1. №1. P. 107-117.
3. Zelitch I. The close relationship between net photosynthesis and crop yield // Bio-science. 1982. V.32. №10. P. 796-802.
4. Быков О. Д. Исследования по фотосинтезу в связи с задачами селекции как науки // С/х биология. 1980.Т. 15. №3. С. 334-341.
5. Фотосинтез и продукционный процесс / Под ред. Мокроносова А. Т. Свердловск: Изд-во Уральского ун-та, 1988. 180 с.
6. Гуляев Б.И., Рожко И.И., Рогаченко А.Д., Голик К.Н., Митрофанов Б.А., Борисюк В.А. Фотосинтез, продукционный процесс и продуктивность растений. Киев: Наукова думка, 1989. 152 с.
7. Андрианова Е.А., Тарчевский И.А. Хлорофилл и продуктивность растений. М.: Наука, 2000. 134 с.
8. Куперман И.А., Хитрово Е.В. Дыхательный газообмен как элемент продукционного процесса растений. Новосибирск: Наука, 1977. 183 с.
9. Тооминг Х.Г. Экологические принципы максимальной продуктивности посевов. Л.: Наука, 1984. 264 с.
10. Кумаков В.А. Физиологические обоснования моделей сортов пшеницы. М.: Агропромиздат, 1985. 268 с.
11. Головко Т.К. Дыхание растений. Физиологические аспекты. С-Пб: Наука, 1999. 205 с.
12. Курсанов А.Л. Фотосинтез и транспорт ассимилятов. М.: Наука, 1976. 646 с.
13.МокроносовА.Т. Фотосинтетическая функция и целостность растительного организма: 42-е Тимирязевское чтение. М.: Наука, 1983. 64 с.
14. Чиков В.И. Фотосинтез и транспорт ассимилятов. М.: Наука, 1987. 188 с.
15. Уоллес Д. Генетика фотосинтеза и продуктивности (на примере фасоли) // Генетика и благосостояния человечества / Под ред. М.Е. Вартаняна. М.: Наука, 1981. С. 469-480.
16. Насыров Ю.С. Генетическая регуляция формирования активности фотосинтетического аппарата // Физиология фотосинтеза / Под ред. А. А. Ничипоровича. М.: Наука, 1982. С. 146-164.
17. Молчан И.М., Ильина Л.Г., Кубарев П.И. Спорные вопросы в селекции растений // Селекция и семеноводство. 1996. № 1-2. С. 36-51.
18. Семихатова О.А., Заленский О.В. Сопряжённость процессов фотосинтеза и дыхания //Физиология фотосинтеза /Под ред. А.А. Ничипоровича, М.: Наука, 1982. С. 130-145.
19. Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания / Под ред. В.Л. Вознесенского. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1988. 248 с.
20. Голик К.Н. Темновое дыхание растений. Киев: Наукова Думка, 1990. 140 с.
21. Вайшля О.Б., В.В. Иванищев. Фотосинтетические характеристики гетерозисных форм Pisum sativum (L.) и их родительских линий в связи с продуктивностью // Сибирский экологический журнал, 2003. № 1. С.113-118.
22.МамушинаН.С., ЗубковаЕ.К. Функционирование основных этапов темнового дыхания на свету у С3-растений с разным сезонным ритмом // Физиология растений. 1995. Т.42. №1. С. 30-37.
23. Филатов Г.Ф. Физиолого-биохимическая природа гетерозиса. М.: Агропромиздат, 1993. 100 с.
24. Сидоренко О.И., Беденко В.П., Уразалиев Р.А. Фотосинтез гетерозисных гибридов озимой пшеницы. Алма-Ата: Изд-во Гылым, 1990. 40 с.
25. Wilcox M.R., Koller A. Performance of Chlorophyll-defficient and Normal nearisogenic lines of soybean cultivars // Crop Sci. 1992. V.32. P. 1179-1183.
26. Шумный В.К., Соколов В.А., Вершинин А.В. Гетерозис и механизмы сверхдоминирования / Гетерозис. Минск: Наука и техника, 1984. С. 2-142.
27. Струнников В.А. Природа гетерозиса и новые подходы его повышения. М.: Наука,1994. 108 с.
28. Соколов В.А. Компенсационный комплекс генов - причина гетерозиса у гороха // ДАН СССР. 1990. Т.310. № 5. С. 1242-1244.
29. Рыбцов С.А., Гостимский С.А. Вклад компенсаторных генов в проявлении количественных признаков у гибридов гороха // Генетика. 1996. Т.32. №9. С. 12291235.
30. Соколов В. А. Локализация мутантного гена, контролирующего пигментацию типа chlorotica у гороха // ДАН СССР. 1989. Т. 308. С. 1244-1246.
31. Мокроносов А. Т. Мезоструктура и функциональная активность фотосинтетического аппарата. Свердловск: Изд-во УрГУ, 1978. С. 5-30.
32. Lichtenhaler H.K., Wellburn A.R. Determination of Total Carotenoids and Chlorophyll "a" and "b" Leaf Extracts in Different Solvent // Biochem. Soc. Trans. 1983. V. 11. P. 591-598.
33. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермакова, Л.: Колос, 1972. 456 с.
34. Plumb-Dhindsa P.L., Dhindsa R.S., Thorpe T.A. Non-autotrophic CO2 Fixation During Shoot Formation in Tobacco Callus // J.Exp.Bot. 1979. V. 30. P. 759-767.
35. Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения / Под ред. А.Т. Мокроносова и А.Г. Ковалёва, М.: Агропромиздат, 1989. 462 с.
36. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. М.: Наука, 1980. 160 с.
37. Юзбеков А.К. Спектрофотометрические способы определения активности ключевых ферментов фотосинтетического метаболизма у С3- и С4 - растений // Препринт. Киев, 1990. 32 с.
38. Moller G., Stamp P., Geisler G. Fotometrische Messung der PEP-Carboxylase Activitat in Maisblattern unter Berucksichtigung des Entwicklungszustendes der Pflanze // Z. Pflanzener Nahr. und Bodenk. 1977. Bd. 140. S. 481-490.
39. Plant G.W.E. Isocitric Dehydrogenase (TPN-linked) from Pig Heart (Revised Procedure) // Methods in Enzymology. 1962. V. 5. P. 645-651.
40. Chapman E.A., Graham D. The Effect of Light on the Tricarboxylic Acid Cycle in Green Leaves // Plant Physiol. 1974. V. 53. P. 879-898.
41. Магомедов И.М., Тищенко Н.Н. Методика исследования главных ферментов С4-фотосинтеза // Труды по прикл. ботанике, генетике и селекции. 1978. Т. 61. С. 61-68.
42. Афифи А.А., Эйзен С. П. Статистический анализ. Подход с использованием ЭВМ. М.: Мир, 1982. 488 с. (Aff A.A., Azen S.P. Statistical Analysis. A Computer Oriented Approach. Ed.II : Academic Press, New York-San Francisco-London, 1979).
43. Эдвардс Дж., Уокер Д. Фотосинтез С3- и С 4-растений: механизмы и регуляция: Пер. с англ. М.: Мир, 1986. 590 с. (Edwards J., Walker D.Photosynthesis in C3- and C4- Plants: Mechanisms and Regulation. Moscow: Mir, 1986).
44. Vaishlya O.B., Ladygin V.G., Sokolov V.A., Semenova G.A. Characterization of Photosynthetic Apparatus of Pea Chlorophyll Mutants and Their Heterotic F1 Hybrids with Standard Genotype (cv. Torsdag) // Photosynthetica. 1998. V. 35. P. 428-443.
45. Ott T., Clarke J., Birks K., Johnson G. Regulation of the photosynthetic electron transport chain // Planta. 1999. № 209. P. 250-258.
46. Douce R., Neuburger M. The Uniqueness of Plant Mitochondria //Ann. Rev. Plant Physiol. & Plant Mol. Biol. 1989. V.40. P. 371-414.
