CC BY
79
УДК 91,5:612,014,463:597,442:591,111/428,4
Л. С. Краюшкина, А. В. Вьюшина, А. А. Герасимов, О. Г. Семенова, М. Н. Терехин
эндокринологические аспекты осмотической и ионной регуляции У осетровых (на примере севрюги ACIPENSER STELLATUS PALLAs. СЕМ. AdPENsERIDAE)
Введение
В развитии ихтиологических исследований на кафедре ихтиологии и гидробиологии существенное значение имело использование в научных работах принципов экологической гистофизиологии — направления эволюционной морфологии, разработанных в 50-60-х годах XX в . профессором кафедры Николаем Львовичем Гербильским . Задачей этого направления является выяснение роли клеточных и тканевых структур в жизненном цикле особи, что лежит в основе анализа реализации филогенетических адаптаций и эволюционной динамики структур в онтогенезе [4, 5]. При использовании принципов этого направления коллективом кафедры (преподавателями, студентами, научными сотрудниками) были проведены исследования функциональных основ следующих процессов: миграций рыб; адаптаций, связанных с размножением; адаптаций, способствующих экологическому разнообразию вида; пластичности вида и популяций; а также исследования закономерностей расширения степени эврибионтности рыб в ходе онтогенеза в результате морфофункционального становления систем органов
В рамках последнего из перечисленных разделов исследований в то время были изучены процессы возрастания степени эвригалинности личинок и молоди осетровых по мере развития жаберного эпителия и вступления в функциональное состояние ион-транспортирующих (хлоридных) клеток Кейза-Виллмера. Тогда впервые были описаны эти клетки у осетровых (русский осетр Acipenser gueldenstaedtii Brandt) и показана сопряженность динамики осмолярности сыворотки крови с морфофункциональными изменениями хондриома хлоридных клеток в период адаптации молоди к гиперосмотиче-ской (морской) среде [6, 7, 22] Позднее были выявлены особенности функционирования осморегуляторной системы молоди экологически различных видов осетровых на ранних этапах их постэмбриогенеза на основании изучения динамики осмолярности сыворотки крови и сопряженных с этой динамикой морфофункциональных изменений ряда органов, участвующих в данном процессе [10, 11, 13, 14]. В дальнейшем исследования осморе-гуляторной и ионорегуляторной систем осетровых, как и многие работы, начатые под руководством Н л Гербильского, получили углубленное развитие и стали одним из направлений научных работ на кафедре При комплексном методе исследования были изучены особенности осмотической и ионной регуляции у физиологически и морфологически сформированных неполовозрелых особей семи экологически различных видов осетровых, в различной степени связанных с морскими условиями: пресноводные, с олоноватоводные диадромные и морские диадромные виды [8, 12]. В результате проведенных работ были
© Л . С . Краюшкина, А. В . Вьюшина, А. А. Герасимов, О . Г. Семенова, М . Н . Терехин, 2009
выявлены отличительные черты осморгуляторной и ионорегуляторной систем осетровых по сравнению с хорошо изученными в этом отношении костистыми Вместе с тем анализ этих исследований дал представление как об эволюции механизмов осмотической и ионной регуляции в филогенезе осетровых, пресноводных по своему происхождению, но освоивших в ходе своей истории различные по солености водоемы, так и о функциональных основах перехода некоторых видов к проходному образу жизни [9, 36].
В раскрытии особенностей механизмов осмотического гомеостаза у экологически различных видов осетровых, на наш взгляд, большое значение имеет исследование функциональных изменений в ответ на солевое воздействие тех органов, которые принимают участие в осмо- и ионорегуляции В рамках указанной проблемы, в настоящей статье представлены результаты исследования нейроэндокринных, эндокринных и эффекторных органов эвригалинного вида осетровых — севрюги в процессе ее адаптации к морской воде цель данной статьи — анализ работы комплекса функционально связанных органов, осуществляющих основную нагрузку при адаптации рыб к гиперосмотической среде: «гипоталамус (преоптическое и туберальное ядра) ^ гипофиз (адренокортикотропные клетки) ^ адреналовая железа и динамика кортизола ^ эффекторные органы (жабры, почки) и динамика Na+/K+ АТФазы» . Работа отражает результаты длительной программы исследования
обзор литературы
Процессы регуляции водно-солевого обмена со стороны нейроэндокринных и эндокринных органов наиболее изучены в настоящее время у костистых [сводки: 43, 34, 30, 32, 51, 25, 49]. Эти процессы у осетровых исследованы значительно в меньшей степени и касаются только отдельных сторон их водно-солевого обмена
В гипоталамической области мозга, которая является центром интеграции вегетативного отдела нервной и эндокринной систем, нас, прежде всего, интересовала реакция на солевое воздействие преоптического ядра (Nucleus praeopticus), в котором у костистых нонапептидэргическими клетками синтезируется гормон аргинин-вазотоцин (АВТ), близкий к аргинин-вазопрессину млекопитающих, и окситоциноподобный гормон . АВТ, являясь гормоном широкого действия, в регуляции водно-солевого обмена опосредованно влияет на уровень экскреторной функции хлоридных клеток жабр и уровень диуреза в почках через изменение кровоснабжения этих органов [25]. У костистых в ответ на острое гиперосмотическое воздействие (при переводе рыб из пресной воды в морскую) увеличивается секреторная активность нейросекреторных клеток (HGK) и происходит выведение нейросекреторных гранул (НсГ) в аксоны [33]. Уровень циркулирующего АВТ значительно повышается [50]. У костистых кортикотропин-рилизинг гормон, вырабатываемый в области преоптического и латерального ядер (у осетровых латеральное ядро отсутствует), стимулирует секрецию адренокортикотропного гормона (АЕГГ) тропными клетками гипофиза . Мишенью АЕТГ является интерреналовая железа, вырабатывающая стероидные гормоны, имеющие важное значение в осуществлении адаптивных реакций организма. Один из гормонов адреналовой железы — кортизол играет важную роль во многих жизненных процессах рыб, но является доминирующим гормоном при адаптации рыб к морской воде [25, 32]. Хортизол влияет главным образом на активацию ионной помпы и увеличение мембранной проницаемости для ионов и воды . Действие этого гормона продемонстрировано для всех осморегуляторных органов: жабр, почек, кишечника и мочевого пузыря . Мишенью кортизола является
Na+/K+ АТФаза, которая ответственна за транспорт одновалентных ионов . В морской воде кортизол поднимает в жабрах активность этого фермента [39], локализованного преимущественно в хлоридных клетках [35], и увеличивает выход Na+ в жабрах [29, 42] Высокая активность этого фермента в почках, напротив, наблюдается у рыб, находящихся в пресной воде, в связи с усиленной сорбцией одновалентных ионов в проксимальном отделе нефрона
При анализе роли гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы (ГГНС) в осмотической регуляции у осетровых выявлены морфофункциональные изменения НСК преоптического ядра в ответ на солевое воздействие [17, 24], а также показана сопряженность этих изменений с динамикой осмолярности сыворотки крови в процессе адаптации молоди белуги к гиперосмотической среде [11]. В этих работах изучение ГГНС было проведено при использовании методики Гомори-Габа для неспецифического окрашивания нейропептидных гормонов гипоталамуса. Использование иммуногистохимических методик расширило представление о структуре преоптического ядра осетровых [20] . Однако иммуноцитохимическое изучение реакции гипоталамо-гипофизарной системы на солевое воздействие у осетровых нами было проведено впервые . Функциональные изменения адренокортикотропных клеток гипофиза у костистых рыб прослежены по морфометрическим параметрам [28, 41, 44]. Нами впервые была использована иммуноцитохимическая методика для количественной оценки секреторной активности АКТГ-ИП клеток гипофиза у осетровых в ответ на солевое воздействие [16].
Материал и методы исследования
Анализ морфофункциональных изменений комплекса взаимосвязанных органов изучали у неполовозрелых особей севрюги Acipenser stellatus Pallas (в возрасте 2+, длиной 45,5 ± 1,2 см, массой 175,2 ± 11,4 г) в процессе ее адаптации к искусственной морской воде соленостью 12,5 %о, по составу и соотношению солей близкой к морской воде средней солености Каспийского моря [2] . В отдельных опытах использовали молодь севрюги в возрасте 1,5 года (длиной 27,2 ± 0,5 см, массой 50,5 ± 2,4 г) при ее адаптации к искусственной морской воде соленостью 14,6 % . Рыб переводили из пресной воды в морскую воду и через различные интервалы времени (через 1, 12, 24, 72, 120, 168 ч после перевода) производили различные пробы для анализа Сыворотка крови была взята для определения ее осмолярности и определения в ней концентрации кортизола Пробы жабр и почек замораживали при температуре -20 °С для дальнейшего определения активности фермента Na+/K+ АТФазы в гомогенатах этих органов . Мозг (гипоталамическая область с гипофизом) фиксировали в жидкости Буэна для дальнейшего проведения иммуноцито-химических реакций на гистологических срезах этих органов с целью выявления локализации нейрофизин- и АКТГ-ИП структур . Поскольку нейрогормоны преоптического ядра продуцируются в комплексе с нейрофизином — белком-носителем [45], то выявление нейрофизина в структурах ГГНС позволяет их идентифицировать и рассматривать как причастных к нейрогормональной регуляции Почку вместе с интерреналовыми тельцами фиксировали в жидкости Буэна для анализа морфофизиологических изменений этих органов . Жабры фиксировали в смеси 2%-ного раствора глутаральдегида и 0,1%-ного раствора параформальдегида на фосфатном буфере с последующей дофиксацией в 1%-ном растворе четырехокиси осмия для исследования ультраструктуры хлоридных клеток. Для определения активности АКТГ-ИП клеток гипофиза иммуноцитохимическим методом фиксировали гипофизы в смеси 2%-ного раствора параформальдегида и 0,2%-ного
раствора глутаральдегида в фосфатном буфере в течение 2 ч при 4 °с . Затем образцы были постфиксированы в 4 %-ном растворе параформальдегида .
Оценку характера осмотической регуляции рыб проводили по динамике осмолярно-сти сыворотки крови, определяемой криоскопическим методом с помощью миллиосмометра МТ-2 (НПП «Буревестник», санкт-Петербург) . Гистологические срезы интерреналовой железы и почек для изучения морфофункциональных изменений их структур приготовляли по обычной методике [19] . Использованные параметры указаны в таблицах 2 и 4 соответственно степень вакуолизации клеток интерреналовой железы определяли по изменению площади вакуолей в клетке, образующихся на месте липофильных предшественников стероидных гормонов после примененного метода гистологической обработки. Площадь вакуолей определяли на установке «система анализа изображения» с использованием специальной компьютерной программы (IM-AN, Медицинская академия в Познани, Польша) . Изучение транспортной функции почки проводили по уровню клубочковой фильтрации, который определяли традиционным инулиновым методом [1] содержание кортизола в сыворотке крови определяли с помощью процедуры энзимосвязывающего иммуносорбционного анализа (ELISA) при использовании коммерческого набора реактивов производства «Алкор-био» (санкт-Петербург), приготовленных для осетровых [47] . Активность Na+/K+ АТФазы в гомогенатах жабр и почек была определена по общепринятой методике [52] . Для выявления локализации нейрофизин-ИП структур в гипоталамусе и АЮГ-ИП клеток в гипоталамусе и в гипофизе на парафиновых и полутонких срезах этих частей мозга проводили иммуногистохимические реакции с применением пероксидаза-антипероксидазного метода [48] . Для выявления локализации нейрофизин-ИП структур на толстых (50ц) срезах мозга, приготовленных с помощью вибротома, использовали немеченые поликлональные антитела кролика, выработанные против нейрофизина козы
Для выявления локализации АНТГ-ИП клеток использовали немеченые поликлональные антитела кролика, выработанные против синтетического АЮГ^ человека (Dako, Дания), т. е . против активной (Ы)-терминальной части гормона, которая является абсолютно идентичной по аминокислотной последовательности подобному сегменту у всех позвоночных [27], в том числе и осетровых [40]. Для электронно-микроскопического изучения секреторной активности АСТГ-ИП клеток фиксированные гипофизы были дегидратированы при прогрессивном понижении температуры и заключены в ловикрил K 4 М [26]. Иммуно-цитологические реакции были проведены по протеин А-голд технике [46] с использованием также антител против синтетического AKIT^ человека на ультратонких срезах, которые затем были исследованы под электронным микроскопом «Zeis-EM 900» специфичность реакции поликлональной антисыворотки кролика, выработанной против нейрофизина козы и против синтетического АЮГ^ человека, оценивали путем сопоставления окраски (или количества голд-меток) соседних срезов, обработанных с помощью антисыворотки или без нее (контроль) . Подсчет голд-меток, включенных в АНТГ-ИП клетки гипофиза, проводили на условной площади фотоснимков (размером 6 х 6 см), сделанных при просмотре ультрасрезов под электронным микроскопом при увеличении в 7000 раз
результаты исследования
Динамика осмолярности сыворотки крови. Изменения осмолярности сыворотки крови в процессе адаптации севрюги к морской воде свидетельствуют о том, что севрюга способна поддерживать относительное постоянство осмолярности внутренней среды при изменении солености окружающей воды (табл 1)
Таблица І
изменения осмолярности сыворотки крови и содержания голд-меток в АКТГ-иП клетках проаденогипофиза в процессе адаптации севрюги к морской воде соленостью 12,5 %о (403 осм/л)
Продолжительно сть адаптации, час n Осмолярность, мосм/л Kоличество голд-меток
В пресной воде 4 242,2 ± 2,9 269,5 ± 13,1 (8)
В морской воде: 1 3 253,3 ± 0,8* 93,0 ± 6,6^* (7)
12 3 264,7 ± 3,0 -
24 4 281,7 ± 2,7 -
72 3 334,0 ± 3,3 -
120 4 315,5 ± 6,3** -
168 4 259,2 ± 1,3*** 40,7 ± 4,5^** (8)
Примечание, п — количество рыб; в скобках — количество просмотренных ультрасрезов; *р < 0,01 — по сравнению с контролем; ** р < 0,05 — по сравнению с уровнем через 72 ч; *** р < 0,001 — по сравнению с уровнем через 120 ч; **р < 0,001 — по сравнению с контролем; ***р < 0,001 — по сравнению с количеством через 1 ч ,
Гипоталамус. Нейрофизин (НФ)-иммунореактивность в ГГНс у молоди, находящейся в пресной воде, была выявлена в НсН! преоптического ядра Nucleus praeopticus, нейросекреторных фибриллах, median eminence и корнях нейрогипофиза (НГ) (рис . 1) .
Рис. І. Нейрофизин-иммунореактивность в гипоталамо-гипофизарной области мозга молоди
севрюги, обитающей в пресной воде сагиттальный срез мозга, толщина среза 50ц. Ок. 10, об . 40 . Np — Nucleus praeopticus, Nt — Nucleus tuberis,
Me — median eminence, НГ — нейрогипофиз .
Преоптическое ядро представлено двумя группами клеток, расположенными в латеральной стенке третьего желудочка Большинство НФ-ИП клеток биполярны, редко мультиполярны Цитоплазма НФ-ИП клеток у рыб из пресной воды содержат массу НФ-ИП гранул . Аксоны этих клеток большей частью имеют спиралевидную форму (рис . 2, А) . Большинство НФ-ИП фибрилл простираются от преоптического ядра в каудальном направлении и после зоны хиазмы концентрируются, образуя нейросекреторный тракт, направляющийся к гипофизу. Часть НФ-ИП фибрилл преоптического ядра оканчивается в зоне median eminence, переднем нейрогемальном районе ГГНС, образуя аксовазальный контакт. В этой области обнаруживается значительное скопление НФ-ИП гранул . Через 1 ч после перевода рыб в морскую воду перикарионы НФ-ИП НСК уменьшаются в размерах, а аксоны этих клеток утолщаются, почти выпрямляются и становятся видимыми на протяжении значительной части своей длины вследствие перехода части НФ-ИП гранул из перикарионов в аксоны (рис . 2, Б) . Значительная концентрация НФ-ИП гранул выявляется в зоне median eminence На контрольных срезах, не подвергнутых воздействию первичных антител, НФ-ИП-иммунореактивность на срезах мозга отсутствовала.
При использовании пероксидазного-антипероксидазного иммуноцитохимиче-ского метода [48] были обнаружены АКТГ-ИП клетки на значительном протяжении
Рис. 2. Нейрофизин-иммунопозитивные клетки преоптического ядра гипоталамуса у молоди севрюги А — из пресной воды, Б — через 1 ч после перевода рыб в морскую воду соленостью 14,6 %о Фронтальный срез мозга, толщина среза 50 ц. Ок. 10, об , 90 ,
туберального ядра (Nucleus tuberis), а не только в проаденогипофизе (rostral pars dista-lis) и в метааденогипофизе (pars intermedia) [15]. Эти клетки не образуют компактного скопления, а довольно рыхло располагаются среди клеток эпендимы, выстилающей инфундибулярную бухту. Большая часть АКТГ-ИП клеток туберального ядра биполярны (иногда мультиполярны) . Дендриты клеток подходят к полости инфундибулярной бухты, образуя дендровентрикулярные контакты . Аксоны этих клеток у рыб, адаптированных к пресной воде, часто имеют извилистую (спиралеобразную) форму. Скопления АКТГ-ИП гранул наблюдаются вблизи проксимальной нейросекреторной контактной области (median eminence) .
У молоди севрюги, исследованной через 1 ч после перевода ее в морскую среду из пресной, выявляется большое количество тонких АКТГ-ИП фибрилл, пронизывающих область туберального ядра, и скопление АКтГ-ИП гранул в области median eminence Дендриты АКТГ-ИП клеток хорошо выражены . Аксоны этих клеток имеют выпрямленную форму и просматриваются на значительном своем протяжении (рис . 3) . Создается представление о перераспределении иммунореактивного АКТГ из перикарионов в аксоны
Адренокортикотропные клетки гипофиза. При обитании севрюги в пресной воде АКТГ-ИП клетки проаденогипофиза содержат наибольшее количество голд-меток (см . табл . 1), что связано с преобладанием синтеза гормона и накопительной функцией клеток над его выведением в это время, поскольку в пресноводных условиях АКТГ не востребован организмом в полной мере . Через 1 ч после перевода рыб в морскую воду количество
Рис. 3. АКТГ-ИП клетки туберального ядра гипоталамуса через 1 ч после перевода молоди севрюги
в морскую воду соленостью 14,6 %0 Сагиттальный срез мозга, толщина среза 50 ц. Ок. 10, об . 90 .
голд-меток снижается в 3,8 раза, что свидетельствует о значительном выведении АКТГ из адренокортикотропоцитов (см . табл . 1) . Через 168 ч адаптации севрюги к морской воде, когда рыбы перешли на гипоосмотический тип регуляции и поддерживается относительное постоянство осмолярности сыворотки крови, количество голд-меток в АКТГ-ИП клетках проаденогипофиза остается ниже, чем у рыб через 1 ч солевого воздействия (см . табл . 1) . Это свидетельствует о преобладании процесса выведения АКТГ из этих клеток над уровнем синтеза гормона в тропоцитах в течение рассматриваемого периода адаптации рыб к морской воде . Во всех вариантах данного опыта на контрольных ультрасрезах гипофиза голд-метки отсутствовали. Интенсивное выведение АКТГ из тропоцитов через 1ч солевого воздействия совпадает с выведением НФ-ИП гранул в аксоны клеток преоптического ядра гипоталамуса
Морфофункциональные изменения интерреналовой железы. Интерреналовая железа молоди севрюги представлена компактными тремя-четырьмя тельцами, расположенными в почечной ткани. На гистологических срезах такого тельца составляющие его клетки располагаются мозаично и не имеют какой-либо определенной ориентации У рыб, адаптированных к пресной воде, средняя площадь клеток интерреналовой железы составляет 229,5 ± 5,6 мкм2, средний объем ядер клеток — 124,7 ± 0,9 мкм3, средняя площадь липофильных вакуолей — 120,0 ± 3,2 мкм2 (52,3 % площади клетки) (табл. 2) . через 1 ч после перевода молоди севрюги в морскую воду из пресной воды размер ядер клеток и площадь вакуолей в клетках увеличиваются (р < 0,05), что свидетельствует о повышении синтетической активности клеток и накоплении предшественников гормонов в железе . При этом площадь самих клеток имеет лишь тенденцию к увеличению (р > 0,05) . Через 24 ч опыта интерреналовая железа сохраняет повышенную синтетическую активность, что подтверждается более высоким (р < 0,01), чем у контрольных рыб, объемом ядер и сохранением прежней площади вакуолей в клетках (по сравнению с предыдущим состоянием) . Через 72 ч опыта происходит снижение синтетической активности железы, в связи с чем объем ядер клеток становится ниже значения этого параметра у контрольных рыб в это время в железе начинается процесс выведения из нее гормонов, о чем свидетельствует тенденция к снижению площади вакуолей в клетках . Это снижение проявляется
Таблица 2
Изменение объема ядер, площадей клеток и вакуолей в клетках интерреналовой железы молоди севрюги Acipenser stellatus Pallas при адаптации к гиперосмотической среде соленостью 14,6 %о
Продолжительно сть адаптации, час n средний объем ядер, мкм3 средняя площадь клеток, мкм2 средняя площадь вакуолей в 1 клетке, мкм2
Юэнтроль (в пресной воде) 4 124,7 ± 0,9 229,5 ± 5,6 120,0 ± 3,2
1 3 136,8 ± 1,5* 235,8 ± 9,5 134,6 ± 5,1*
24 3 128,5 ± 1,2*, ** 205,4 ± 6,0*, ** 134,9 ± 5,4*
72 3 119,2 ± 1,3*, ** 205,1 ± 5,5*, ** 126,4 ± 6,6
216 4 123,7 ± 1,9 192,2 ± 8,2*, ** 117,5 ± 4,8#*
Примечание. п — количество рыб в опыте; *р < 0,05 — по сравнению с контролем; **р < 0,05 — по сравнению с опытом через 1 ч; ** р < 0,05 — по сравнению опытом через 24 ч .
как достоверное (р < 0,05) через 216 ч опыта (по сравнению с величиной этого параметра у рыб через 24 ч) При этом достигнутый уровень не отличается достоверно (р > 0,05) от аналогичного параметра у контрольных рыб Процесс сокращения площади вакуолей сопряжен с тенденцией сокращения площади клеток, начавшегося через 24 ч опыта К концу опыта (через 216 ч) площадь клеток железы становится меньше, чем у контрольных рыб, тогда как средний объем ядер клеток становится таким же, как у рыб в пресной воде . Можно сделать заключение, что к концу опыта железа возвращается к умеренно активному состоянию, сходному с состоянием у рыб в контроле
Концентрация кортизола. При содержании севрюги в пресной воде концентрация кортизола в сыворотке крови составляет 16,89 ± 5,68 нг/мл . При адаптации рыб к морской воде изменения содержания кортизола в течение всего опыта оказались несущественными (табл . 3) . Можно отметить лишь тенденцию к уменьшению содержания кортизола через 12 ч опыта, что может быть связано с использованием гормона в период перехода рыб к гипоосмотической регуляции . В целом данные свидетельствуют о наличии у севрюги координации между процессами биосинтеза и утилизации гормона
Таблица 3
Концентрация кортизола (нг/мл) в сыворотке крови и активность №+/К+ АТФазы (цмоль Р, /ч/мг белка) в гомогенатах жабр и почек молоди севрюги в процессе адаптации
к гиперосмотической среде 12,5 %о
Продолжительность адаптации, час Концентрация кортизола Активность №+/К+ АТФазы
жабры почки
Контроль (в пресной воде) 16,89 ± 5,68 (8) 3,0 ± 1,0 (6) 9,0 ± 2,0 (4)
В морской воде 12 ч 12,76 ± 1,94 (5) 9,0 ± 1,5** (4) 3,0 ± 1,5* (4)
В морской воде 168 ч 17,04 ± 4,19 (5) 39,0 ± 7,0*** (6) 0,9 ± 0,4 (5)**
Примечание. В скобках указано количество рыб в опыте; *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001 — по сравнению с контролем
Активность Па+К+ АТФазы. У рыб в пресной воде активность энзима в почках была выше (р < 0,05), чем в жабрах . У рыб в морской воде активность фермента в жабрах увеличивается в 3 раза через 12 ч и в 11 раз через 7 суток адаптации, тогда как в почках она уменьшается в 3 и 10 раз соответственно . В конце опыта энзимная активность в жабрах была в 40 раз выше (р < 0,001), чем в почках (см. табл . 3) .
Ультраструктура хлоридных клеток жаберного эпителия молоди севрюги, содержащейся в пресной воде (контроль). Хлоридные клетки севрюги из пресной воды оптически более светлые, по сравнению с другими клетками жаберного эпителия, в результате низкой плотности органоидов в цитоплазме . Ядро овальной формы расположено в базальной части или ближе к центру клетки. В хлоридных клетках митохондрии с плотно расположенными кристами распределены в цитоплазме неравномерно Как правило, они сосредоточены в основном в апикальной части клетки, тогда как в базальной и перинуклеарной зонах они немногочисленны (рис . 4, А) . Митохондрии не имеют какой-либо определенной ориентации относительно продольной оси клетки (поэтому на срезах клетки они имеют различную форму) . Трубочки гладкого эндоплазматического ретикулума (э . р . ) большей частью неплотно примыкают к митохондриям . В цитоплазме хлоридных клеток также можно наблюдать небольшие фрагменты шероховатого э . р . , а также многочисленные свободные рибосомы (рис . 4, Б) .
Рис. 4. Ультраструктура хлоридной клетки молоди севрюги, обитающей в пресной воде А — ув . 4400; бар 1,7 ц; Б — центральная зона этой же клетки, ув . 30000; бар 0,25 ц; АЧ — апикальная часть клетки; М — митохондрии, ЭПР — гладкий эндоплазматический ретикулум, ШЭР — шероховатый эндоплазматический
ретикулум, Р — свободные рибосомы, Я — ядро .
Ультраструктура хлоридных клеток молоди севрюги, адаптированной к морской воде, свидетельствует о том, что эти клетки имеют высокую функциональную активность, на что указывает ряд особенностей их морфологии . Хлоридные клетки становятся оптически более плотными в результате увеличения в них органоидов, в основном митохондрий и трубочек гладкого и шероховатого э . р . Митохондрии приобретают ориентацию преимущественно параллельно продольной оси клетки, в результате чего становится видимой их удлиненная форма хорошо развитые пластинчатые кристы упакованы в митохондриях более плотно, чем у рыб из пресной воды . Трубочки гладкого э . р . располагаются очень близко от митохондрий, часто прилегая к поверхности митохондрий и повторяя их очертания (рис . 5, А) . Количество свободных рибосом в цитоплазме по сравнению с контролем заметно увеличивается. По всему объему цитоплазмы появляются мелкие вакуоли, а в апикальной зоне клетки наблюдается их плотное скопление, что является характерной чертой экскреторного состояния клетки. Апикальная поверхность клеток приобретает вогнутый характер и несет микровиллы (рис . 5, Б) .
Почка. При адаптации севрюги к морской воде в почках происходят морфофункциональные изменения, направленные, с одной стороны, на сохранение воды в организме, и, с другой — на выведение избытка ионов из организма. У рыб в морской воде размеры капиллярных клубочков (гломерул), через которые происходит ультрафильтрация плазмы крови с образованием первичной мочи, уменьшаются, вследствие чего происходит сокращение клубочковой фильтрации и объема выводимой мочи (см . табл . 4) . Соотношение и/Ріп свидетельствует о том, что объем жидкости, проходящий через почечные канальца, уменьшается (вследствие реабсорбции воды) у рыб в морской воде больше (в 8,1 раза), чем у рыб в пресной воде (в 2,5 раза) . Во всех сегментах наблюдается снижение высоты эпителия и увеличение просветов канальцев, что можно связать с изменением направленности ионных транспортных процессов (табл 4)
Рис. 5. Ультраструктура хлоридной клетки молоди севрюги, адаптированной к морской воде
соленостью 12,5 %о
А — центральная зона клетки, ув . 20000; бар 0,4 ц (обозначения, как на рис . 4, Б); Б — апикальная зона клетки, ув 12 600; бар 0,6 ц; МВ — микровиллы, МП — микропузырьки
Таблица 4
Изменение физиологических и морфологических параметров почек при адаптации севрюги к морской воде соленостью 12,5 %о
Параметры В пресной воде (контроль) В морской воде
Клубочковая фильтрация, мл/ч/100 г веса 2,79 ± 0,61 (8) 1,13 ± 0,28* (6)
Соотношение и/Р(11 2,53 ± 0,61 (8) 8,06 ± 1,67** (6)
Диурез, мл/ч/100 г веса 1,05 ± 0,09 (8) 0,17 ± 0,04*** (6)
Диаметр гломерул, ^ 118,4 ± 6,2 (27) 88,1 ± 5,3 *** (35)
I проксимальный сегмент: диаметр просвета, ^ высота эпителия, ^ 14,8 ± 1,1 (45) 20,6 ± 0,8 (45) 20,7 ± 1,3*** (44) 16,2 ± 0,6 *** (44)
II проксимальный сегмент: диаметр просвета, ^ высота эпителия, ^ 18,7 ± 1,4 (34) 16,5 ± 1,1 (34) 22,9 ± 1,0* (41) 13,7 ± 0,4* (41)
Дистальный сегмент: диаметр просвета, ^ высота эпителия, ^ 13,1 ± 0,6 (55) 12,7 ± 0,8 (55) 25,5 ± 2,1 (57) 10,8 ± 0,4* (57)
Примечание. В скобках указано для физиологических параметров — количество особей в опыте, для морфологических параметров — число измерений у четырех особей в каждом варианте . и/Р^ — отношение содержания инулина в моче (и) и сыворотке (Р) . *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001 — по сравнению с контролем (в пресной воде) .
Обсуждение результатов исследования
Неполовозрелые особи севрюги адаптируются к морской воде после перевода их из пресной воды в результате перехода на гипоосмотический тип регуляции и тем самым обеспечивают относительное постоянство осмолярности сыворотки крови при смене
солености среды обитания . Все звенья анализируемой оси взаимосвязанных органов, играющих существенную роль в данном процессе, демонстрировали морфофункциональные изменения в ответ на солевое воздействие
Так же, как у костистых [33], в ответ на солевое воздействие наблюдается реакция клеток преоптического ядра. Через 1 ч опыта происходит выведение из перикарионов в аксоны нейросекреторных гранул, которое фиксировалось по локализации нейрофи-зина — белка-носителя гормонов . Аналогичная реакция на солевое воздействие была отмечена для Ленского осетра Acipenser baerii Br. , но уже при определении локализации гормона аргинин-вазотоцина [21] . АКТГ-ИП клетки, выявленные ранее в туберальном ядре гипоталамуса [15], также изменяют свою структуру в связи с выходом АКТГ-ИП гранул в аксоны клеток в течение первого часа солевого воздействия. Нейрофизин-ИП и АКТГ-ИП гранулы обнаруживаются в области median eminence, что свидетельствует о транспорте этих гранул в область аксо-вазальных контактов и дальнейшего их выхода в кровяное русло . АКТГ-ИП клетки проаденогипофиза, находящиеся под контролем гипо-таламических гормонов, ответили проявлением экскреторной активности также в течение первого часа опыта
Клетки интерреналовой железы, функция которых стимулируется со стороны АКТГ, в течение этого периода показывают признаки усиления синтеза стероидных гормонов . Через 24 ч солевого воздействия проявляется достоверное уменьшение размеров клеток, что можно связать с процессом выведения гормонов из железы, и происходит снижение объема ядер, что является показателем снижения синтетической активности клеток [23]. К концу опыта (через 9 суток) железа возвращается в умеренно-активное состояние, наблюдаемое в контроле (в пресной воде) несмотря на достоверные изменения параметров клеток, которые дают основание полагать о выведении гормонов из железы в кровь, достоверного изменения в содержании кортизола в крови обнаружено не было . Это может свидетельствовать о том, что у эвригалинной севрюги происходят сбалансированные процессы выведения гормона из железы и потребления его органами-мишенями .
Достоверное увеличение кортизола в крови происходит при адаптации к морской воде менее эвригалинных видов осетровых — у пресноводной стерляди, которая приспосабливается к гиперосмотической среде как осмокомформер, и у ленского осетра, обладающего ограниченными осморегуляторными способностями [37]. О том, что кортизол включился в осморегуляторный процесс, показывает повышение активности транспортного фермента Na+/K+ АТФазы в жабрах в 13 раз . Повышение активности этого фермента сопряжено с переходом хлоридных клеток в экскреторное состояние и выведением избытка одновалентных ионов из организма против концентрационного градиента, требующего затрат энергии
О переходе хлоридных клеток в экскреторное состояние показали и их ультра-структурные изменения
Функциональная роль почки у рыб в морской воде существенно меняется в связи с необходимостью сохранения свободной воды в организме и выведения избытка двухвалентных ионов Mg2+ и Ca2+ . Вместе с тем у диадромных солоноватоводных осетровых, к которым относится и севрюга, почка играет важную роль в выведении избытка Na+ в отличие от костистых, у которых почка почти не участвует в регуляции этого иона. У севрюги в морской среде уменьшаются размеры гломерул, сокращается клубочковая фильтрация, в канальцах происходит сорбция воды, уменьшается уровень диуреза . Известно, что у костистых сорбция Mg2+ и Ca2+ во втором проксимальном сегменте, происходящая у рыб
в пресной воде, сменяется на экскрецию этих ионов при переходе рыб в гиперосмотиче-скую среду [31]. У севрюги также выявлена активная магний-секретирующая функция почки, в отличие от пресноводных и других солоноватоводных, но менее эвригалинных, чем севрюга, видов осетровых [38]. В связи с магний-экскретирующей функцией почки у севрюги в нефроне выявляется второй проксималатный сегмент [3], ответственный за магниевую секрецию [31] . У рыб в морской воде в связи с сокращением сорбционных процессов, требующих затрат энергии, активность транспортного фермента Na+/K+ATФазы в почке сокращается в 10 раз
Tаким образом, при переводе эвригалинной севрюги из пресной воды в гиперосмо-тическую среду (искусственную морскую воду) органы нейроэндокринной и эндокринной систем реагируют в течение короткого времени (1-24 ч) на изменения солености среды, «запуская» механизмы эффекторных органов на выполнение гипоосмотической регуляции, что обеспечивает поддержание относительного постоянства осмолярности сыворотки крови рыб в новых условиях Можно прийти к заключению, что функционирование анализируемого комплекса органов, ответственного за адаптацию рыб к морской воде, у осетровых принципиально не отличается от костистых .
литература
I. БахтееваВ. Т., Наточин Ю. В. Методы исследования водно-солевого обмена и функции почек рыб // Tиповые методики исследования продуктивности видов рыб в пределах их ареалов . Ч . II . Вильнюс; Москва, 1976 . с . 110-122 .
2 . Бруевич С. В. Гидрохимия среднего и южного ^спи^кого моря. М. ; Л. , 1937. 350 с .
3 . Герасимов А. А. Особенности морфологии и ионорегулирующей функции почки у осетровых различных экологических групп // Осетровые на рубеже XXI века: Tез . докл . междунар . конф . (Астрахань 11-15 сент. , 2000) . с .133 .
4 . Гербильский Н. Л. специфика и задачи экологической гистофизиологии как одного из направлений гистологических исследований // Архив анат. , гистол . и эмбриологии . 1967. T. 33, № 2 . с . 14-21.
5 . Гербильский Н. Л. Изучение функциональных основ внутривидовой эволюции в связи с проблемой численности и ареала в рыбном хозяйстве // Вестн. Ленингр . ун-та. сер . 3 . 1967. Вып. 3, № 15 . с . 5-21.
6 . Kfаюшкина (Чусовитина) Л. С. Развитие эвригалинности на ранних этапах онтогенеза у осетра различных видов и экологических форм // Осетровые сссР и их воспроизводство . М. , 1967. T. 1. с 181-195
7 . Kgаюшкина Л. С. Функциональная морфология хлоридсекретирующих клеток у рыб в связи с их эколого-гистофизиологическим значением // Обмен веществ и биохимия рыб / под ред . Г с . ^р-зинкина. М. , 1967. с . 65-73 .
8 . Kgаюшкина Л. С. Особенность осмотической и ионной регуляции у проходных морских осетров — коротконосого Acipenser brevirostrum LeSueur и острорылого Acipenser oxyrhynchus Mitchill (Acipenseridae) // Вопр . ихтиол . 1998 . T. 38, № 5 . с . 684-692.
9 . Kgаюшкина Л. С. Эволюционные аспекты осмотической и ионной регуляции у осетровых (Acipenseridae) // сб . науч. трудов Гос НИОРХ . 2007. Вып. 337. с . 361-374.
10 . Ераюшкина Л. С., ВасильеваЕ. В. Изменение ультраструктуры хлоридных клеток осетра при адаптации к гипертонической среде // Архив анат. , гистол. и эмбриологии. 1975 . T. 68, № 6 . с . 11-16 .
II. Kgаюшкина Л. С., Моисеенко С. Н. Гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система экологически различных форм осетровых при адаптации к гипертонической среде // Вопросы нейроэндокринологии. Л. , 1983 . с . 93-103 .
12 . Kfаюшкина Л. С., Семенова О. Г. Осмотическая и ионная регуляция у различных видов осетровых (Acipenseriformes, Acipenseridae) // Вопр . ихтиол . 2006 . T. 46, № 1. с . 113-124 .
13 . Kgаюшкина Л. С., Kuселева С. Г., Моисеенко С. Н. Функциональные изменения щитовидной железы и хлоридных клеток жабр в процессе адаптации молоди белуги Huso huso (L ) к гипертонической среде // Вопр . ихтиологии. 1976 . T. 16 . Вып. 5(100) . с . 923-929 .
14 . Краюшкина Л. С., Моисеенко С. Н., Буковская О. С., Голубчикова В. И. Гистофизиологический анализ адаптации экологически различных видов осетровых к гипертонической среде // Архив анат. , гистол . и эмбриологии . 1977. Т. 73, № 9 . С . 62-69 .
15 . Краюшкина Л. С., Петтер Х., Науманн В., Семенова О. Г. Развитие осморегуляторной функции в онтогенезе севрюги Acipenser stellatus Pallas и возможное участие иммунореактивного АКТГ гипоталамуса в адаптации осетровых к морской среде // Сб . науч . трудов ГосНИОРХ . 1989. Вып . 303 . С . 140-151.
16 . Краюшкина Л. С., Касснер Ю., Семенова О. Г., Огожалек А. Изменение секреторной активности АКТГ-иммунопозитивных клеток проаденогипофиза севрюги Acipenser stellatus Pallas в процессе адаптации к морской воде // ДАН . 2009 . Т. 424, № 2 . С . 273-275 .
17 . Моисеенко С. Н. Изменение состояния гипоталамо-гипофизарной системы молоди белуги при адаптации ее к гипертонической среде // Экологическая физиология рыб . Ч. 2 . Тез . докл . Киев, 1976. С . 24 .
18 . Поленов А. Л., Константинова М. С., Гарлов П. Е. Гипоталамо-гипофизарный нейроэндокринный комплекс // Нейроэндокринология / под ред . А . Л. Поленова . Книга первая . Ч. I . СПб . , 1993 . С.139-187.
19 . Ромейс Б. Микроскопическая техника. М. , 1953 . 718 с .
20 Саенко И. И. Исследование нейрофизина в гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе молоди сибирского осетра Acipenser baeri на свето- и электронно-микроскопическом уровнях // Цитология. 1989 . Т. 31, № 8 . С . 905-913 .
21. Семенова О. Г., Каснер Ю., Огожалек А. Иммуноцитохимическое выявление локализации аргинин-вазотоцина в преоптическом ядре осетровых // Эндокринология — 2005: Тез . докл . VII Всерос . конф . (С . -Петербург, 19-21 апреля 2005) . СПб . , 2005 . С . 159-160.
22 . Чусовитина (Краюшкина) Л. С. О ранней эвригалинности осетровых и адаптивной функции хлоридсекретирующих клеток в их жабрах // Докл . АН СССР. 1963 . Т. 151, № 2 . С . 441-442.
23 . Хесин Я. Е. Размеры ядер и функциональное состояние клеток . М. , 1967. 423 с .
24 . Яковлева И. В., Комачкова З. К. Гипофиз и щитовидная железа у осетровых при содержании рыб в воде различной солености // ДАН СССР. 1969 . Т. 186, № 2 . С . 481-482 .
25 . Bentley P. G. Hormones and osmoregulation // Comparative vertebrate endocrinology . 3rd . ed. Cambridge (UK), 1998 . 526 p .
26 . Carlemalm E., GaravitoR. M., Villiger W. Resin development for electron microscopy and an analysis of embedding at low temperature // J . Microsc . 1982. Vol . 126 . P. 123-143 .
27 . Costa J. L., Bui S., Reed P., Dores R. M., Brennan M. B., Hochgeschwender U. Mutational analysis of evolutionarily conserved ACTH residues // Gen. Comp . Endocrinol. 2004. Vol. 136 . P. 12-16 .
28 . Filippa V., Mohamed F. ACTH cells of pituitary pars distalis of viscacha (Lagostomus maximus maximus): immunohistochemical study in relation to season, sex, and growth // Gen . Comp . Endocrinol . 2006. Vol. 146 . P. 217-225 .
29 . Henderson I. W., Chan D. K.O., Sandor T., Chester Jones I. The adrenal cortex and osmoregulation in teleosts // Mem. Soc . Endocrinol. 1971. Vol. 18 . P. 31-55 .
30 . Henderson I. W., Chester Jones I. Action of hormones on osmoregulatory system of fish // Forschr. Zool . 1974 . Bd 22, Ht. 2-3 . S . 391-418 .
31. Hickman C. P. J., Trump B. F. The kidney // Fish Physiology / еd . by W. S . Hoar, D . T. Randal . New York, 1969 . Vol . 1. P. 99-329 .
32 . Hirano T., Mayer-Gostan N. Endocrine control of osmoregulation in fish // Comparative endocrinology Amsterdam; New York; Oxford, 1978 . P. 209-212 .
33 . JasinskiA., Gorbman A., HaraR. J. Activation of the preoptico-hypophysial neurosecretory system through olfactory afferents in fishes // Neurosecretion / ed. by F. Stritinsky. New York, 1967. P. 100-123 .
34 . Johnson D. W. Endocrine control of hydromineral balance in teleosts // Am . Zool . 1973 . Vol . 13, N 3 . P. 799-818 .
35 . Karnaky K. J. Jr., Kinter L. B., Kinter W. B., Stirling S. E. Teleost chloride cell . II . Auto-radiographic localization of gill Na+, K+-ATPase in killifish (Fundulus heteroclitus) adapted to low and high salinity environments // J. Cell Biol . 1976. Vol . 70 . P. 157-177.
36 . KrayushkinaL. S. Considerations on evolutionary mechanisms of osmotic and ionic regulation in Acipenseridae: an overview // Appl . Ichthyol . (ISSN 0175-8659) . 2006 . Vol . 22, N 1 (Suppl .) . P. 70-77.
37 . Krayushkina L. S., Semenova O. G., Vyushina A. V Level of serum cortisol and Na+/K+ ATPase activity of gills and kidneys in different acipenserids // Appl . Ichthyol. (ISSN 0175-8659) . 2006 . Vol. 22, N 1(Suppl. ). P. 182-187.
38 . Krayushkina L. S., Fleishman D. G., Semenova O. G., Terekhin M. N. Excretion and reabsorption of cations and water in kidney of different sturgeon species during adaptation to sea water // Comp . Biochem . Physiol . 2003 . Vol . 134 A, N 3 (Suppl . ) . P. S85-S86 .
39 . Langdon J. S., Thorpe J. E., Roberts R. J. Effects of cortisol and ACTH on gill Na+/ K+ ATPase, SDH and chloride cells in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar L . ) // Comp . Biochem. Physiol . 1984 . Vol. 77A . P. 9-12 .
40 . Lankford S. E., Adams B. M., Adams T. T., Cech J. J. Using specific antisera to neutralize ACTH in sturgeon: a method for manipulating the interrenal response during stress // Gen . Comp . Endocrinol . 2006. Vol. 147. P. 384-390 .
41. Mancera J. M., Fernandes-Llebrez P., Grondona J. M., Perez-Figares J. M. Influence of environmental salinity on prolactin and corticotropic cells in the gilthead sea bream (Sparus aurata L . ) // Gen . Comp . Endocrinol . 1993 . Vol. 90, N 2 . P. 220-231.
42 . Mayer N., Maerz J., Chan D. K.O., Forster M., Chester Jones I. Cortisol, a sodium excreting factor in the eel (Anguilla anguilla L . ) adapted to sea-water // Nature. Lond. 1967. Vol. 214. P. 1118-1120 .
43 . Olivereau M., Ball J. N. Pituitary influence on osmoregulation in teleosts // Hormones and the environment. Mem . Soc . Endocrinol . Cambridge, 1970 . P. 57-85 .
44 . Olivereau M., Olivereau J.-M., Lambert J.-F. Cytological responses of the pituitary (rostral pars distalis) and immunoreactive corticotrophin-releasing factor (CRF) in the goldfish treated with dopamine antagonist // Gen Comp . Endocrinol. 1988 . Vol. 71. P. 506-515 .
45 . dickeringB., Fones C., Sewann R., Heap P., Morris I. The role of neurophysin proteins // Ann . Acad. Sci. N. Y. 1975 . Vol . 248 . P. 15-34 .
46 . Roth J., Bendayan M., Orci L. Ultrastrucrural localization of intercellular antigens by the use of prolactin A-gold complex // J. Histochem. Cytochem. 1978. Vol . 26 . P. 1074-1081.
47 . Semenkova T., Barannikova I., Kime D. E., McAllister B. G., Bayunova L., Dyubin V., Kolmakov N. Sex steroid profiles in female and male stellate sturgeon (Acipenser stellatus Pallas) during final maturation induced by hormonal treatment // J . Appl . Ichthyol . 2002. Vol . 18 . P. 375-381.
48 . Sternberger L. A., Hardy P. H., Cuculis J. J., Meyer H. G. The unlabeled antibody enzyme method by immunohistochemistry: Preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase-antiperxidase) and its use in identification of spirochetes // J . Histochem . Cytochem . 1970 . Vol . 18 . P. 315-333 .
49 . Warne J. The role of arginine vasotocin in teleost fish osmoregulation // Osmoregulation and drinking in vertebrates / ed. by N. Hazon, G. Flik. Oxford, 2002. P. 83-95 .
50 . Warne J. M., Balment R. J. Effect of acute manipulation of blood volume and osmolality on plasma [AVT] in seawater flounder // Am. J. Physiol. 1995 . Vol. 269. P. R1107-R1112 .
51. Wendelaar Bonga S. E. Endocrinology // Physiology of Fish / ed. by D . H . Evans . London; Tokyo, 1993 . P. 469-502 .
52 . Zaugg W. S. A simplified preparation for ATPase determination in gill // Can . J. Fish . Aquat. Sci . 1982 . Vol . 39 . P. 215-217.
