CC BY
89
ПЧЕЛОВОДСТВО
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ПАСЕК
при инфицировании семей пчел РНК-содержащими вирус.
EPIDEMIOLOGICAL STATUS OF APIARIES BEE INFECTED RNA-CONTAINING VIRUSES
.145
A.E. Калашников, И.Г. Удина
ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН
A. Kalashnikov, I.Udina
Vavilov Institute of General Genetics
Аннотация
Инфицирование ретровирусами ведет к серьезным нарушения м, вплоть до коллапса семей медоносной пчелы Apis mellifera и к сокращению численности популяций. Диагностика инфицирования и состава вирусов пчел при помощи метода ПЦР, особенно в условиях скрытого течения инфекции, позволя ет предпринимать более эффективные меры для сохранения здоровых пчелиных семей на пасеках. Выявление смешанной (комбинированной) инфекции, особенно при одновременном поражении клещом Varroa destructor предполагает повышенный риск потери пчелиной семьи.
Summary
Retrovirus infection leads to serious breaches, until the collapse of honeybee colony and reduce populations of Apis mellifera. Diagnosis of virus infection by PCR, especially in the course of latent infection flow, allows to take more effective measures to maintain healthy bee colonies in apiaries. Identification of mixed (combined) infection, especially while defeat mite Varroa destructor suggests an increased risk of loss of the bee colony.
Медоносная п чела (Apis mellifera) я вл яется важной составляющей биоценозов в мировом производстве продуктов питания (миндаль, цитрусовые, ягоды, люцерна и др.) в качестве опы-лител я, а также производстве продуктов питани я и лечебных средств (мед, прополис и пр.) (Klatt B.K., et al, 2013). b последние годы увеличились ежегодные потери пчелиных семей при нарушении и. здоровья за счет паразитов (вирусы, бактерии, грибки, клещи) и изменений окружающей среды (гербициды, пес-
тициды, загрязнение другими химическими веществами, структура кормов, культивирование трансгенных растений). Широко распространилось явление коллапса пчелиной семьи (Colony Collapse Disorder -CCD) (Cornman R.S., et al, 2012). Хотя причина CCD остаетс неизвестной, пострадавшие колонии имеют большое количество болезнетворных микроорганизмов, в том числе и РНК-вирусов (Chen Y.P., Siede R. et al, 2007, Удина И.Г. и др., 2010, Калашников А.Е. и др., 2012).
Вирусные инфекции могут протекать б ессимптомно, вызывать деформации крыльев, паралич или смерть инфицированных особей (Siede R. et al, 2007). У некоторых отечественных пород существует высокий потенциал иммунитета пчел и устойчивость к заболева-ни м, например, у среднерусской породы - подвида темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera L. (Кривцов
Н.И., Кривцова Л.С., 2009).
В настоящее время известно несколько десятков вирусов, поражающих пчел. Среди них следует выделить шесть наиболее опасных, вызывающих необратимые клинические признаки заболевания, которые приводя т к гибели пчел и их колоний. Это РНК-со-держащие вирусы деформации крыла (deforming wing virus - DWV), вирус острого и хронического паралича (acute bee paralysis virus - ABPV и chronic bee paralysis virus - CBPV), Кашмирский вирус пчел (Kasmir bee virus - KBV), вирус мешотчатого расплода (sacbrood bee virus - SBV) и вирус черных маточников (black queen cell virus - BQCV). Все эти вирусы представлены вирионом, содержащим одну цепь геномной РНК.
Пчела с деформацией крыльев,пораженная вирусом DWV
Клещи УаггоаЬев^и^ог, при паразитировании на куколках и взрослых пчелах, служат как переносчиками этих вирусов, так и фактором, способствующим переходу вирусного заболевания из скрытой формы в открытую. Клещевая инфекци я приводит к общему снижению иммунитета пчел (Ыа221 Р. е! а1, 2012).
Вирус деформации крыла (DWV) практически всегда связан с поражением клещом V.destructor и приводит к изменению формы крыльев у новорожденных пчел, из-за чего пчелы не могут летать. В больных семьях и около них могут быть обнаружены мертвые куколки и молодые пчелы с измененными крыльями. Гибель чаще всего наблюдается осенью или зимой.
Вирус острого паралича (ABPV) - это болезнь взрослых п чел, вызывающая гибель п чел в течение н е-скольких дней, обычно в весенне-летний период.
Вирус хронического паралича (CBPV) поражает пчел в любое время года, но особенно летом при перегреве улья. Пчелы теряют ворсинки своего опушения, чернеют, ползают по земле под летком, наблюдается тремор конечностей и дрожание крыльев.
Пчелы,пораженные вирусом СЭРУ. (А) Стрелка указывает на почерневшую лысую черную пчелу, которая более темная по сравнению со здоровыми пчелами. (Б) Несколько погибших пчел за пределами улья (П1Ыиге М. е1 а1,2010)
Кашмирский вирус (KBV) по действию похожна вирус ABPV^ вызывает гибель личинок, куколок и взрослых пчел на всех стадиях развития пчелиной семьи.
Инфекция вирусом мешотчатого расплода (SBV) проявляется чаще всего весной и при холодной погоде, взрослые личинки погибают перед их запечатыванием, принимая форму мешочка и далее высыхая.
Вирус черных маточников (BQCV) по своему действию похож на SBV, но при этом поражает предкуко-лок и куколок маток, а затем взрослых пчел. Куколки прекращают свое развитие и погибают, приобретая черный цвет. Заболевание наиболее сильно развивается в зимне-весенний период.
Вирусные заболевания являются высоко контаге-нозными и распространяются, помимо переносчика клеща V. destructor, при контакте пчел, при инфицировании матки от нее к потомству, а также при работе с пчелами через инвентарь и продукты пчеловодства (Chen Y., et al, 2006).
Меры борьбы с заболеваниями, которые вызывают РНК-содержащие вирусы пчел, разработаны недостаточно хорошо, хотя существуют подобные методики для диагностики, например, лейкоза КРС (Удина И.Г. и др., 2005). Обычно проводят общие санитарные мероприятия (дезинфекцию сотов, ульев, инвентаря). Целесообразны любые меры, направленные на повышение иммунитета пчел, например, усиленное питание или использование биодобавок. Мед реализуют для пищевых целей без ограничений.
Нами изучено распространение РНК-со держащих вирусов на племенных пасеках и пасеках в условиях разведения в ряде регионов России. Проанализированы рабочие пчелы и образцы клещей из ульев, в которых наблюдали пестрый расплод, ослабление семей или наличие подмора в районе летка, или наличие варроатоза. Подобные исследования на территории России единичны.
Анализ распространения РНК-содержащих вирусов проведен нами в 2009-2013 гг. в следующих выборках рабочих пчел среднерусской породы: Удмуртия - Завьяловский район (N=27 - общее количество пчел), д. Люк (N=9), д. Постол (N=6), д. Кенер-вай (N=18) и п. Позимь Якшур-Бодьинского района (N=33), Селычкинское лесничество (N=15), Юкамен-ский район (N=15), Кизнерский район (N=6) иВавож-ский район (N=9); Тульская область (N=21); карники: Абхазия (N=15), Домодедовский район (Московская область) (N=12); карпатской породы: Ставропольский край (N=45), Майкопский район (Адыгея) (N=42), Истринский район (Московская область) (N=9).
Анализ распространения РНК-содержащих вирусов проведен в образцах клеща Varroadestructor в Удмуртии: д. Кенервай Якшур-Бодьинского района (N=10) и
*
1. Личинка в сотах,пораженная вирусом ББУ
2. Личинка,пораженная вирусом ББУ в видехарактерной С-формы
3. Личинка матки,пораженная вирусом БОСУ
(с рамки улья, N=10), д. Постол Завьяловского района (с личинки, N=10). Ранее результаты изучения РНК-содержащих вирусов пчел в Удмуртии описаны в публикации (Калашников А.Е. и др., 2013). Пчелы в Удмуртии были собраны сотрудниками Удмуртского НИИ животноводства Масленниковым И.В. и Колби-ной Л. В, остальные выборки предоставлены пчелово-дами-любител ями, выборки в Адыгее собраны Уди-ной И.Г., в Абхазии - Воронецким В.И. и в Тульской области - Королевым А. В.
В наших исследованиях РНК-содержащие вирусы пчел определены по модифицированному методу ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией, где в первом цикле ПЦР образуется матрица к ДНК с вирусной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы) (Berenyi O. et al, 1996, Chen Y.P. et al, 2006, MirandaJ.R. et al, 2010, Удина И.Г. и др., 2010).
При помощи ОТ-ПЦР в выборках попул яций пчел среднерусской породы (на территории Удмуртии, Ставропольского края, Московской, Тульской области), карпатской породы (Адыгея и Московская область) и карники (Абхазия) вы я влено присутствие РНК-содер-жащих вирусов DWV, SBV, BQCV, KBV, APBV и CBPV. Наиболее часто обнаружены DWV (средня я частота в семьях пчел 50%) и SBV (48%), с меньшей частотой отмечены вирусы ABPV (16%), BQCV (13%), CBPV (12%) и KBV (9,6%). В Кизнерском районе Удмуртской республики на одной из пасек вирусы не были обнаружены. В Домодедовском районе Московской области был обнаружен только вирус DWV.
Установлена инфекция пчел одновременно двумя вирусами (в среднем от 33,9%) и более двух (вплоть до шести одновременно!) (от 21,2%). Наиболее часто встречалс вариант 2-х, затем 5-ти и 3-х-кратно-го инфицировани я, реже встречался 4-х и 6-кратное. Из множественных инфекций наиболее часто встречается комбинация вирусов DWV-ABPV-CBPV-SBV-BQCV (8,3%), а также комбинации DWV-APBV-KBV и APBV-CBPV-SBV (до 14,2% каждая). В некоторых случаях вирусная инфекция обнаружена у пчел без внешних признаков заболевани я, что свидетельствует о том, что отсутствие клинических признаков заболева-ни не исключает инфицировани . Вспышки болезни могут возникнуть при любых неблагопри ятных дл я пчелиной семьи услови ях, которые приводят к снижению иммунитета. Множественная инфекци я, особенно при одновременном поражении V.destructor, приводит к гибели пчелиных семей (Berenyi O. et al, 1996, MirandaJ.R. et al, 2010 и Chen Y.P. et al, 2006).
Нами вы я влено присутствие РНК-содержащих вирусов (DWV, ABPV) в клещах Varroadestructor, что подтверждает возможность переноса ими вирусов пчел (Chen Y.P. et al, 2006).
Схема отбора образцов пчел
Ставропольский край
Майкопский район
ABPV DWV ICBPV IKBV I SBV BQCV
Тульская область
Абхазия
і ABPV DWV ICBPV I KBV ■ SBV BQCV
Московская область, Истринский район
Удмуртия
в ABPV DWV ■ CBPV 3KBV ISBV BQCV
IABPV DWV ■ CBPV ! KBV ISBV BQCV
Схема распространенности РНК-содержащих вирусов в России в 2010-2013 гг. В диаграммах указана доля встречаемости от общего количества инфицированных семей (сбор пчел для анализа проводили путем изъятия образцов из пораженным или подозрительным ульев с замором пчел под летком)
При сопоставлении полученных нами нуклеотидных последовательностей РНК-содержащих вирусов пчел DWV (GQ422786, JX993278, KC138854, KC138852, KF274666), SBV (KC020673, KC020674, KF274667, KF274668) и BQCV (KC138853) из отечественных популяций пчел с последовательностями, ранее зарегистрированными в Genbank, установлена высокая степень их идентичности (не менее 85%).
Выводы
Для предотвращения распространения вирусных заболеваний необходимо проводить ДНК-диагности-ку РНК-содержащих вирусов пчел (DWV, SBV, BQCV, KBV, APBV и CBPV). Важно внедрять ПЦР-диагности-ку вирусных заболеваний пчел на пасеках и в племенных хозяйствах на территории России и СНГ, а также для всех ввозимых пчелосемей с территории Европы и Азиатского региона.
В России практика молекулярной диагностики для инфекций пчел применяется недостаточно эффективно и мало распространена, в основном отдается предпочтение пассивному сбору статистики при клиническом проявлении заболеваний пчел без идентификации возбудителей, что может привести к чрезвычайно широкому распространению опасных вирусных инфекций и к угрозе выживания медоносной пчелы.
Литература
1. Калашников А.Е. , Масленников И.В., Колбина Л.М., Удина И.Г. Генетическая дифференциация популяций медоносных пчел (Apis mellifera L.) и распространение РНК-содержащих вирусов на фоне эпизоотии клеща Varroa destructor на территории Удмуртии // Сельскохозяйственная биология. - 2013; №4. - С.88-92.
2. Кривцов Н.И. , Кривцова Л.С. Генетические предпосылки устойчивости пчел к болезням // Пчеловодство. - 2009; №3. - С.5-7.
3. Удина И.Г. , Кунижева С.С. , Гришечкин А.Е., Калашников А.Е. , Учаева В.С. , Кривцов Н.И. , Злобин В.И.
Обнаружение вируса деформации крыла у медоносной пчелы Apis mellifera L. на пасеках в Московской области методом ОТ-ПЦР // Вопросы вирусологии. -2010; - №5. - С.37-40.
4. Удина И.Г. , Фалынскова И.Н. , Трухин А.С. Применение метода полимеразной цепной реакции для диагностики инфицированности крупного рогатого скота вирусом лейкоза // Сельскохозяйственная биология. -2005; №4. - С.122-125.
5. Berenyi O. , Bakonyi N. , Derakhshifar I., Koglberger
H. , Nowotny N. Occurrence of six honeybee viruses in diseased Austrian apiaries // Appl Envir Microbiology. -2006; №.4. - P.2414-2420.
6. Chen Y.P., Pettis J.S., Collins A., Feldaufer F. Prevalence and Transmission of Honeybee Viruses // Appl Envir Microbiology. - 2006; №1. - P.606-611.
7. Chen Y.P. , Siede R. Honey bee viruses // Adv Vir Research. - 2007; - P.33-80.
8. Chen Y. , Evans J. , Feldlaufer M. Horizontal and vertical transmission of viruses in the honey bee Apis mellifera // J Invertebr Pathology. - 2006; №3. - P.152-159.
9. Cornman R.S. , Tarpy D.R. , Chen Y. , Jeffreys L. , Lopez D. , Pettis J.S. , van Engelsdorp D. , Evans J.D. Pathogen webs in collapsing honey bee colonies // PLoS. - 2012; №8. - P.43562.
10. DeMiranda J.R., Genersch E. Deformed wing virus// J Intertebr Patology. - 2010; №1. - P.48-61.
11. Klatt B.K., Holzschuh A., Westphal C.,Clough Y. , Smit
I., Pawelzik E., Tscharntke T. Bee pollination improves crop quality, shelf life and commercial value // Proc Biol Sci. - 2013; - Р. 281(1775).
12. Nazzi F. , Brown S.P. , Annoscia D. , Piccolo F.D. , Prisco G.D., Varrichio P., Vedora G.D., Cattonaro F., Caprio E., Pennachio F. Synergetic parasite-pathogen interactions mediated by host immunity can drive the collapse of honeybee colonies // PLOS Pathogens. - 2012; №6. -P. 1002735.
13. Ribiиre M. , Olivier V. , Blanchard P. Chronic bee paralysis: A disease and a virus like no other // Journal of Invertebrate Pathology. - 2010; January. - P .S120-S131.
