CC BY
39
Научни трудове на Съюза на учените в България-Пловдив, Серия Г. Медицина, фармация и дентална медицина т. XIX. ISSN 1311-9427 юни 2016. Scientific works of the Union of Scientists in Bulgaria-Plovdiv, series G. Medicine, Pharmacy and Dental medicine, Vol. XIX, ISSN 1311-9427 Medicine and Dental medicine June 2016.
ЕКСТРАКЦИЯ НА БИОЛОГИЧНОАКТИВНИ ВЕЩЕСТВА ОТ ЛЕЧЕБНИ РАСТЕНИЯ
М. Кацарова*, С. Димитрова*, Л. Луканов*, Н. Садъкова**, Ф.
Садъков***
*Медицински университет-Пловдив, Фармацевтичен факултет, катедра „Химия и биохимия", бул. „В. Априлов"15А **студент по Медицина, Медицински университет-Пловдив *** „Авицена Херб" ООД, Пловдив
EXTRACTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES FROM
MEDICINAL PLANTS
М. Katsarova*, S. Dimitrova*, L. Lukanov*, N. sadakova**, F. Sadakov***
* Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Medical University, 15A V. Aprilov Blvd, Plovdiv **student of Medicine, Medical University of Plovdiv *** Аvicena Herb-Ltd, Plovdiv
Abstract
Extracts from Hypericum perforatum, Valeriana officinalis, Мelissa officinalis, Crataegus monogyna have anxiolitic and sedative and Serratula coronata-anabolic and neuroprotective effects. They have been used successfully in folk medicine since centuries. Combinations from them have been prepared for better therapeutical effect as well. Qualitative characterization of herb extract is done by exact biological active substances. Very often these are polyfenols, terpenes, phytosteroids. According to European pharmacopoeia 8.0 extract from Valeriana officinalis is characterized by presence of valerenic acid, Мelissa officinalis - rosmarinic acid, Crataegus monogyna - quercetin, hyperoside, Hypericum perforatum - hypericin and Serratula coronata-20-hydroxyecdisone. The aim of this study is to obtain maximum quantities of active substances from the herbs mentioned by variance of different conditions of the extraction process.
Key words: Hypericum perforatum, Valeriana officinalis, Мelissa officinalis, Crataegus monogyna, Serratula coronata
Увод
Познатите от векове лечебни растения жълт кантарион (Hypericum perforatum), валериана (Valeriana officinalis), маточина Melissa officinalis) с анксиолитично и седативно действие (Sharma et al., 2012), глог (Crataegus monogyna) с влияние върху сърдечно-
съдовата (Furst et al., 2010) и централната нервна системи (Tabach et al., 2009) и по-малко популярната в България сератула (Serratula coronata) с aнаболен и невропротективен ефект (Michel et al., 2012) участват в състава на хранителните добавки Антистрес1 и Антистрес2. Те подпомагат организма срещу ежедневния стрес и благоприятно повлияват функцията на нервната и сърдечносъдовата система. В основата на тези добавки е рецепта от известния деятел на билколечението в България Петър Димков, издал в три тома събирани с десетилетия рецепти от народната медицина (Dimkov, 1939). Фармакологичноактивните съединения в екстрактите най-често са от групите на флавоноидите, фенолните киселини, терпените, фитостеролите, фитоекдизоните, алкалоидите, гликозидите. Фитотерапията се основава на синергичния ефект на активните вещества в билките. Флавоноидите се съдържат в почти всички висши растения. Срещат се както в свободно състояние така и под формата на гликозиди. Според Williams и сътрудници (Williams et al., 2004) флаваноидите проявяват разнообразни терапевтични ефекти при заболявания свързани с оксидативен стрес. В литературата се откриват данни за изследвана антиоксидантна (Nuengchamnong et al., 2004) противовъзпалителна (Klinger et al., 1989) антимикробна (Smullen et al., 2007) и противотуморна (Kandaswami et al., 2005) активност. Фенолните киселини са широко разпространени в растенията като производни на хидроксибензоената и хидроксиканелената киселини. Те инхибират липидното окисление чрез улавяне на пероксидните радикали (Pereira et al., 2009). Терпените проявяват антиоксидантна (Grassman, 2005), антибактериална (Cowan, 1999) и противовирусна (Webster et al., 2008) активност. Фитоекдистероидите засилват синтеза на протеини и повишават физическата активност (Syrov et al., 1975), проявяват невропротективен ефект (Syrov et al., 2001), антистресово (Volodin et al., 2012), антидиабетно (Takahashi et al., 1992) хиполипидемично и антиатеросклеротично (Syrov et
20-хидроксиекдизон хиперицин хиперозид
Фигура 1. Структури на кверцетин, розмаринова киселина, валеренова киселина, 20-хидроксиекдизон, хиперицин, хиперозид
Всяка от билките се характеризира по наличието на определени вещества, регламентирани от Европейска фармакопея 8.0. Според нея екстрактите от Valeriana officinalis се характеризират по наличието на валеренова киселина, Мelissa officinalis по розмаринова киселина, Crataegus monogyna по кверцетин и хиперозид, Hypericum perforatum 48
по хиперицин и хиперозид и Serratula coronata по 20-хидроксиекдизон и кверцетин, структурите на които са показани на фиг. 1. За извличане на основните активни вещества от различни части на билките по фармакопейни изисквания се използват дестилирана вода (за соли на алкалоиди, гликозиди, захари, протеини, ензими, антрахинонови производни, танини и др.) и етилов алкохол от 30% до 70% (за летливи масла, въглеводороди, танини, алкалоиди, полифеноли, флавоноиди, гликозиди, смоли и др.). Всеки от тях има предимства и недостатъци. Водата е нетоксична, има ниска цена, незапалима е, но е добра среда за развитие на микроорганизми, стимулира ензимното разграждане, определя хидролизата на веществата и е неселективен разтворител. Алкохолът е селективен, нетоксичен, и е антисептик, но е запалим и е с по-висока цена. Изборът на разтворител зависи от вида на веществата, които ще бъдат извличани и от вида на суровината.
Целта на настоящото изследване е максимално извличане на биологичноактивни вещества от посочените билки чрез вариране условията на екстракция.
Материали и методи
1. Материали - валериана корен (Radix Valerianae); стрък от маточина (Herbal Melissae); стрък от жълт кантарион (Herba Hyperici); обикновен глог цвят и лист (Flos Crataegi cum foliis); сератула стрък (Serratula coronate), етилов алкохол 40%, 70% и дестилирана вода. Дрогите са събрани и изсушени при спазване на условията за събиране и отговарят на изискванията на Европейска фармакопея 7.0 по основните показатели.
2. Екстракция и HPLC-анализ на розмаринова, валеренова и кафеена киселини, рутин, кверцетин, апигенин, витексин, хиперозид, борнил ацетат, хиперицин и 20-хидроксиекдизон
200 mg изсушен и смлян растителен материал от всяка билка се екстрахира с по 10 ml дестилирана вода, 40% и 70%-ен етилов алкохол по метода на мацерация в продължение на 4 часа при стайна температура или при 50°С. На всеки час се взема проба от екстрактите, филтрува се през микрофилтър и се инжектира в HPLC-системата. Количественото определяне на биологичноактивните вещества е направено по разработени от колектива HPLC методи. Използвана е HPLC-система Varian ProStar с PDA детектор. По метод I са определени фенолни киселини и флавоноиди на колона Hitachi C18 AQ (250 mm х 4,6 mm, 5 дт) с подвижна фаза H2O с pH 3,7(A) и ацетонитрил (B) в градиентен режим от 90А:10В до 10А:90В, скорост на потока 0,9 ml/min и детекция при 335 nm. При метод II колоната е Microsorb-MV C18 (150x4,6 mm, 5 ^m), подвижната фаза - ШОс pH 3,7(A) и ацетонитрил:метанол 1:1 (B) в градиентен режим, скоростта на потока 1 ml/min и детекция при 245 nm за 20-хидроксиекдизон, 285nm за хиперицин и 210nm за борнил ацетат и валеренова киселина. Идентификацията на веществата се прави по времената на задържане на чистите такива, а количественото определяне по метода на външния стандарт.
Резултати и обсъждане
Проведена е екстракция с дестилирана вода, 40 и 70%-ен етанол при стайна температура и с 40%-ен при 50°С в продължение на четири часа. Проследени са екстрахираните количества от изследваните вещества на всеки час. На фигура 2 са показани максималните количествата екстрахирани на 3-ия час валеренова киселина, розмаринова киселина, кверцетин, хиперозид, 20-хидроксиекдизон и хиперицин от дрогите с дестилирана вода, 40 и 70%-ен етилов алкохол, както и с 40%-ен етилов алкохол при 50°С на 1-ия час. Например при провеждане на екстракцията при стайна температура и 70% етанол на първия час получените количества вещества са както следва - валеренова киселина 350^g/g, розмаринова киселина 10550^g/g, кверцетин 273^g/g, хиперозид 2600^g/g и хиперицин 480^g/g. На втория час стойностите се увеличават - валеренова киселина 665^g/g, розмаринова киселина 16250^g/g, кверцетин 668^g/g, хиперозид 3590^g/g и хиперицин 675^g/g. Максимално извличане на активните съединения се постига на третия час, съответно валеренова киселина 750^g/g, розмаринова киселина 18500^g/g, кверцетин 700^g/g, хиперозид 4375^g/g и хиперицин 830^g/g. За същото време почти два пъти по-ниски са стойности при екстракция с 40%
етанол - валеренова киселина 450^g/g, розмаринова киселина 6900^g/g, кверцетин 290^g/g. хиперозид 1035^g/g и хиперицин 60^g/g. Незадоволителни резултати за тези вещества се получават при екстракция с дестилирана вода. Единствено 20-хидроксиекдизон се екстрахира най-добре с вода (20550^g/g), докато с етанол количеството е 17100^g/g за 40%-ен и 11350^g/g за 70%-ен. Получените на третия час количества се потвърждават и на четвъртия час.
Фигура 2. Количества екстрахирани биологичноактивни вещества
При провеждане на екстракцията при 50 °С с 40%-ен етанол още на първия час извлечените количества от търсените съединения са съизмерими с тези при стайна температура за 3 часа със 70%-ен етилов алкохол (фиг. 2) - валеренова киселина 730^g/g. розмаринова киселина 18100^g/g, кверцетин 670^g/g, хиперозид 4300^g/g и хиперицин 810^g/g. На втория и на третия час от екстракционния процес при същите условия няма промяна в количествата. Следователно е постигнато максимално извличане на активните вещества още на първия час. По-високата температура позволява скъсяване времето за екстракция, както и използването на 40%-ен етанол вместо 70%-ен.
Получените резултати дават възможност да се подберат и препоръчат най-подходящите параметри за напреднала преработка на дрогата, при които в промишлени условия ще се извлекат в най-голяма степен биологичноактивните вещества, отговорни за качеството и терапевтичния ефект на крайния продукт.
Литература
Cowan M (1999). Plant products as Antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews, October, 564-582.
Dimkov P, (1939). Handbook on Natural Healing and Living, Fakel Publishing House, Sofia Furst R, Zirrgiebel U, Totzke F, Zahler S, Vollmar A, Koch E (2010). The Crataegus extract WS 1442 inhibits balloon catheter-induced intimal hyperplasia in the rat carotid artery by directly influencing PDGFR-beta. Atherosclerosis 2: 409-417.
50
Grassman J (2005). Terpenoids as antioxidants. Vitam Horm, 72, 505-535.
Kandaswami C, Lee L, Lee P, Hwang J, Ke F, Huang Y, Lee M (2005). The antitumor activities of flavonoids, In Vivo, 19, 895-909.
Klinger W, Hirschelmann R, Süss J (1989). Birch sap and birch leaves extract: screening for antimicrobial, phagocytosis-influencing, antiphlogistic and antipyretic activity. Pharmazie, 44, 558-60.
Michel T, Pülschen D, Thome J (2012). The Role of Oxidative Stress in Depressive Disorders. Current Pharmaceutical Design 18: 5890-5899.
Nuengchamnong N, Hermans-Lokkerbol A, Ingkaninan K (2004). Separation and detection of the antioxidant flavonoids, rutin and quercetin, using HPLC coupled on-line with colorimetric detection of antioxidant activity. Naresuan University Journal, 12, 25-37.
Pereira D, Valentao P, Pereira J, Andrade P (2009). Phenolics: From Chemistry to Biology, Molecules, 14, 2202-2211.
Sharma A, Cardoso-Taketa A, García G, Villarreal M (2012). A systematic updated review of scientifically tested selected plants used for anxiety disorders. Botanics: Targets and Therapy 2: 21-39.
Smullen J, Koutsou G, Foster H, Zumbé A, Storey D (2007). The antibacterial activity of plant extracts containing polyphenols against Streptococcus mutans. Caries Res,41, 342-349.
Syrov V, Aizikov M, Kurmukov A (1975). Effect of ecdysterone on the content of protein, glycogen, and fat in white rat liver, heart and muscle. Doklady Akademii Nauk Uzbeckskoy SSR 8: 37-38.
Syrov V, Khushbaktova Z, Abzalova M, Sultanov M (1983). On the hypolipidemic and antiatherosclerotic action of phytoecdysteroids. Doklady Akademii Nauk Uzbeckskoy SSR 9: 4445.
Syrov V, Khushbaktova Z (2001).The pharmacokinetics of phytoecdysteroids and nerobol on animals with experimental toxic renal damage. Eksperimentalnaya I Klinicheskaya Farmakologiya 64: 56-58.
Tabach R, Mattei R, Carlini E (2009). Pharmacological evaluation of a phytotherapeutic product - CPV (dry extract of Crataegus oxyacantha L., Passiflora incarnata L. and Valeriana officinalis L.) in laboratory animals. Rev Bras Farmacogn 19: 255-260.
Takahashi H, Nishimoto K (1992). Antidiabetic agents containing ecdysterone or inokosterone. Jpn Kokai Tokkyo Koho J.P. 04,125,135 [92:124,135]. (Chemical Abstracts 117: 84874b).
Volodin V, Syrov V, Khushbaktova Z, Volodina S (2012). Stress-protective action of the ecdysteroid containing preparation Serpisten. Theoretical and Applied Ecology, 1: 18-24.
Webster D, Taschereau P, Belland R, Sand C, Rennie R (2008). Antifungal activity of medicinal plant extracts; preliminary screening studies. J Ethnopharmacol, 115, 140-146.
Williams R, Spencer J, Rice-Evans C (2004). Flavonoids: antioxidants or signalling molecules? Free Rad. Biol. Med., 36, 838 -849.
